冠心病患者血清心肌肌鈣蛋白I自身抗體檢測(cè)的意義

張金花，張葵，魏紅霞，邱方

(1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京 210008；2.東南大學(xué)生命科學(xué)研究院，南京 210096)

·研究生園地·

冠心病患者血清心肌肌鈣蛋白I自身抗體檢測(cè)的意義

張金花1，張葵1，魏紅霞1，邱方2

(1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京 210008；2.東南大學(xué)生命科學(xué)研究院，南京 210096)

目的 觀察冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(CHD)患者血清心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)自身抗體的陽(yáng)性率和臨床意義。方法 病例對(duì)照研究。收集2015年9月至2016年5月南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院心內(nèi)科CHD患者200例和健康體檢者200例，用間接ELISA法檢測(cè)抗cTnI自身抗體(anti- cardiac troponin I antibodies，anti-cTnI)，并分析其一般資料、相關(guān)臨床生化指標(biāo)和冠脈血管病變情況。結(jié)果 CHD患者anti-cTnI陽(yáng)性率10.5%(21/200)，健康體檢者陽(yáng)性率為2.0%(4/200)，CHD患者高于健康體檢者(P<0.01);根據(jù)抗體檢測(cè)結(jié)果將研究對(duì)象分為冠心病患者抗體陽(yáng)性組,冠心病患者抗體陰性組和健康對(duì)照者抗體陽(yáng)性組。冠心病患者抗體陽(yáng)性組中位年齡、Glu水平高于健康對(duì)照者抗體陽(yáng)性組(P均<0.05)，HDL-C、apoAⅠ水平低于健康對(duì)照者抗體陽(yáng)性組(P均<0.01);CHD患者抗體陽(yáng)性組中位年齡與Gensini評(píng)分高于抗體陰性組，而HDL-C水平低于抗體陰性者(P均<0.05)。結(jié)論 Anti-cTnI更可能出現(xiàn)在年齡較高且冠脈狹窄病變較嚴(yán)重的冠心病患者中，血清低HDL-C和apoAⅠ水平可能與anti-cTnI產(chǎn)生有關(guān)。

冠心病；抗心肌肌鈣蛋白自身抗體；自身免疫；Gensini評(píng)分

動(dòng)脈粥樣硬化實(shí)質(zhì)上是一種多因素免疫介導(dǎo)的動(dòng)脈壁的慢性炎癥過(guò)程，自身免疫反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1-3]?？筩TnI自身抗體(anti- cardiac troponin I antibodies，anti-cTnI)已被報(bào)道在擴(kuò)張型心肌病、心肌炎、缺血性心肌病、肥厚型心肌病、心肌梗死等患者及極少數(shù)健康人群中檢出[4]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)anti-cTnI的研究較少。本研究旨在觀察冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CHD)患者anti-cTnI檢出情況，并探討其與患者相關(guān)臨床生化指標(biāo)和冠狀動(dòng)脈血管病變情況的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 2015年9月至2016年5月南京市鼓樓醫(yī)院CHD確診患者200例，其中男148例，女52例，年齡27～96歲，中位年齡57歲，CHD診斷依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)《2007年冠心病診斷與治療指南》。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果，證實(shí)存在主要管腔狹窄的直徑≥70%或至少有一支冠狀動(dòng)脈管腔狹窄直徑≥50%；(2)有血管形成術(shù)的病史；(3)有冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)病史。具備以上任何一條即可納入病例組。對(duì)患有自身免疫性疾病，肝腎疾病，血液系統(tǒng)疾病，惡性腫瘤及近期有手術(shù)、外傷和感染的患者予以排除。選擇同期南京市鼓樓醫(yī)院體檢健康者200例為健康人對(duì)照組，其中男94例，女106例，年齡17～79歲，中位年齡42歲。本研究經(jīng)南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均知情同意。

1.2 標(biāo)本采集與處理 CHD患者入院后6～24 h采集空腹靜脈血3 mL，3 000 r/min離心5 min，2 h內(nèi)完成臨床生化指標(biāo)檢測(cè)。收集血清于2 mL EP管中，-80 ℃保存以待檢測(cè)anti-cTnI，避免反復(fù)凍溶。

1.3 儀器和試劑 AU5421全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)；三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、葡萄糖(Glu)試劑購(gòu)自日本第一化學(xué)藥品株式會(huì)社試劑診斷公司；載脂蛋白AⅠ(apoAⅠ)、載脂蛋白B(apoB)檢測(cè)試劑購(gòu)自寧波美康公司；3%小牛血清清蛋白(BSA)(上海麥約爾公司)，明膠(加拿大Sigma-Aldrich公司)，重組人cTnI蛋白(東南大學(xué)生命科學(xué)研究院贈(zèng)予)，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗人IgG、IgM和IgA二抗(德國(guó)Merck公司)，四甲基聯(lián)苯胺(TMB,上?？迫A公司)，蛋白質(zhì)Marker(日本Takara公司)，十二烷基硫酸鈉、苯烯酰胺、TEMED(美國(guó)Sigma公司)，Tris-HC1、過(guò)硫酸銨(上海生工公司)，電泳儀、Ecl化學(xué)發(fā)光試劑盒、凝膠成像系統(tǒng)(上海天能公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.4 生化指標(biāo)檢測(cè) TG用甘油磷酸氧化酶-過(guò)氧化物酶(GPO-PAP)法測(cè)定，TC用酶法測(cè)定，HDL-C、LDL-C用化學(xué)修飾酶法測(cè)定，apoAⅠ、apoB用免疫透射比濁法測(cè)定；Glu用葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶(GOD-POD)法測(cè)定；anti-cTnI用間接ELISA法檢測(cè)。

1.6 Western blot法驗(yàn)證anti-cTnI 配置12 g/L分離膠注入膠板內(nèi)，凝固1 h，再配置5 g/L濃縮膠，將膠板固定于電泳槽，注入電泳緩沖液，將煮沸過(guò)的樣品以每孔10 μL注入加樣孔，80 V恒壓30 min濃縮樣品，待樣品進(jìn)入分離膠后改為120 V恒壓1 h。將標(biāo)準(zhǔn)抗原cTnI經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后用Bio-Rad電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用0.05 g/mL BSA于37 ℃溫育2 h，封閉后用PBST溶液洗滌3次，每次5 min。分別同時(shí)置于患者和健康對(duì)照者血清(1∶3 000稀釋)中，4 ℃過(guò)夜，同樣方法洗滌后，用HRP標(biāo)記的羊抗人IgG、IgM和IgA二抗(1∶10 000稀釋)37 ℃溫育1 h，洗滌后在PVDF膜上滴加Ecl化學(xué)發(fā)光試劑顯影并拍照記錄。

1.7 Gensini法計(jì)算積分值 根據(jù)狹窄程度評(píng)估積分[5]：≤25%狹窄計(jì)1分；26%～50%狹窄計(jì)2分；51%～75%狹窄計(jì)4分；76%～90%狹窄計(jì)8分；91%～99%狹窄計(jì)16分；100%狹窄(全閉)計(jì)32分。根據(jù)病變部位不同，計(jì)算單處病變積分與系數(shù)乘積：左主干病變×5；左前降支或回旋支近段×2.5；左前降支中段×1.5；左前降支遠(yuǎn)段、左回旋支中段、左回旋支遠(yuǎn)段、右冠狀動(dòng)脈×1.0，小分支×0.5。各處積分求和，為每位患者的Gensini總積分。

2 結(jié)果

2.1 Anti-cTnI檢測(cè)結(jié)果 SDS-PAGE電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，對(duì)ELISA檢測(cè)高出cut-off值的血清用western blot方法確認(rèn)后證實(shí)均為anti-cTnI抗體陽(yáng)性。

2.2 Anti-cTnI陽(yáng)性組生化指標(biāo)結(jié)果 見(jiàn)表1。CHD患者中anti-cTnI陽(yáng)性率10.5%(21/200)，健康體檢者中陽(yáng)性率2.0%(4/200)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。按抗體檢測(cè)結(jié)果將研究對(duì)象分為冠心病患者抗體陽(yáng)性組、冠心病患者抗體陰性組和健康對(duì)照者抗體陽(yáng)性組。冠心病患者抗體陽(yáng)性組中位年齡和Glu水平高于健康對(duì)照者抗體陽(yáng)性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而HDL-C、apoAⅠ水平低于健康對(duì)照者抗體陽(yáng)性組(P<0.05)。

2.3 冠心病患者抗體陽(yáng)性組與陰性組血管病變情況(血管病變支數(shù)、Gensini評(píng)分) CHD患者中，抗體陽(yáng)性組中位年齡與Gensini評(píng)分高于抗體陰性組，而HDL-C水平低于抗體陰性組(P<0.05)。冠心病患者抗體陽(yáng)性組血管多支病變(三支或三支以上主要血管)百分率低于陰性組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

注：M,蛋白Marker。

圖1 SDS-PAGE結(jié)果

3 討論

Anti-cTnI最早由Shmilovich等[6]于2007年報(bào)道，存在于約16%的擴(kuò)張型心肌病患者和18%的局部缺血性心肌病患者血清中，但健康個(gè)體中未發(fā)現(xiàn)。本研究檢測(cè)了200例健康體檢者，發(fā)現(xiàn)了4例自身抗體陽(yáng)性，陽(yáng)性率與Carbone等[7]報(bào)道相同。與健康體檢者相比，CHD患者陽(yáng)性率(10.5%)升高。Fan等[8]對(duì)491例ST段抬高型心肌梗死患者研究發(fā)現(xiàn)，anti-cTnI陽(yáng)性率為19.1%(94/491)，且左心室重塑范圍與抗體陽(yáng)性率相關(guān)，anti-cTnI陽(yáng)性患者左心室擴(kuò)張程度和心室收縮功能減退程度更明顯。

本研究中，冠心病患者抗體陽(yáng)性組中位年齡高于健康對(duì)照者抗體陽(yáng)性組(P<0.01)。apoAⅠ是HDL-C的主要載脂蛋白，HDL-C參與膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)，將外周組織多余的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟代謝，減少外周血管壁脂質(zhì)蓄積，維持脂質(zhì)代謝平衡，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照者抗體陽(yáng)性組相比，冠心病患者抗體陽(yáng)性組HDL-C和apoAⅠ水平降低，Glu水平增高，提示anti-cTnI參與冠狀動(dòng)脈綜合征病程。冠脈狹窄性病變導(dǎo)致心肌缺血損傷，使cTnI暴露于循環(huán)系統(tǒng)，引發(fā)自身免疫發(fā)生，產(chǎn)生抗心肌細(xì)胞自身成分的抗體。本研究進(jìn)一步分析血清anti-cTnI與Gensini評(píng)分的相關(guān)關(guān)系發(fā)現(xiàn)，冠心病患者中抗體陽(yáng)性組Gensini評(píng)分高于抗體陰性組(P<0.05)。Gensini評(píng)分是對(duì)冠狀動(dòng)脈病變程度評(píng)估的經(jīng)典方法[5]，冠狀動(dòng)脈病變?cè)絿?yán)重，Gensini評(píng)分越高;表明冠心病患者血清anti-cTnI可能有助于冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的評(píng)估。心肌梗死恢復(fù)期血清肌鈣蛋白水平仍然升高[10]，心肌損傷后釋放的cTnI與cTnC結(jié)合成cTnI-cTnC復(fù)合物持續(xù)存在于循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)可能是anti-cTnI形成的一個(gè)重要原因，而抗體滴度是否與肌鈣蛋白水平成正比還有待研究。

目前尚無(wú)檢測(cè)anti-cTnI的金標(biāo)準(zhǔn),一些研究用免疫分析技術(shù)檢測(cè)anti-cTnI。Adamczyk等[11]用化學(xué)發(fā)光acridinium-9酰胺抗人抗體包被化學(xué)發(fā)光微孔板，檢測(cè)與cTnI高親和力結(jié)合的IgG抗體，另一些學(xué)者用ELISA法[12]，不同方法在檢測(cè)anti-cTnI的敏感性和特異性方面具有很大差異。有研究表明，檢測(cè)急性冠脈綜合征患者血清anti-cTnI滴度，發(fā)現(xiàn)肌鈣蛋白抗體能干擾cTnI的免疫測(cè)量[13]。Anti-cTnI是否會(huì)對(duì)心肌造成更進(jìn)一步的損傷，其產(chǎn)生與持續(xù)存在的原因及機(jī)制尚不明確，其可能的臨床和診斷意義也需要進(jìn)一步的探索。

[1]Campbell KA, Lipinski MJ, Doran AC,etal. Lymphocytes and the adventitial immune response in atherosclerosis [J]. Circ Res, 2012, 110(6): 889-900.

[2]Sasaki N, Yamashita T, Kasahara K,etal. Regulatory T cells and tolerogenic dendritic cells as critical immune modulators in atherogenesis [J]. Curr Pharm Des, 2015, 21(9): 1107-1117.

[3]馮曉琳，張楠，汪俊軍.血清補(bǔ)體C1q及其抗體檢測(cè)的臨床意義研究進(jìn)展[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2016,34(4)：287-289.

[4]Tom J, Natkunam K, Ryan G,etal. Anti-troponin antibodies following myocardial infarction [J]. J Cardial, 2016, online: 1-8.

[5]Gensini GG. A more meaningful scoring system for determining the severity of coronary heart disease [J]. Am J Cardiol, 1983, 51(3) :606.

[6]Shmilovich H, Danon A, Binah O,etal. Autoantibodies to cardiac troponin I in patients with idiopathic dilated and ischemic cardiomyopathy [J]. Int J Cardiol, 2007, 117(2): 198-203.

[7]Carbone F, Nencioni A, Mach F,etal. Evidence on the pathogenic role of auto-antibodies in acute cardiovascular disease [J]. Thromb Haemost, 2013, 109(5): 854-868.

[8]Fan Y, Chen YW, Wan ZF,etal. The prognostic value of autoantibodies against β1-adrenoceptor and cardiac troponin-I for clinical outcomes in STEMI [J]. J Cardiovasc Med (Hagerstown), 2017,18(1): 34-41.

[9]Tsompanidi EM, Brinkmeier MS, Fotiadou EH,etal. HDL biogensis and functions:role of HDL quality and quantity in atherosclerosis [J]. Atherosclerosis, 2010, 208(1): 3-9.

[10]Hera M，Sakata Y, Nakatani D,etal. Subclinical elevation of high-sensitive troponin T levels at the convalescent stage is associated with increased 5-year mortality after ST-elevation myocardial infarction [J]. J Cardiol, 2016, 67(4): 314-320.

[11]Adamczyk M, Brashear RJ, Matttingly PG. Circulating cardiac troponin-I autoantibodies in human plasma and serum [J]. Annals of the New York Academy Sciences, 2009, 1173: 67-74.

[12]Kaya Z, Katus HA, Rose NR. Cardiac troponins and autoimmunity:their role in the pathogenesis of myocarditis and of heart failure [J]. Clin Immunol, 2010, 134(1): 80-88.

[13]Tanja S, Emilia E, Janne E,etal. Troponin specific autoantibody interference in different cardiac troponin I assay configurations[J] . Clin Chem, 2012, 58(6): 1040-1048.

(本文編輯：王海燕)

Clinical significance of the detection of serum cardiac troponin I autoantibodies in the patients with coronary atherosclerotic heart disease

ZHANGJin-hua1,ZHANGKui1,WEIHong-xia1,QIUFang2

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,theAffiliatedDrumTowerHospitalofNanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing210008,Jiangsu; 2.InstituteofLifeSciences,SoutheastUniversity,Nanjing210096,Jiangsu,China)

Objective To observe the positive rate of serum anti-cardiac troponin I autoantibodies (anti-cTnI) in the patients with coronary atherosclerotic heart disease(CHD) and its clinical significance. Methods A total of 200 CHD patients and 200 healthy controls from the Department of Cardiology, Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School during September 2015 and May 2016 were collected in the case-control study. Serum anti-cTnI was detected with an indirect ELISA method. Meanwhile, the general data, clinical biochemical parameters and coronary vascular lesion from the two groups were analyzed. Results The positive rate of anti-cTnI in CHD patients(21/200, 10.5%) was significantly higher than that in healthy controls(4/200, 2.0%,P<0.01). According to the detection results of serum anti-cTnI, the participants were divided into three groups, including anti-cTnI positive group with CHD, anti-cTnI negative group with CHD and anti-cTnI positive group in healthy controls. The median age and serum Glu level in the anti-cTnI positive group with CHD were significantly higher than those in the anti-cTnI positive group in healthy controls (P<0.05), while the levels of serum HDL-C and apoAⅠwere inverse (P<0.01). The median age and Gensini score in the anti-cTnI positive group with CHD were significantly higher than those in the anti-cTnI negative group with CHD, while the level of serum HDL-C was inverse (P<0.05). Conclusion Anti-cTnI may be more likely to occur in old CHD patients with severe coronary artery lesions, and the low levels of serum HDL-C and apoA I may correlate to the production of anti-cTnI.

coronary atherosclerotic heart disease; anti-cardiac troponin I autoantibody; autoimmunity; Gensini score

10.13602/j.cnki.jcls.2017.02.14

張金花，1991年生，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹x與心血管疾病。

張葵，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師，13505151066@163.com。

R446；R54

A

2016-11-24)