馬興生,賀曉英,張曉琦,劉光福,楊國(guó)儒
(濰坊呼吸病醫(yī)院檢驗(yàn)科,山東濰坊 261041)
·臨床檢驗(yàn)技術(shù)研究·
支氣管肺胞灌洗液細(xì)胞學(xué)檢測(cè)方法的改良
馬興生,賀曉英,張曉琦,劉光福,楊國(guó)儒
(濰坊呼吸病醫(yī)院檢驗(yàn)科,山東濰坊 261041)
目的 針對(duì)支氣管肺胞灌洗液(BALF)下標(biāo)本處理過(guò)程中細(xì)胞退化變形問(wèn)題進(jìn)行改良。方法 分別用常規(guī)方法與改良方法(BALF標(biāo)本離心后的沉渣按2∶1比例加入血清或血漿)對(duì)標(biāo)本涂片染色,在相同顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),計(jì)算正常形態(tài)中性粒細(xì)胞的百分率。結(jié)果 兩種涂片方法檢出的正常形態(tài)中性粒細(xì)胞百分率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 改良方法可較好地在室溫下保持BALF標(biāo)本中的細(xì)胞形態(tài),避免細(xì)胞退化。
肺泡灌洗液;細(xì)胞退化;血清;血漿
按照目前的支氣管肺胞灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)操作規(guī)范[1-3]對(duì)標(biāo)本涂片處理,在實(shí)際臨床操作過(guò)程中常遇到細(xì)胞嚴(yán)重退化變形的問(wèn)題。通過(guò)在臨床工作中不斷實(shí)踐與摸索,找到一種在室溫條件下能較好解決細(xì)胞退化變形問(wèn)題的新方法,現(xiàn)介紹如下以供同行交流。
1.1 儀器與試劑 DM2500型光學(xué)顯微鏡(德國(guó)LEICA公司),SC-3610型低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器公司),HYC-310型醫(yī)用冷藏箱(青島海爾特種電器公司),MS3BS25型漩渦振蕩器(德國(guó)IKA公司),病理級(jí)高級(jí)載玻片(南通海倫生物醫(yī)學(xué)器材制造公司),12×100塑料試管(淄博來(lái)緒醫(yī)用器材公司),300目尼龍濾網(wǎng)(昆山鑫泰篩網(wǎng)濾網(wǎng)公司),瑞氏-姬姆薩染色液(珠海貝索生物技術(shù)公司),AB型血清或血漿。
1.2 標(biāo)本采集及制備 2016年6至10月濰坊呼吸病醫(yī)院BALF標(biāo)本20例。每位患者行支氣管鏡檢查時(shí)留取≥5 mL BALF,裝入無(wú)抗凝劑硅塑瓶或涂硅滅菌玻璃容器中(減少細(xì)胞粘附),1 h內(nèi)送檢。
1.3 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 中性粒細(xì)胞形態(tài)變化更明顯并隨保存時(shí)間延長(zhǎng)而正常形態(tài)比例明顯下降[4-5];同樣,在常溫條件下,在計(jì)數(shù)BALF標(biāo)本細(xì)胞分類時(shí),中性粒細(xì)胞退化變形最明顯。因此,選擇以中性粒細(xì)胞的形態(tài)完整性作為衡量涂片質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn),并計(jì)數(shù)正常形態(tài)中性粒細(xì)胞的百分率。正常形態(tài)中性粒細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞形態(tài)完整,胞漿與核清晰。退化形態(tài)中性粒細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞胞漿不完整,核腫脹,甚至裸核或可見(jiàn)胞漿,不能分辨細(xì)胞核的形態(tài)。
1.4 實(shí)驗(yàn)方法 對(duì)同一份BALF標(biāo)本分別采用常規(guī)涂片和改良方法涂片。改良方法是在常規(guī)涂片基礎(chǔ)上加入人血清或血漿。具體操作步驟如下,(1)采集BALF后,盡快送達(dá)實(shí)驗(yàn)室,用300目尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾到塑料試管中;(2)試管迅速以2 000 r/min離心7 min;(3)離心后的標(biāo)本棄去上清,取試管底部沉渣;(4)在漩渦振蕩器上把試管底部沉渣混勻;(5)按標(biāo)本與血清或血漿2∶1的比例加入AB型血清或血漿于管內(nèi),與沉渣充分混勻后涂片;(6)涂片在室溫自然風(fēng)干后,用瑞氏-姬姆薩染色液染色;(7)在油鏡下觀察標(biāo)本,計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞正常形態(tài),以百分率表示。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。由于2組數(shù)據(jù)方差不齊,兩組間比較用兩獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 常規(guī)方法和改良方法涂片鏡檢結(jié)果 見(jiàn)圖1。常規(guī)方法涂片中性粒細(xì)胞退化明顯,背景不清,混雜成分較多。圖1B 按2∶1比例加入AB型血清涂片,中性粒細(xì)胞形態(tài)清晰,漿、核明顯,較少有退化,背景清晰。圖1D 按2∶1比例加入AB型血漿涂片,粒細(xì)胞形態(tài)清晰,漿、核明顯,較少有退化,背景更清晰。
2.2 常規(guī)方法和改良方法正常形態(tài)中性粒細(xì)胞的百分率 改良方法組的中性粒細(xì)胞正常形態(tài)百分率明顯高于常規(guī)方法組。常規(guī)方法組的中性粒細(xì)胞正常細(xì)胞百分率(34.8±16.4)%,改良方法組(87.45±5.57)%,經(jīng)兩獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)比較,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
2.3 其他影響因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響 除采用AB型血清或血漿外,還采用了O型血清或血漿(含抗A、抗B抗體)實(shí)驗(yàn),中性粒細(xì)胞同樣可保持良好的完整性,涂片結(jié)果并不受血型影響。按3∶1比例分別加入各型血清或血漿進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn),顯微鏡下觀察中性粒細(xì)胞仍可保持良好形態(tài),但按1∶1比例加入血清或血漿,涂片染色時(shí)發(fā)現(xiàn)膜極易脫落。
注:A、C為常規(guī)方法涂片;B、D為分別為加入血清、血漿改良處理后的涂片。
圖1 常規(guī)方法和改良方法涂片瑞氏-姬姆薩染色結(jié)果(×1 000)
近幾年針對(duì)BALF細(xì)胞學(xué)檢測(cè)方法的改良較多[6-7]。但在臨床檢驗(yàn)工作中,面臨的細(xì)胞退化問(wèn)題卻無(wú)應(yīng)對(duì)之策。由于細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性受溫度、pH值、抗體等多種因素影響。按目前操作規(guī)范推薦的常規(guī)涂片方法,不能保持細(xì)胞原有形態(tài),從本質(zhì)上分析是由于細(xì)胞離開機(jī)體后,內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變,細(xì)胞出現(xiàn)退化。若能保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,讓離體細(xì)胞所處環(huán)境與機(jī)體內(nèi)盡可能相似,有可能解決細(xì)胞退化問(wèn)題。人血清/血漿是細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)賴以生存的“土壤”,所以加入一定比例的血清或血漿,可起到保持細(xì)胞形態(tài)完整性的作用。
本實(shí)驗(yàn)首先采用AB型血漿或血清,是因?yàn)锳B型血清或血漿中不含有抗A、抗B抗體,盡可能減少血型抗體對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。然后,為驗(yàn)證血型抗體是否對(duì)結(jié)果有影響,采用O型血實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示不管是加入AB型,還是O型血清或血漿,均可避免細(xì)胞退化,保持細(xì)胞形態(tài)完整。從而驗(yàn)證了血型抗體對(duì)結(jié)果沒(méi)有影響。在臨床中可采用各種血型的血清或血漿進(jìn)行實(shí)驗(yàn),取材更加方便。為明確加入血清或血漿的最佳比例,分別按1∶1、2∶1、3∶1比例加入血清或血漿,發(fā)現(xiàn)按2∶1與3∶1比例結(jié)果相似,涂片后視野清晰,細(xì)胞形態(tài)完整,能夠很好的進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。
此改良方法優(yōu)點(diǎn)在于,一方面在室溫下就可完成整個(gè)操作過(guò)程,并不需要規(guī)范要求的4 ℃低溫下進(jìn)行。另一方面易取材、易操作、易推廣、低成本、低消耗、臨床實(shí)踐性強(qiáng)。
[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病分會(huì).支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)規(guī)范(草案)[J].現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué), 2003,15(12):256-257.
[2]Kelch H,Hutter C.Clinical guidelines and indications for bronchoalveolar lavage (BAL): Report of the European Society of Pneumology Task Group on BAL[J]. Eur Respir J, 1990,3(8):937-974.
[3]Klech H,Pohl W.Technical recommendations and guidelines for bronchoalveolar lavage (BAL). Report of the European Society of Pneumology Task Group[J]. Eur Respir J, 1989,2(6):561-585.
[4]黃斌倫. 抗凝靜脈血中白細(xì)胞形態(tài)變化觀察[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué), 2005,20(2):156-157.
[5]尹衛(wèi)東, 李立宏, 郭楨. EDTA鹽抗凝血中白細(xì)胞形態(tài)的變化[J]. 張家口醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 1999,16(4):12.
[6]唐金鳳, 肖九長(zhǎng), 林霖, 等. 改良涂片法和瑞氏-姬姆薩染色法對(duì)支氣管肺泡灌洗液及痰嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)的比較[J]. 黑龍江醫(yī)學(xué), 2014,13(8):901-902.
[7]徐佳, 黃媛, 吳衛(wèi), 等. 改良支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞分類計(jì)數(shù)制片及染色法[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志, 2014,32(2):98-101.
(本文編輯:王海燕)
10.13602/j.cnki.jcls.2017.02.06
馬興生,1965年生,男,主管技師,主要從事臨床檢驗(yàn)工作。
楊國(guó)儒,主任醫(yī)師,E-mail:yangguoru@163.com。
R446
A
2016-12-08)