陜產(chǎn)鐵棒錘不同生長期不同器官中3種酯型生物堿的含量測定

楊長花 楊文娟 王西芳 崔立坤

·論著·

陜產(chǎn)鐵棒錘不同生長期不同器官中3種酯型生物堿的含量測定

楊長花 楊文娟 王西芳 崔立坤

目的 對陜產(chǎn)鐵棒錘不同生長期不同器官中烏頭堿、次烏頭堿及中烏頭堿進行含量測定，探討化學成分的動態(tài)變化，為資源開發(fā)及合理使用提供參考。 方法 色譜柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：A：乙腈-四氫呋喃(25：15)，B：0.1 mol/L醋酸銨溶液(每1000 mL加冰乙酸0.5 mL)；流速：1.0 mL/min；梯度洗脫：檢測波長為235 nm；溫度25℃。 結(jié)果 鐵棒錘不同生長期、不同器官中酯型生物堿含量均較高，不同器官中酯型生物堿的含量差異較大；塊根在果期酯型生物堿的含量最高，莖在花前期酯型生物堿的含量最高，葉在花期酯型生物堿的含量最高；烏頭堿在植物體內(nèi)的含量呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，花前期烏頭堿的含量最高；次烏頭堿在植物體內(nèi)的含量呈現(xiàn)S變化趨勢，苗期和花期的含量最高；中烏頭堿在植物體內(nèi)的含量呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，花前期中烏頭堿含量最高。 結(jié)論 鐵棒錘不同生長期、不同器官酯型生物堿的含量遠大于川烏的限量標準，且資源優(yōu)質(zhì)，具有較高的藥用價值，本研究為陜產(chǎn)鐵棒錘合理使用、資源開發(fā)及質(zhì)量評價提供理論依據(jù)。

鐵棒錘； 不同器官； 不同生長期； 動態(tài)變化

鐵棒錘來源于毛茛科烏頭屬植物鐵棒錘A.pendulumBusch和伏毛鐵棒錘A.flavumHand-Mazz，藥用部位為塊根及幼苗[1]。鐵棒錘塊根能祛風止痛、散瘀止血、消腫拔毒，用于治療風濕關(guān)節(jié)痛、腰腿痛、跌打損傷；外用治淋巴結(jié)結(jié)核(未破)、癰瘡腫毒[2]；幼苗具有解毒、消腫止痛的功效，用于治療跌打損傷、刀傷、癰腫、瘡癤[1]。主要產(chǎn)地：陜西南部、西藏、云南西北部、四川西部、青海、甘肅南部及河南西部[3]。烏頭類生物堿是鐵棒錘的有效成分，毒性成分主要為二萜雙酯型生物堿[4-5]，品種分為烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿等[6]。陜產(chǎn)鐵棒錘主要分布于秦嶺地區(qū)，當?shù)剞r(nóng)民一直以采挖野生資源入藥，資源日趨枯竭，資源優(yōu)化是解決這一問題的有效途徑。國內(nèi)對鐵棒錘研究主要集中在塊根的化學成分上[7-9]，而對地上部分( 莖、葉、花、果實) 的雙酯型生物堿研究較少。本研究采用高效液相色譜法測定鐵棒錘不同生長期、不同藥用部位的烏頭堿、次烏頭堿及中烏頭堿含量，旨在認識生物堿積累與植物生長發(fā)育之間的積累變化動態(tài)，為合理使用、資源開發(fā)、質(zhì)量控制、安全用藥、人工栽培提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗儀器

高效液相色譜儀(品牌：Waters，型號：E2695，2489紫外檢測器)；TE124S分析天平(萬分之一，Sartorius公司)；CP225D電子分析天平(十萬分之一，Sartorius公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)；KH5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限責任公司)；FW-100D高速萬能粉碎機(天津鑫博得儀器有限責任公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 實驗藥品

烏頭堿對照品、次烏頭堿對照品、新烏頭堿對照品(中國藥品生物制品檢定研究所，批號：110446-201507、10096-201504、10478-201412)、乙腈、四氫呋喃、甲醇、乙酸銨、冰乙酸、異丙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、氨水，其中乙腈和四氫呋喃為色譜純，其余為分析純，水為純化水。鐵棒錘于2014年6月(苗期)、7月(花前期)、8月(花期)、9月(果期)采自秦嶺太白山上板寺地區(qū)，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學雷國蓮教授鑒定為鐵棒錘(A.pendulumBusch)，分離各藥用部位，洗凈，干燥，粉碎，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：A：乙腈-四氫呋喃(25:15)，B：0.1 mol/L醋酸銨溶液(每1000 mL加冰乙酸0.5 mL)，按表1梯度洗脫；檢測波長為235 nm ；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；進樣量：10 μL；理論板數(shù)按新烏頭堿峰計算應不低于2000。

表1 梯度洗脫時間表

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取烏頭堿對照品、次烏頭堿對照品、新烏頭堿對照品，加異丙醇-三氯甲烷(1∶1)的混合溶液溶解，制成每1 mL分別含烏頭堿66.6 μg、次烏頭堿170.6 μg 和新烏頭堿170.6 μg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取鐵棒錘粉末(過三號篩)約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL潤濕，精密加入異丙醇-乙酸乙酯(1∶1) 混合溶液50 mL，稱定重量，超聲處理(功率300W，頻率90 KHZ；水溫在25℃)以下30分鐘，放冷，再稱定重量，用異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，40℃以下減壓回收溶劑至干，殘渣精密加入異丙醇-三氯甲烷(1∶1)混合溶液3 mL使溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。

表2 鐵棒錘不同生長期不同器官中3種雙酯型生物堿的含量

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對照品溶液2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μL進樣，測定峰面積，以對照品進樣量(Y)為橫坐標、峰面積(X)為縱坐標做標準曲線。得回歸方程為：烏頭堿：Y=1×109X-231422，r=0.9990；次烏頭堿：Y=1×109X+33376，r=0.9982；新烏頭堿：Y=6×108X+17739，r=0.9981,證明烏頭堿在0.13～1.33 μg、次烏頭堿在0.34～3.41 μg、中烏頭堿在0.34～3.41 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

取2.2配制的對照品溶液，進樣10 μL，平行測定6次，記錄峰面積，烏頭堿、次烏頭堿、中烏頭堿峰面積的RSD分別為1.11%、1.78%、1.87%，該數(shù)據(jù)符合規(guī)定。

2.6 重復性試驗

精密稱取同一批次鐵棒錘藥材粉末5份，按2.3項下方法制備供試品溶液，進樣10 μL，記錄峰面積，烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿含量的RSD分別為3.57%、2.02%、3.83%，該數(shù)據(jù)符合規(guī)定。

2.7 穩(wěn)定性試驗

精密稱取鐵棒錘粉末1份，按2.3項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8小時進樣10 μL，記錄峰面積，烏頭堿、次烏頭堿、中烏頭堿峰面積的RSD 分別為2.17%、2.17%、3.22%，該數(shù)據(jù)符合規(guī)定。

2.8 回收率試驗

精密稱取6份已知含量的鐵棒錘藥材粉末，分別精密加入混合對照品溶液，按2.3項下方法制備供試品溶液，進樣10 μL，記錄峰面積，烏頭堿平均回收率為97.04%，RSD=1.29%；次烏頭堿平均回收率為96.99%，RSD=1.17%；新烏頭堿平均回收率為96.27%，RSD=1.52%，該數(shù)據(jù)符合規(guī)定。

2.9 含量測定

取不同生長期不同藥用部位的鐵棒錘粉末，按照2.3項下制備供試品溶液，進樣10 μL，記錄峰面積，代入線性方程，計算樣品含量。不同生長期不同藥用部位鐵棒錘中烏頭堿、次烏頭堿及中烏頭堿的含量見表2、圖1。

3 討論

3.1 建立鐵棒錘3種酯型生物堿測定方法

本文采用2015版藥典中川烏的雙酯型生物堿測定方法測定鐵棒錘器官中烏頭堿、次烏頭堿及中烏頭堿的含量，本法操作簡單，測定結(jié)果準確，具有一定的重復性，可用于測定鐵棒錘中3種雙酯型生物堿的含量，并可為藥材及相關(guān)制劑質(zhì)量標準的修訂和完善提供依據(jù)。

3.2 鐵棒錘不同器官內(nèi)酯型生物堿的動態(tài)變化

對塊根來說，花前期3種雙酯型生物堿的總量是0.4644%、花期是0.4729%、果期是0.6055%，即花前期<花期<果期，總體表現(xiàn)為塊根中的雙酯型生物堿呈上升趨勢，在果期達到最高點，民間常采集果期塊根入藥看來是合理的。對莖來說，花前期3種生物堿的總量是1.6088%、花期是0.2019%、果期是0.1605%，即花前期>花期>果期，總體表現(xiàn)為下降的趨勢，花前期莖中的含量是所有器官中含量最高的。對葉來說，花前期3種生物堿的總量是0.4772%、花期是0.5287%、果期是0.109%，即花期>花前期>果期，葉中3種酯型生物堿在花期達到高峰，果期明顯下降。

注：A鐵棒錘混合對照品；B鐵棒錘苗期幼苗；C鐵棒錘花前期塊根；D鐵棒錘花前期莖；E鐵棒錘花前期葉；F鐵棒錘花期塊根； G鐵棒錘花期莖；H鐵棒錘花期葉；I 鐵棒錘花期花；J鐵棒錘果期塊根；K 鐵棒錘果期莖；L鐵棒錘果期葉；M鐵棒錘果期果實

3.3 鐵棒錘不同生長期植物體內(nèi)酯型生物堿的動態(tài)變化

在苗期3種雙酯型生物堿的總量是0.3949%、花前期是2.5504%、花期是1.2035%、果期是0.875%，即苗期<花前期>花期>果期，呈現(xiàn)一個先上升再下降的趨勢，花前期3種雙酯型生物堿的總量最高，到花期和果期急劇下降，從總量上來說，花前期、花期、果期的含量遠遠高于苗期。

3.4 鐵棒錘在不同生長期器官內(nèi)3種酯型生物堿的動態(tài)變化

對烏頭堿來說，苗期幼苗烏頭堿的含量是0.10%、塊根中烏頭堿的含量花前期是0.28%、花期是0.18%、果期是0.12%，即花前期>花期>果期，呈現(xiàn)先升后降的趨勢，花前期最高，果期含量降到最低，但仍然高于苗期；莖中烏頭堿花前期是1.53%、花期是0.11%、果期是0.04%，即花前期>花期>果期，呈現(xiàn)先升后降的趨勢，花前期莖中烏頭堿的含量最高；葉中烏頭堿含量花前期是0.32%、花期是0.22%、果期是0.05%，即花前期>花期>果期，葉中烏頭堿的含量呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，花前期葉中烏頭堿含量最高。烏頭堿在植物體內(nèi)的含量呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，花前期葉中烏頭堿的含量最高。

對次烏頭堿來說，苗期幼苗次烏頭堿的含量是0.29%，塊根次烏頭堿含量花前期是0.14%、花期是0.29%、果期是0.13%，即花期>花前期>果期，呈現(xiàn)S型變化，苗期和花期含量最高，花前期和果期含量相當；莖中次烏頭堿含量花前期是0.06%、花期是0.09%、果期是0.12%，即果期>花期>花前期，莖中次烏頭堿呈現(xiàn)S型變化，苗期次烏頭堿含量遠遠高于其他；葉中次烏頭堿含量花前期是0.14%、花期是0.3%、果期是0.05%，即花期>花前期>果期，呈現(xiàn)S型變化的趨勢，苗期和花期葉中次烏頭堿的含量最高。次烏頭堿在植物體內(nèi)中的含量均呈現(xiàn)S變化趨勢，苗期和花期的含量最高。

對中烏頭堿來說，苗期幼苗含量是0.0049%，塊根中中烏頭堿含量花前期是0.0444%、花期是0.0029%、果期是0.0355%，即花前期>果期>花期，呈現(xiàn)S型變化，花前期塊根中中烏頭堿含量最高；莖中中烏頭堿含量花前期是0.0188%、花期是0.0019%、果期是0.0005%，即花前期>花期>果期，呈現(xiàn)先升后降的趨勢，花前期莖中中烏頭堿含量最高；葉中中烏頭堿花前期是0.0172%、花期是0.0087%、果期是0.009%，即花前期>花期>果期，呈現(xiàn)先升后逐漸平穩(wěn)的趨勢，花前期葉中中烏頭堿的含量最高。中烏頭堿在植物體內(nèi)的含量均呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，花前期中烏頭堿含量最高。

3.5 不同器官的藥用價值評價

2015版中國藥典川烏含烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的總量在0.050%～0.17%[11]。從表2可以看出，3種酯型生物堿的總量，苗期幼苗是0.3949%，花前期塊根是0.4644%、莖是1.6088%、葉是0.4772%，莖>葉>塊根>幼苗，可以看出在花前期和幼苗一樣，各器官都具有藥用價值；花期3種酯型生物堿的總量，塊根是0.4729%、莖是0.2019%、葉是0.5287%、花是0.4404%，葉>塊根>花>葉，可以看出花期各器官都具有藥用價值；果期3種酯型生物堿的總量塊根是0.6055%、莖是0.1605%、葉是0.109%、果實是0.2034%，塊根>果實>莖>葉；與川烏相比，可以看出各器官都具有藥用價值，花前期、花期不同器官中3種酯堿的總量均大于川烏的最高限量。果期塊根、果實中3種酯堿的總量均大于川烏的最高限量，果期莖、葉中3種烏頭酯堿的總量在川烏限量的上限。綜上所述，鐵棒錘不同生長期、不同器官都具有較高的藥用價值，通過本研究，可以為資源開發(fā)及合理使用提供參考依據(jù)。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Determination of three diester diterpenoid alkaloids in different organsat different growing period ofA.pendulumBusch

YANGChanghua，YANGWenjuan，WANGXifang，etal.ShaanxiInstituteofInternationalTrade&Commerce，Xianyang712046，China

Correspondingauthor：YANGChanghua，E-mail：466811179@qq.com

Objective To study the dynamic changes of chemical compositions in different organs ofA.pendulumBusch from Shaanxi at different growing periods, and to provide a theoretical basis for the rational use and resource development, the method of HPLC was applied to analyze the contents of aconitine, hypaconitine and mesaconitine in different organs. Methods The assay was performed on Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)column at the temperature of 25℃ by gradient elution, mobile phase was made up of A and B at a flow of 1.0 mL/min, and the A mobile phase consisted of acetonitrile and tetrahydrofuran(25:15), and the B mobile phase consisted of 0.1 mol/L ammonium acetate solution(1000 mL solution mixed 0.5mL glacial acetic acid), the eluent was monitored by UV detector at 235 nm. Results The content of three diester diterpenoid alkaloids were found to be much different and higher in different organs ofA.pendulumBusch at different growing period; content of diester diterpenoid alkaloid were the highest in root during fruit stage; the highest contant of diester diterpenoid alkaloid in stem were at flower stage; the highest contant of diester diterpenoid alkaloid in leaf were at flower stage；The content of aconitine increased at first and then decreased at different growing period in phant and had the highest at prophase of flower stage; the content of hypaconitine showed changes in curve in plants and was the highest at seedling and flowering stage; the content of mesacontine increased at first and then decreased at different growing period in phant and the highest was at prophase of flower stage. Conclusion The medicinal value ofA.pendulumBuschwashigherindifferentorgansatdifferentgrowingperiod,thecontentofthreediesterditerpenoidalkaloidsaremuchlargerthanthatofaconitiRadix,thisstudyprovidedatheoreticalbasisfortherationaluse,resourceexploitingandqualityevaluatingofA.pendulumBusch produced in Shaanxi.

A.pendulumBusch； Different organs； Growing periods； Dynamic change

陜西省教育廳項目(2013JK0841)

712046 咸陽，陜西國際商貿(mào)學院中藥研究院(楊長花)，國際學院(崔立坤)；陜西科技大學生命科學院(楊文娟)；陜西中醫(yī)藥大學藥學院(王西芳)

楊長花(1978- )，女，碩士，講師。研究方向：藥用植物資源開發(fā)利用。E-mail：466811179@qq.com

R254.23

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.01.004

2016-04-16)