辣椒輕斑駁病毒鳳城分離物的鑒定、全基因測(cè)序及系統(tǒng)進(jìn)化分析

竹懷婷, 李曉冬, 侯慧慧, 徐千惠, 安夢(mèng)楠

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 沈陽(yáng) 110866)

辣椒輕斑駁病毒鳳城分離物的鑒定、全基因測(cè)序及系統(tǒng)進(jìn)化分析

竹懷婷, 李曉冬, 侯慧慧, 徐千惠, 安夢(mèng)楠*

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 沈陽(yáng) 110866)

辣椒輕斑駁病毒Peppermildmottlevirus(PMMoV)屬于煙草花葉病毒屬,是辣椒上重要的病原病毒之一,近年來(lái)PMMoV對(duì)遼寧部分辣椒產(chǎn)區(qū)造成嚴(yán)重危害。本文采用DAS-ELISA檢測(cè)以及RT-PCR的方法首次從遼寧省鳳城市蔬菜產(chǎn)區(qū)辣椒病葉中檢測(cè)出PMMoV,暫命名為PMMoV-FC。設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序后得到該病毒分離物全基因序列。將PMMoV-FC的全基因序列與已報(bào)道的國(guó)內(nèi)外9個(gè)PMMoV分離物進(jìn)行同源性分析,結(jié)果表明,其同源性介于94.3%～99.7%之間?；谌蛐蛄械南到y(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析表明,PMMoV-FC與國(guó)內(nèi)分離物、日本分離物以及美洲分離物親緣關(guān)系密切,而與韓國(guó)和西班牙分離物親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)。鑒于該病毒在辣椒上造成的嚴(yán)重危害,對(duì)于PMMoV-FC在遼寧地區(qū)的發(fā)生以及防治仍需進(jìn)行更為詳細(xì)的研究。

辣椒輕斑駁病毒; RT-PCR; 全基因組測(cè)序; 系統(tǒng)進(jìn)化分析

我國(guó)近年來(lái)辣椒Capsicumfrutescens產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速,已成為世界上辣椒栽培面積最大的國(guó)家[1],種植面積基本穩(wěn)定在150萬(wàn)～160萬(wàn)hm2,約占我國(guó)蔬菜種植面積的10%[1-2]。辣椒也是我國(guó)遼寧省重要的蔬菜作物之一,辣椒病毒病是危害辣椒生產(chǎn)的重要病害,常導(dǎo)致辣椒落葉、落花、落果,可造成減產(chǎn)30%～50%,甚至絕收,成為影響辣椒產(chǎn)量的主要因素之一[3]。辣椒輕斑駁病毒Peppermildmottlevirus(PMMoV)屬于煙草花葉病毒屬Tobamovirus的正義鏈RNA病毒,基因組RNA由6 356或6 357個(gè)堿基組成,編碼病毒復(fù)制酶蛋白p126和p183、運(yùn)動(dòng)蛋白(movement protein, MP)和外殼蛋白(17 kDa)等至少4種蛋白[4-5],是世界范圍內(nèi)造成辣椒經(jīng)濟(jì)損失的重要病原之一。PMMoV可以通過(guò)種子和汁液摩擦傳播,帶毒種子、發(fā)病植株和病土是重要的侵染來(lái)源[6]。PMMoV最早報(bào)道于美國(guó)辣椒[7],1994年在中國(guó)新疆辣椒上首次發(fā)現(xiàn)[8]。2014年6月遼寧省葫蘆島地區(qū)溫室大棚辣椒上暴發(fā)辣椒輕斑駁病毒病,50%的辣椒受到侵染,受害總面積達(dá)15 hm2,直接造成三分之一的經(jīng)濟(jì)損失[9]。感病辣椒葉片呈現(xiàn)斑駁、花葉、扭曲或皺縮,莖稈上出現(xiàn)褐色壞死斑,果實(shí)變小畸形、果面斑駁或出現(xiàn)凹陷壞死等明顯病毒病癥狀,后期辣椒果實(shí)外觀和內(nèi)在品質(zhì)均顯著變差[10]。迄今有關(guān)遼寧地區(qū)辣椒輕斑駁病毒的基因序列的詳細(xì)研究十分缺乏,本研究采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(DAS-ELISA)檢測(cè)等技術(shù)對(duì)PMMoV鳳城辣椒分離物(PMMoV-FC)的基因全序列進(jìn)行克隆和序列分析,明確了該分離物與國(guó)內(nèi)外分離物的親緣關(guān)系,從分子水平鑒定該病毒分離物,為后續(xù)在該病毒的預(yù)防和控制方面提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

毒源的采集與保存:本研究于2015年9月在遼寧省鳳城市鳳山區(qū)大梨樹(shù)村辣椒生產(chǎn)區(qū)調(diào)查采樣,采集的辣椒(品種為‘津福15號(hào)’)病葉具有明顯花葉和斑駁癥狀。將上述癥狀病樣汁液摩擦接種于溫室培養(yǎng)辣椒‘津福15號(hào)’上繁殖并保存。

生化及分子生物學(xué)試劑:供試PMMoV的DAS-ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Agdia公司;植物總RNA提取所用TRIzon Reagent試劑購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司;反轉(zhuǎn)錄TIANScriptcDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司,PCR擴(kuò)增酶 Ex Taq購(gòu)自大連寶生物公司;引物由上海生工合成,質(zhì)粒核酸測(cè)序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DAS-ELISA血清學(xué)檢測(cè)

取田間采集到的辣椒疑似感染病毒病葉,加入PBS緩沖液進(jìn)行研磨裂解后,采用DAS-ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。按照DAS-ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,終止液終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀于405 nm波長(zhǎng)下讀取每孔的吸光度。

1.2.2 辣椒葉片總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

選取2份發(fā)病癥狀明顯的辣椒病葉,以一份溫室培育的健康辣椒葉片作為對(duì)照,提取葉片總RNA,每份樣品稱(chēng)取0.1 g。提取方法按照TRIzon Reagent試劑說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行,將得到的葉片總RNA存于-80℃下備用。以提取的總RNA為模板,采用隨機(jī)引物,參照TIANScriptcDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)方法獲取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。

1.2.3 基因全序列的克隆與測(cè)序

根據(jù)GenBank中PMMoV中國(guó)分離物PMMoV-CN(登錄號(hào):AY859497)的基因序列設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物(表1)。引物由上海生工合成。

表1 PMMoV特異性擴(kuò)增引物

Table 1 Specific primer sequences for PMMoV amplification

引物名稱(chēng)Primer序列(5'-3')Sequence起始位點(diǎn)InitiationsitePMMoV1FGTAAATTTTTCACAATTTAA-CAACAACAAC1PMMoV1RACACCAAAGATTCGGAGCTC2482PMMoV2FGTAGAGTCGCAGTGAGCTCC2450PMMoV2RTAGCATAGAGGACAGACATGC4466PMMoV3FGAGGAAAAGCGGTGATGTCAC4395PMMoV3RTGGGCCGCTACCCGCGGTTC6356

以葉片的總RNA為模板,采用3步RT-PCR法擴(kuò)增PMMoV-FC的全基因序列。分別以特異性引物PMMoV1F和PMMoV1R,PMMoV2F和PMMoV2R以及PMMoV3F和PMMoV3R擴(kuò)增PMMoV-FC(圖1),并進(jìn)行測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果通過(guò)拼接得到PMMoV-FC全基因序列。PCR反應(yīng)體系按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行操作,總體積為25 μL,反應(yīng)條件為94℃ 1 min;94℃ 30 s,54℃ 30 s,72℃ 3 min,35個(gè)循環(huán);72℃ 8 min。PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行電泳并切膠回收后與pMD19-T載體(寶生物公司)進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司),于含50 ng/μL氨芐青霉素的平板上培養(yǎng)過(guò)夜,經(jīng)藍(lán)白斑篩選挑取白色菌落進(jìn)行培養(yǎng),提取質(zhì)粒。將篩選出的含重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆送至金唯智生物科技(北京)有限公司進(jìn)行測(cè)序。采用DNAMAN V8.0(Lynnon Corporation)軟件及BLAST(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行序列分析,利用Clustalx v1.81和Mega v6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

圖1 RT-PCR擴(kuò)增過(guò)程Fig.1 Amplification process of RT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒疑似病毒病樣品田間癥狀

調(diào)查發(fā)現(xiàn),發(fā)病辣椒葉片呈現(xiàn)斑駁、花葉、扭曲或皺縮,莖稈上出現(xiàn)褐色壞死斑,果實(shí)變小畸形、果面斑駁或出現(xiàn)凹陷壞死等明顯病毒病癥狀,果實(shí)外觀和內(nèi)在品質(zhì)均顯著下降(圖2)。

圖2 田間辣椒病葉癥狀Fig.2 Symptoms of diseased pepper leaves in the field

2.2 PMMoV的DAS-ELISA血清學(xué)檢測(cè)

對(duì)采集到的3個(gè)病樣進(jìn)行DAS-ELISA檢測(cè)結(jié)果表明辣椒病葉均呈PMMoV陽(yáng)性,其中辣椒病葉PMMoV檢測(cè)OD平均值=1.06;陰性對(duì)照OD平均值=0.095;PMMoV陽(yáng)性質(zhì)控物OD平均值=0.81,表明采集到的樣品中攜帶PMMoV。

2.3 PMMoV-FC RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

分別采用PMMoV1F和PMMoV1R,PMMoV2F和PMMoV2R以及PMMoV3F和 PMMoV3R 3對(duì)特異性引物(表1),以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行了PCR(RT-PCR)擴(kuò)增(圖1)。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明:泳帶從左到右分別擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為2.5、2和2 kb的單一PCR產(chǎn)物片段(圖3)。

2.4 PMMoV-FC的全基因測(cè)序

通過(guò)DNAMAN V8.0軟件對(duì)3段克隆到pMD19-T載體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和拼接,每段產(chǎn)物至少測(cè)通3個(gè)克隆以上,確保序列結(jié)果的準(zhǔn)確性。將拼接后的PMMoV-FC全基因序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)并獲得臨時(shí)登記號(hào)(KU646837)。

圖3 3對(duì)特異性引物的 PMMoV-FC RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 RT-PCR products of PMMoV-FC using three pairs of specific primers

2.5 PMMoV-FC與其他分離物的基因同源性比對(duì)

從GenBank中選取9個(gè)PMMoV分離物(其中包括2個(gè)中國(guó)分離物、4個(gè)來(lái)自亞洲其他國(guó)家的分離物、2個(gè)美洲分離物和1個(gè)歐洲分離物)和煙草花葉病毒屬其他2種病毒分離物基因全序列,采用DNAMAN軟件對(duì)PMMoV-FC的基因全序列與上述基因的序列同源性進(jìn)行了比較,結(jié)果(表2)表明:PMMoV-FC與選取的9個(gè)PMMoV分離物核苷酸的序列同源性介于94.4%～99.7%之間,同源性很高,其中與中國(guó)分離物PMMoV-CN(AY859497)、PMMoV-HN1(KP345899)和日本分離物PMMoV-J(AB000709)、PMMoV-Jp(AB069853)以及美洲分離物PMMoV BR-DF01(AB550911)、PMMoV-A(NC003630)同源性均在99%以上;與分離物PMMoV-Kr(AB126003)、PMMoV-Ia(AJ308228)、PMMoV-P3(LC082100)的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn),同源性介于94.3%～97.3%之間,與TMV(NC001367)相似度為69.5%,與CGMMV(NC001801)的相似度為51.1%(表2)。

2.6 基于全基因序列的PMMoV系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將PMMoV-FC基因全序列與上述分離物(表2)進(jìn)行比對(duì)后,通過(guò)Clustalx V1.81和Mega V6.06構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖4)。結(jié)果表明:采用Neighbor-Joining聚類(lèi)分析方法將所有PMMoV分離物聚類(lèi)在一起,形成兩大支系群體,PMMoV-FC與來(lái)自中國(guó)、日本、韓國(guó)和美洲的6個(gè)PMMoV分離物聚為一個(gè)支系,與西班牙分離物(PMMoV-Ia)和來(lái)自韓國(guó)的另一種分離物(PMMoV-P3)分屬不同支系,但親緣關(guān)系仍相對(duì)較近,與TMV以及CGMMV親緣關(guān)系很遠(yuǎn)(圖4)。

表2 PMMoV-FC核苷酸序列同源性比較

Table 2 Homology analysis of PMMoV-FC genome sequence with other PMMoV isolates and other virus ofTobamovirus

分離物IsolateGenBank登錄號(hào)GenBankaccessionno.來(lái)源Origin核苷酸序列同源性/%IdentityPMMoV-JAB000709日本99.7PMMoV-JpAB069583日本99.7PMMoV-CNAY859497中國(guó)99.6PMMoV-HN1KP345899湖南99.6PMMoV-ANC003630美國(guó)99.6PMMoV-BR-DF01AB550911南美99.3PMMoV-KrAB126003韓國(guó)97.3PMMoV-IaAJ308228西班牙94.4PMMoV-P3LC082100韓國(guó)94.3TMVNC001367俄羅斯69.5CGMMVNC001801日本51.1

圖4 基于PMMoV基因核酸全序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of PMMoV complete genome sequences

3 結(jié)論與討論

自向本春等[8]首次將新疆石河子地區(qū)辣椒上危害的病毒鑒定為辣椒輕斑駁病毒以來(lái),近些年在我國(guó)華北地區(qū)、山東青島、西南貴州、西北寧夏、陜西乃至臺(tái)灣地區(qū)的辣椒上均發(fā)現(xiàn)該病毒[11-13],可見(jiàn)其危害地區(qū)越來(lái)越廣、危害面積也在逐步增加。遼寧省辣椒主栽品種有‘丹椒4號(hào)’、‘超級(jí)金塔2號(hào)F1’、‘西星牛角椒1號(hào)’、‘津福15號(hào)’、‘益都紅’、‘辣優(yōu)8號(hào)’、‘鞍椒1號(hào)’、‘猛椒3號(hào)’等。本研究通過(guò)RT-PCR檢測(cè),可確定遼寧省丹東市鳳城大梨樹(shù)村采集到辣椒病葉為PMMoV所致,帶毒樣品為‘津福15號(hào)’,在遼寧地區(qū)屬于主栽品種之一,具有代表性。本研究通過(guò)同源性分析以及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析明確PMMoV-FC與GenBank中9個(gè)國(guó)內(nèi)和其他國(guó)家PMMoV分離物同源性很高,核苷酸同源性介于94.3%～99.7%之間。采用聚類(lèi)分析法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)并明確了該分離物與國(guó)內(nèi)分離物、日本分離物以及美洲分離物親緣關(guān)系密切,而與韓國(guó)和西班牙分離物親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)。通過(guò)上述結(jié)果揭示PMMoV-FC可能與中國(guó)已報(bào)道的幾種分離物,日本以及美洲分離物具有相同的進(jìn)化祖先。

近年,隨著國(guó)際間種子、苗木貿(mào)易往來(lái)日益頻繁,各口岸出入境檢疫部門(mén)不僅在引種種植的辣椒上檢測(cè)到PMMoV,也從我國(guó)臺(tái)灣及韓國(guó)等進(jìn)境辣椒種子中檢測(cè)到PMMoV的存在。Peng等[14]通過(guò)對(duì)不同省份的42份市場(chǎng)上銷(xiāo)售的辣椒醬進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明:辣椒醬中的PMMoV仍具有侵染活性,PMMoV也會(huì)隨著辣椒醬等辣椒制品的貿(mào)易進(jìn)行傳播。同時(shí),Colson等[15]的研究表明食用含有PMMoV的辣椒產(chǎn)品可導(dǎo)致腹瀉,發(fā)熱等癥狀。因此,應(yīng)重視PMMoV對(duì)于辣椒生產(chǎn)上的危害以及對(duì)人們健康方面的潛在威脅。但PMMoV尚不屬于我國(guó)禁止進(jìn)境的檢疫性有害生物,無(wú)法通過(guò)植物檢疫措施阻止該病毒進(jìn)入我國(guó)。PMMoV在遼寧的發(fā)生尚不普遍,除葫蘆島市和鳳城市以外,暫未在其他地區(qū)檢測(cè)到PMMoV,鑒于其潛在的危害性,對(duì)于該病毒的發(fā)生以及防控仍需進(jìn)行更加深入的研究。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

Identification, whole-genome sequencing and phylogenetic analysis ofPeppermildmottlevirusFengcheng isolate

Zhu Huaiting, Li Xiaodong, Hou Huihui, Xu Qianhui, An Mengnan

(CollegeofPlantProtection,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,China)

Peppermildmottlevirus(PMMoV), a member ofTobamovirus, is a major viral pathogen of pepper. In recent years, PMMoV has caused great loss to pepper production in Liaoning Province. In this study, PMMoV was first identified in Fengcheng City by using DAS-ELISA and RT-PCR method, and named as PMMoV Fengcheng isolate (PMMoV-FC). Three pairs of specific primers were used to amplify the complete genome sequence of PMMoV-FC, and the results of sequence analysis and phylogenetic analysis showed that PMMoV-FC was closely related with 9 PMMoV isolates reported in China or abroad with a sequence identity of between 94.3%-99.7%. Phylogenetic tree was constructed, showing that PMMoV-FC was closely related with Chinese domestic isolate, Japanese isolate and southern American isolate but not with South Korean isolate or Spanish isolate. Due to the significant losses caused by PMMoV to pepper, further research is required to control and prevent the prevailing of the diseases caused by PMMoV-FC in Liaoning Province.

PMMoV; RT-PCR; whole-genome sequencing; phylogenetic analysis

2016-05-09

2016-06-15

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201303028);沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)2016大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目

S 436.418

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.009

* 通信作者 E-mail:anmengnan1984@163.com