夏枯草對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖及凋亡的作用*

伍旭明 許亞萍

浙江省中醫(yī)院 浙江 杭州 310006

夏枯草對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖及凋亡的作用*

伍旭明 許亞萍#

浙江省中醫(yī)院 浙江 杭州 310006

夏枯草 人膽管癌細(xì)胞 增殖 凋亡

膽管癌是一種起源于膽道上皮的少見的惡性腫瘤，手術(shù)仍是目前主要的治療手段，但手術(shù)后生存率較低[1]。有研究表明夏枯草對(duì)多種腫瘤具有抑制作用，但是目前夏枯草對(duì)膽管癌的研究較少。因此本研究主要探討夏枯草對(duì)膽管癌QBC939和RBE細(xì)胞的作用，為臨床中醫(yī)輔助治療膽管癌提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑:夏枯草購(gòu)于福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂醫(yī)院。小牛血清、低糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶等試劑均購(gòu)自GIBICO公司；MTT、Hoechest33258、DMSO，內(nèi)參購(gòu)自sigma公司。Trizol為Invit rogen公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、dNTP、Taq DNA聚合酶為promega公司產(chǎn)品。由上海生工生物工程有限公司合成引物。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng):人QBC939、RBE膽管癌細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù),將細(xì)胞培養(yǎng)于含10%的胎牛血清,1×105IU/L青霉素及125mg/L鏈霉素，低糖DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法:分述如下。

1.3.1 藥品的制備:對(duì)藥材以水煎法提取2h，加入75%的乙醇進(jìn)行溶解，獲得夏枯草的粗提物，取夏枯草粗提物適量，精密稱定，溶解于DMSO中。經(jīng)高壓滅菌后，于-20℃冰箱中保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)母液用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，獲得所需要的干預(yù)濃度。DMSO最終濃度控制在1%以下。

1.3.2 MTT比色實(shí)驗(yàn):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（1×105），用胰酶(EDTA)進(jìn)行消化，接種于96孔培養(yǎng)板，待24小時(shí)細(xì)胞貼壁RBE后，加入不同濃度（50、100、200μg/ml）的夏枯草，每個(gè)藥物濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。設(shè)陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組順鉑(5g/ml)、空白對(duì)照組。細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48、72h后，每孔加入濃度為5mg/ml MTT/PBS液l0μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄上清，每孔中加入150μl二甲基亞砜溶解沉淀，在搖床上充分振蕩l0min，使結(jié)晶物溶解。在酶標(biāo)儀上選擇570nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔光吸收度值，計(jì)算夏枯草對(duì)膽管癌QBC939和細(xì)胞的抑制率。抑制率按公式計(jì)算:P抑制(%)=［(1-D藥物組)/D對(duì)照組)]×100%。

1.3.3 Hoechst 233258:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105，置于24孔板中。待細(xì)胞貼壁，加入100μg/ml的夏枯草，作用48h后，去掉培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次，4%的甲醇在4℃條件下固定細(xì)胞10min后，加入Hoechst233258染液(用PBS稀釋成5μg/ml)，在室溫條件下，細(xì)胞染色15min，選擇波長(zhǎng)356nm，熒光顯微鏡(奧林巴斯FV1000)下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)并攝像。

1.3.4 細(xì)胞凋亡測(cè)定:待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,收集細(xì)胞胰酶消化后,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，種于6孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后，用低、中、高劑量組50、100、200μg/ml的夏枯草分別處理48h后，離心收集細(xì)胞，冷PBS洗滌細(xì)胞2次，70%冷乙醇固定細(xì)胞，置入4℃冰箱中過夜保存?zhèn)溆?。?xì)胞在染色前用PBS洗去固定液，離心1000rpm，5min。加入500μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再各加5μl AnnexinⅤ-FITC及PI溶液，渦旋后，4℃避光孵育30min，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞凋亡的分析應(yīng)用Becton Dickinson FACS分析系統(tǒng)和Mul ticycle軟件進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件作統(tǒng)計(jì)分析。所有計(jì)量資料以±s表示,采用單因素方差分析進(jìn)行組間差異的比較。以P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 夏枯草對(duì)QBC939和RBE細(xì)胞凋亡的影響:見表1。

表1 夏枯草對(duì)QBC939和RBE細(xì)胞凋亡的影響（±s）

表1 夏枯草對(duì)QBC939和RBE細(xì)胞凋亡的影響（±s）

注：與陰性對(duì)照組比較，*P＜0.01。

組別空白對(duì)照組陰性對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組50μg/ml 100μg/ml 200μg/ml QBC939 12.32±0.32 12.52±0.38 35.20±0.52*14.01±0.52 43.25±0.35*53.15±0.42*RBE 12.45±0.38 12.60±0.47 35.64±0.65*14.25±0.58 44.02±0.46*54.25±0.48*

2.2 夏枯草對(duì)QBC939和RBE細(xì)胞增殖抑制率的影 響:見表2。

表2 夏枯草對(duì)QBC939和RBE細(xì)胞增殖抑制率的影響（±s，%）

表2 夏枯草對(duì)QBC939和RBE細(xì)胞增殖抑制率的影響（±s，%）

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.0l。

組別空白對(duì)照組陰性對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組50μg/ml 100μg/ml 200μg/ml QBC939 0—0.01±0.04 0.01±0.04 0.01±0.04 0.01±0.04 0.01±0.04 24—1.20±0.26 28.58±0.40*1.60±0.32 33.42±0.45*48.78±0.35*48—1.59±0.28 39.26±0.36*2.79±0.96 44.73±0.52*58.98±0.74*72—2.01±0.43 49.02±0.53*3.83±0.30 51.43±0.51*70.12±0.43*RBE 0—0.01±0.04 0.01±0.04 0.01±0.04 0.01±0.04 0.01±0.04 24—1.18±0.29 28.62±0.46*1.62±0.37 33.48±0.49*48.58±0.35*48—1.56±0.31 39.33±0.40*2.82±0.98 44.76±0.56*59.04±0.76*72—2.12±0.48 49.13±0.59*3.85±0.35 51.51±0.56*70.20±0.48*

2.3 夏枯草對(duì)QBC939和RBE膽管癌細(xì)胞形態(tài)的影響: QBC939(B)以及RBE(C)細(xì)胞經(jīng)Hoechst233258染色后，在熒光顯微鏡下，觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的變化。對(duì)照組（A）細(xì)胞核呈圓形，處理組（B,C）細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，核發(fā)生碎裂，有凋亡小體出現(xiàn)，出現(xiàn)典型的凋亡改變。見圖1。

圖1 夏枯草對(duì)QBC939和RBE膽管癌細(xì)胞形態(tài)的影響

3 討論

夏枯草為唇形科植物夏枯草Prunel la vulgaris L．的干燥果穗，因“夏至后即枯”而得名，是一味清火、明目、散結(jié)、消腫的傳統(tǒng)中藥,早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就記載“夏枯草，味辛、苦，主寒熱瘰疬，頭創(chuàng)，破瘕，散癭，結(jié)氣……”。現(xiàn)代臨床經(jīng)驗(yàn)證明單味夏枯草或與其他藥配伍，對(duì)治療肺癌、乳腺癌、腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤、淋巴瘤 等多種惡性腫瘤，均有較為滿意的效果[2]。夏枯草作為一種廉價(jià)、低毒、有效的抗腫瘤中藥，越來越引起人們的廣泛關(guān)注。

膽管癌的發(fā)病率目前逐年升高，其發(fā)病的原因不明，化療是治療膽管癌的一項(xiàng)重要手段，但缺乏敏感且有效的化療藥物[3]。因此，尋找有效的化療藥物是目前臨床的一項(xiàng)重要任務(wù)?，F(xiàn)代臨床研究表明單味夏枯草或者其復(fù)方對(duì)淋巴瘤、血管瘤、甲狀腺腫瘤等惡性腫瘤，療效較好。目前夏枯草對(duì)膽管癌的研究較少，本研究主要探討夏枯草對(duì)膽管癌細(xì)胞株QBC939，RBE增殖及凋亡的影響。細(xì)胞的發(fā)生快速增殖是腫瘤細(xì)胞的主要特征之一，控制癌癥發(fā)展的一個(gè)重要途徑是遏制腫瘤細(xì)胞的快速增殖。膽管癌細(xì)胞QBC939及RBE經(jīng)不同濃度的夏枯草分別處理24、48、72小時(shí)后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖的抑制情況。研究結(jié)果顯示，經(jīng)中、高濃度（100、200μg/ml）夏枯草處理的膽管癌細(xì)胞，細(xì)胞的增殖抑制率增高，并隨著夏枯草藥物濃度的增加，作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增高，與對(duì)照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示夏枯草能抑制膽管癌細(xì)胞QBC939及RBE的增殖，并呈時(shí)間濃度依賴性。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或者病理?xiàng)l件下，在內(nèi)在基因的調(diào)控下，細(xì)胞自動(dòng)結(jié)束生命的一個(gè)過程。細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)固縮、細(xì)胞核破碎，凋亡小體形成等特征性變化。本研究結(jié)果顯示，膽管癌細(xì)胞QBC939及RBE經(jīng)100μg/ml的夏枯草處理48小時(shí)后，膽管癌細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)改變，而對(duì)照組細(xì)胞沒有發(fā)生凋亡形態(tài)的變化。同時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,經(jīng)不同濃度（50、100、200μg/ml）夏枯草處理后細(xì)胞的凋亡率增加，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并呈濃度依賴性。提示夏枯草能誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞株QBC939及RBE的凋亡參與抑制膽管癌的作用。本次研究結(jié)果與翁金月等[4]的研究報(bào)道基本一致。

綜上所述，研究表明在體外夏枯草能顯著抑制QBC939及RBE膽管癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，為臨床輔助膽管癌的治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

[1]Wang H,Wang J,Wang H L.Mul tivariate analysis of survival rates in patients with hi lar cholangiocarinoma[J].J Surg Concepts Pract,2014,19(5):80-89.

[2]竇景云.夏枯草藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2013，29(7):1039-1041.

[3]國(guó)際肝膽胰學(xué)會(huì)中國(guó)分會(huì),中華醫(yī)學(xué)會(huì)外科學(xué)分會(huì)肝臟外科學(xué)組.膽管癌診斷與治療——外科專家共識(shí)[J].中國(guó)實(shí)用外科雜志,2014,34（1）:1-5.

[4]翁金月,鄭良樸,張春椿.夏枯草促人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)觀察[J].浙江中醫(yī)雜志,2014,49（10）:772-774.

2016-09-16

全國(guó)名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目徐錫山名老中醫(yī)藥專家傳承工作室，編號(hào)：國(guó)中醫(yī)藥人教發(fā)[2013]47號(hào)

# 通訊作者：許亞萍，E-mai l：xyp_81@tom.com