升白湯對60Co射線所致小鼠骨髓有核細胞周期的影響

朱惠香 張荷萍 龔海英

浙江省義烏稠州醫(yī)院 浙江 義烏 322000

升白湯對60Co射線所致小鼠骨髓有核細胞周期的影響

朱惠香 張荷萍 龔海英

浙江省義烏稠州醫(yī)院 浙江 義烏 322000

升白湯 60Co射線 骨髓 細胞周期 實驗研究

近年來由于種種原因，白細胞減少癥的發(fā)生率正呈逐步上升趨勢，是臨床醫(yī)生經常要面臨的醫(yī)療問題。本院自擬的經驗方“升白湯”為基本方辨證分型加減，該方為健脾補腎、益氣生血方，在臨床升白治療中有一定療效。為進一步觀察升白湯對白細胞減少癥的作用，本文考察了該方對骨髓有核細胞周期的影響，以便進一步明確升白湯對輻射損傷所致白細胞減少的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料:分述如下。

1.1.1 實驗動物:清潔級ICR小鼠，雄性，共85只，6～8周齡，體質量18～22g，由浙江省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心提供（合格證號:SYXK(浙)2014-0003）。

1.1.2 實驗藥品:①升白湯:生黃芪、黃精、仙鶴草各30g，仙靈脾、雞血藤各15g，女貞子、當歸各12g。以上中藥用水浸泡10小時后，再行煎煮，共2次，每次1小時，合并煎液，離心，濃縮，分別稀釋至藥液濃度為3.80g生藥/ml、1.90g生藥/ml、0.95g生藥/ml 3種濃度,分別相當于成人用量的16倍、8倍、4倍。②利可君片（購于江蘇吉爾貝藥業(yè)，批號150606），臨用前用蒸餾水溶解稀釋，配成1mg/ml的溶液。

1.1.3 主要儀器:酶標儀（Bio-RAD公司680，美國）；臺式離心機（Biofogepico，Heraeus公司，德國）；電子天平（METTLER TOLEDO AB204-S，瑞典）；解剖顯微鏡（OLYMPUS SZ-11，日本）；生物顯微鏡（OLYMPUS，CHK2-FGS日本）。

1.1.4 主要試劑:小鼠γ干擾素（中美生命科技公司，批號:E0049m）；小鼠粒細胞因子（中美生命科技公司，批號:E0045m）；冰醋酸（分析純，杭州化學試劑廠，批號: 150626）。

1.2 分組及給藥:分述如下。

1.2.1 動物分組:85只小鼠，隨機共分6組，正常組10只，模型組、升白湯大劑量組、中劑量組、小劑量組及利可君組（陽性組）隨機各15只。

1.2.2 給藥方式:正常組、模型組:灌胃給予生理鹽水25ml/kg，1次/日。大劑量組:升白湯3.8g生藥/ml灌胃，1次/日。中劑量組:升白湯1.9g生藥/ml灌胃，1次/日。小劑量組:升白湯0.95g生藥/ml灌胃，1次/日。陽性組:利可君20mg/kg、1mg/ml灌胃，1次/日。

1.3 造模:以上各組灌胃14天后，除正常組外，其余各組均施行一次性60Co射線全身照射，吸收總劑量為3.5Gy，由浙江省農科院輻照中心施行。

1.4 骨髓有核細胞周期的測定：于照射造模后14天，處死動物，分離出2側股骨。取左側股骨中段7mm，用0.005mol/LCaCl2溶液10ml將全部骨髓沖入離心管內，搗碎，加生理鹽水混懸，將細胞以1×106接種于60mm培養(yǎng)板，80%匯合后轉染。24小時后在新鮮培養(yǎng)液中加入適當的抗生素（真核表達載體上的抗性標記）進行培養(yǎng)，48小時后用胰酶消化收集細胞，PBS洗兩遍，棄上清，加入1ml 70%預冷乙醇中，吹打均勻，4℃固定12小時以上。PBS洗滌去乙醇，1000rpm,5min，洗兩遍。0.5mlPBS重懸細胞，加入PI和RNaseA至終濃度50μg/ml，37℃溫浴30min。用流式細胞儀測定周期。

2 結果

2.1 各組實驗動物死亡情況:至實驗第14天，正常組死亡0只；模型組死亡5只；陽性組死亡3只；升白湯小劑量組死亡1只；升白湯中劑量組死亡2只；升白湯大劑量組死亡3只。

2.2 對小鼠外周血WBC計數的影響:輻射后第3天各輻照組小鼠外周血WBC計數明顯減少，與正常組比較差異均有顯著性（P＜0.01）。在輻射后第7天，各輻射組與正常組WBC比較差異仍有顯著性（P＜0.01）；同模型組比較，升白湯大、中、小劑量組及陽性組小鼠外周血WBC計數無顯著性差異（P＞0.05）；同陽性組比較，升白湯三個劑量組小鼠外周血WBC計數差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在輻射后第10、14天，升白湯各劑量組小鼠外周血WBC計數與模型組比較有明顯回升，差異有顯著性（P＜0.05），其中中劑組與模型組比較，差異更有顯著性（P＜0.01）。在輻射后第10天，升白湯各劑量組外周血WBC計數回升與陽性組比較無顯著性差異（P＞0.05）；在輻射后第14天，中劑量組與陽性組比較有顯著性差異（P＜0.05），大、小劑量組與陽性組比較無顯著性差異（P＞0.05）。具體見表1。

表1 升白湯對60Co輻射小鼠WBC計數的影響（±s，×109/L）

表1 升白湯對60Co輻射小鼠WBC計數的影響（±s，×109/L）

注:與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＄P＜0.05,＄＄P＜0.01；升白湯各組與陽性組比較，#P＜0.05。

組別正常組模型組陽性組小劑量組中劑量組大劑量組例數10 10 12 14 13 12照射后小鼠WBC計數（109/L）3天13.13±3.25 2.33±0.82**2.41±0.63**2.52±0.91**2.46±0.29**2.47±0.76**7天11.46±2.66 1.26±0.73**1.43±0.38**1.50±0.37**1.48±0.74**1.28±0.39**10天10.33±3.05 1.70±0.49 2.52±0.83＄2.49±0.86＄3.02±0.79＄＄2.60±0.44＄14天10.11±2.45 1.79±0.39 2.67±0.83＄2.55±0.72＄3.27±1.33＄＄#2.68±0.79＄

2.3 對小鼠骨髓有核細胞數（BMNC）的影響:接受60Co照射后，各輻射組小鼠骨髓有核細胞計數均較正常組顯著減少（P＜0.05）。升白湯三個劑量組及陽性組小鼠的骨髓有核細胞計數較模型組顯著增加（P＜0.05），其中升白湯中劑量組BMNC計數與陽性組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。作用強弱順序為:升白湯中劑量組＞陽性組＞大劑量組＞小劑量組。

2.4 對骨髓有核細胞周期的影響:見表2。

表2 升白湯對60Co輻射小鼠骨髓有核細胞周期的影響（±s）

表2 升白湯對60Co輻射小鼠骨髓有核細胞周期的影響（±s）

注:與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，$P＜0.05。

組別正常組模型組陽性組小劑量組中劑量組大劑量組例數10 10 12 14 13 12細胞周期G0/G1 68.24±3.25 63.15±2.17 60.32±4.47 54.02±2.03*55.69±3.34*56.05±1.58*S 24.02±1.28 27.35±2.56 32.22±1.95*36.02±3.10*$35.69±2.75*$35.62±1.02*$G2/M 6.33±0.36 8.65±1.25*7.32±0.88 10.01±1.03*9.87±0.69*9.98±1.45*PI（%）29.28±1.38 34.85±3.04 38.86±2.41 44.35±5.24*$44.06±2.87*$43.86±2.52*$

3 討論

白細胞減少癥屬中醫(yī)學“虛勞”范疇[1]，其主要病機為脾腎虧損，氣血不足。中醫(yī)學認為，腎主藏精，主骨生髓，精能化血，精血同源，精足則血旺。脾主運化水谷精微，為氣血生化之源。因此，人體造血功能與脾腎的關系最為密切。研究表明，健脾補腎和補血養(yǎng)陰的中藥對促進骨髓造血有顯著療效[2]。故血虛當從脾腎論治，補益氣血，升白湯即集補腎生血、健脾益氣于一方。骨髓細胞周期是反映造血系統(tǒng)功能的重要指標之一[3],白細胞減少癥患者均不同程度表現出骨髓有核細胞周期的抑制。細胞周期各個時相反映骨髓細胞增殖的狀態(tài)。在細胞周期調控機制中有兩個重要的檢查點，分別位于G1期與S期，G2期與M期之間。

實驗中發(fā)現輻射后小鼠骨髓BMNC數較正常組有明顯下降，提示輻射對造血系統(tǒng)損傷明顯。各藥物干預組同模型組比較，可顯著提高小鼠骨髓BMNC計數，其中升白湯中劑量組療效最顯著。BMNC計數在一定程度上反應骨髓造血細胞的增生情況，研究證明升白湯可促進BMNC增加，改善輻射所致的造血系統(tǒng)損害，促進造血功能的恢復。

本研究結果顯示，受照后小鼠細胞周期時相表現為S延長及G2期延長，升白湯組與正常組、病理組比較，S期明顯延長(P＜0.05)；G2期較正常組亦明顯延長。其時相敏感點不同說明了劑量對周期時相有著重要影響。

[1]陳慧娟，李立群.升血湯治療化療后白細胞減少癥42例療效觀察[J].浙江中醫(yī)雜志，2013，48(7):510.

[2]梁冰.血液科?？浦嗅t(yī)臨床診治[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2000:415-418.

[3]張迪，徐桂華.中藥對化療致白細胞減少癥治療機制研究進展[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2012,14（3）:53-55.

2016-11-13