黃連解毒湯提取物對(duì)原代神經(jīng)元氧糖剝奪再灌注損傷后5-脂氧酶活性的影響*

徐 靜 黃竹燕 葉夷露 劉丹丹 潘蓓蓓 俞月萍 張 琦#

1 溫州醫(yī)科大學(xué) 浙江 溫州 325035

2 杭州醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

3 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 浙江 杭州 310009

黃連解毒湯提取物對(duì)原代神經(jīng)元氧糖剝奪再灌注損傷后5-脂氧酶活性的影響*

徐 靜1，2黃竹燕3葉夷露2劉丹丹2潘蓓蓓3俞月萍2張 琦1，2#

1 溫州醫(yī)科大學(xué) 浙江 溫州 325035

2 杭州醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

3 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 浙江 杭州 310009

黃連解毒湯 原代神經(jīng)元氧糖剝奪 再灌注損傷 5-脂氧酶 半胱氨酰白三烯 大鼠

腦缺血是嚴(yán)重危害人類健康的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。5-脂氧酶（5-LOX）是催化花生四烯酸生成白三烯（LTs）的關(guān)鍵酶。大量研究證實(shí)，5-LOX及其代謝產(chǎn)物半胱氨酰白三烯（CysLTs）介導(dǎo)腦缺血后炎癥反應(yīng)，5-LOX抑制劑和CysLTs受體拮抗劑對(duì)腦缺血損傷具有保護(hù)作用[1-2]，表明5-LOX/CysLTs通路參與腦缺血再灌注損傷的病理生理過(guò)程。

黃連解毒湯（HJD）是清熱解毒的經(jīng)典方劑。國(guó)內(nèi)外研究表明HJD傳統(tǒng)水煎劑對(duì)體內(nèi)、外腦缺血損傷均具有保護(hù)作用[3]。本研究采用大孔樹(shù)脂吸附法分離制備獲得50%乙醇提取物HJDEE50，觀察HJDEE50對(duì)大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元糖氧剝奪（OGD）再灌注損傷的保護(hù)作用及對(duì)5-LOX活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)新生SD大鼠（24h內(nèi)）由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK（滬）2012-0002]。

1.2 主要試劑與儀器:梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；漢黃芩素、漢黃芩苷和黃芩素對(duì)照品購(gòu)自上海澤衡生物技術(shù)有限公司。連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）和四甲基偶氮唑鹽（MTT）購(gòu)自Sigma公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；兔抗多克隆5-LOX抗體購(gòu)自Santa cruz公司；CysLTs酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cayman公司。高效液相色譜儀（Lumtech K501雙泵，德國(guó)），紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器（Lumtech K2501，德國(guó)），CO2培養(yǎng)箱（HF151，香港力康），酶標(biāo)儀（Mul tiskan MK3，美國(guó)），流式細(xì)胞檢測(cè)儀（Beckman，美國(guó)）。

1.3 藥物制備和含量測(cè)定:黃連、黃芩、黃柏、梔子由華東醫(yī)藥股份有限公司提供并經(jīng)鑒定，按3∶3∶2∶3的比例組方，蒸餾水浸泡2h，分別用水、50%乙醇、80%乙醇煎制，過(guò)濾后合并濾液，減壓濃縮至生藥含量為1.0g/ml的HJD浸膏。浸膏稀釋1倍后上D101型大孔樹(shù)脂柱，50%乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮干燥得到HJDEE50。采用本實(shí)驗(yàn)室建立的RP-HPLC法，測(cè)定HJDEE50中7個(gè)指標(biāo)性成分的含量[4]。

1.4 原代皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng):新生24h內(nèi)SD大鼠，分離剪碎大腦皮質(zhì)，0.027%胰蛋白酶液37℃消化20min，含血清培養(yǎng)液終止消化，吹打后過(guò)200目篩網(wǎng)。離心后用種植液（DMEM-HG+10%FBS+10%HS）重懸，以1×106個(gè)/ml接種于96孔板內(nèi)。24h后換維持培養(yǎng)液（NB+2%B-27+1% L-Glutamine），第3d加入5μg/ml阿糖胞苷。每隔2～3d換液，培養(yǎng)至7～9d后隨機(jī)分組實(shí)驗(yàn)。

1.5 原代皮質(zhì)神經(jīng)元OGD模型制備和實(shí)驗(yàn)分組:正常對(duì)照組用DMEM-HG孵育。OGD模型組神經(jīng)元用無(wú)糖DMEMHG+10mmol/L Na2S2O4孵育20min后，換正常培養(yǎng)液再灌注 1h。齊留通組（10μmol/L）、HJD組（10mg/L）和HJDEE50組（1、10和100mg/L）分別于神經(jīng)元OGD損傷前30min開(kāi)始孵育，并維持至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.6 細(xì)胞存活率檢測(cè):棄去孔板中培養(yǎng)液，加入終濃度為0.5mg/ml的MTT溶液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后棄上液，每孔加入150μl DMSO振蕩10min。在490nm處測(cè)定吸光度（OD值），細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（正常對(duì)照組OD值-空白組OD值）× 100%。篩選出HJDEE50作用的最佳劑量。

1.7 流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù):細(xì)胞消化5min后，吹打細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，離心10min（1000rpm），棄上清，加0.5ml結(jié)合緩沖液重懸后，加入10μl PI與5μl Annexin VFITC，室溫下避光孵育5～10min，之后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 免疫細(xì)胞化學(xué)法:準(zhǔn)備好細(xì)胞爬片。采用兔抗5-LOX多克隆抗體（1∶50）和兔IgG-兩步法免疫組化試劑盒（即用型），按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，DAB顯色，乙醇梯度脫水，中性樹(shù)脂和二甲苯（1∶1）封片。

1.9 酶聯(lián)免疫吸附法：各組參照1.5中的方法進(jìn)行OGD建模。結(jié)束后，培養(yǎng)基中取細(xì)胞樣本200μl，離心后取上清備用。根據(jù)酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，測(cè)定CysLTs的含量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，以單因素方差分析進(jìn)行多組間差異的比較，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HJDEE50中指標(biāo)性成分的含量:RP-HPLC結(jié)果顯示，在本色譜條件下7種標(biāo)準(zhǔn)品能達(dá)到較好分離。HJD主要含有7種指標(biāo)性成分，含量分別為:梔子苷（1.46±0.02）%、黃芩苷（5.57±0.05）%、巴馬?。?.80±0.01）%、小檗堿（5.18± 0.04）%、漢黃芩苷（0.98±0.01）%、黃芩素（1.36±0.02）%、漢黃芩素（0.45±0.02）%，總含量為15.8%。HJDEE50主要含有4種指標(biāo)性成分，其含量分別為:黃芩苷（23.99± 0.38）%、小檗堿（22.13±0.37）%、漢黃芩苷（5.19± 0.03）%、巴馬?。?.93±0.00）%，總含量為55.24%。

2.2 HJDEE50對(duì)原代神經(jīng)元OGD再灌注損傷后存活率的影響:MTT法結(jié)果表明，OGD再灌注損傷使神經(jīng)元存活率顯著降低。與模型組比較，HJDEE50（1、10、100mg/L）均可提高神經(jīng)元存活率（P＜0.05或P＜0.01），有效劑量范圍較廣，最佳有效劑量為1mg/L，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將采用該劑量。與HJD（10mg/L）相比，HJDEE50（1mg/L）顯著提高神經(jīng)元存活率（P＜0.01）。詳見(jiàn)表1。

表1 HJDEE50對(duì)神經(jīng)元存活率的影響（±s）

表1 HJDEE50對(duì)神經(jīng)元存活率的影響（±s）

注:與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與OGD模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與HJD組比較，△△P＜0.01。

分組正常對(duì)照組OGD模型組HJD HJDEE50藥物濃度（mg/L）--1 011 0 100神經(jīng)元存活率（%）100.00±0.00 64.80±5.53**72.41±2.51##80.73±5.00##△△75.29±8.50#73.11±2.06##

2.3 HJDEE50對(duì)神經(jīng)元凋亡情況的影響:正常對(duì)照組活細(xì)胞數(shù)量約為95%；OGD模型組早期與中晚期凋亡細(xì)胞數(shù)量均顯著增加，活細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.01）。與模型組比較，HJDEE50（1mg/L）組早期和中晚期凋亡細(xì)胞均顯著減少（P＜0.01）。與HJD相比，HJDEE50對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用稍弱（P＜0.01）。詳見(jiàn)圖1。

圖1 HJDEE50對(duì)神經(jīng)元凋亡的影響

2.4 HJDEE50對(duì)原代神經(jīng)元OGD再灌注損傷后5-LOX分布的影響:正常對(duì)照組原代皮質(zhì)神經(jīng)元處于靜息狀態(tài)時(shí)，5-LOX均勻分布于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)與突起上。OGD模型組約30%神經(jīng)元中的5-LOX轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核膜上，核染色加深，胞漿中有顆粒聚集。與模型組比較，HJDEE50組顯著抑制了5-LOX核膜轉(zhuǎn)移，使核膜轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)目下降約17%，胞漿中顆粒減少（P＜0.01）。但與HJD組相比，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。詳見(jiàn)圖2。

圖2 HJDEE50對(duì)5-LOX核膜轉(zhuǎn)移的影響

2.5 HJDEE50對(duì)原代神經(jīng)元OGD再灌注損傷后CysLTs含量的影響:正常對(duì)照組CysLTs含量為423.1± 9.15pg/ml，OGD模型組CysLTs含量顯著增加，達(dá)531.7±21.71pg/ml（P＜0.01）。與模型組比較，齊留通組、HJD組和HJDEE50組均顯著減少，CysLTs含量分別降至455.7±22.31pg/ml、444.0±17.47pg/ml和464.2± 44.67pg/ml（P＜0.05或P＜0.01）。與HJD組比較，HJDEE50組CysLTs含量無(wú)顯著差異。詳見(jiàn)圖3。

圖3 HJDEE50對(duì)CysLTs含量的影響

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，HJDEE50中指標(biāo)性成分含量顯著高于HJD，可顯著提高OGD再灌注損傷后神經(jīng)元存活率、抑制神經(jīng)元凋亡。其作用機(jī)制可能與抑制神經(jīng)元5-LOX核膜轉(zhuǎn)移、減少花生四烯酸代謝產(chǎn)物CysLTs含量，從而減輕炎癥反應(yīng)相關(guān)。

5-LOX/CysLTs通路介導(dǎo)腦缺血損傷。Ciceri等[5]發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血后，大鼠腦內(nèi)CysLTs顯著增加。通過(guò)檢查腦缺血死亡病人的腦組織，發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)5-LOX表達(dá)增加，并被激活[6]。靜息狀態(tài)時(shí)，5-LOX主要分布在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)被激活時(shí)5-LOX向核膜移位，代謝產(chǎn)物白三烯釋放增加。因此，5-LOX發(fā)生核膜轉(zhuǎn)移是其被激活的表現(xiàn)方式，并常作為藥物抗炎作用的靶點(diǎn)[7]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，原代皮質(zhì)神經(jīng)元OGD再灌注損傷后，約30%神經(jīng)元的5-LOX發(fā)生了核膜移位，CysLTs釋放增加，同時(shí)神經(jīng)元活性下降，凋亡細(xì)胞增多。HJD和HJDEE50顯著抑制神經(jīng)元5-LOX核膜移位和CysLTs釋放，增加神經(jīng)元活性，減少神經(jīng)元凋亡。上述結(jié)果提示，HJD和HJDEE50可能通過(guò)抑制5-LOX激活發(fā)揮抗神經(jīng)元OGD損傷作用。

RP-HPLC結(jié)果顯示，HJD含有7種指標(biāo)性成分，HJDEE50僅含有4種，缺少梔子苷、黃芩素和漢黃芩素，這可能與各成分在不同溶劑中的溶解度不同有關(guān)。但就指標(biāo)性成分的含量而言，HJDEE50中4種成分總含量達(dá)到55.24%，顯著高于HJD中的7種成分的總含量，表明HJDEE50具有開(kāi)發(fā)新藥的潛力。因此，研究HJDEE50對(duì)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元OGD再灌注損傷的作用，對(duì)于HJD經(jīng)典方的二次開(kāi)發(fā)工作具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯全方對(duì)缺血性腦損傷作用的強(qiáng)弱與方中主要指標(biāo)性成分小檗堿、黃芩苷、梔子苷的含量相關(guān)[8]。HJD和HJDEE50抑制神經(jīng)元OGD損傷后5-LOX激活可能與指標(biāo)性成分的作用有關(guān)。已有研究表明，黃芩苷可抑制5-LOX核膜移位、減少炎癥產(chǎn)物CysLTs生成，發(fā)揮抗腦缺血作用[9-10]。然而，HJDEE50抑制5-LOX核膜移位的具體成分和作用機(jī)制尚不清楚，需要后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)。

總之，本研究結(jié)果表明HJDEE50對(duì)大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元OGD再灌注損傷具有較好的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與5-LOX/CysLTs通路有關(guān)。

[1]Si lva BC，de Miranda AS，Rodrigues FG，et al.The 5-l ipoxygenase(5-LOX)inhibitor zi leuton reduces inf lammation and infarct size with improvement in neurological outcome fol lowing cerebral ischemia[J]. Curr Neurovasc Res，2015，12(4):398-403.

[2]Shi QJ，Wang H，Liu ZX，et al.HAMI 3379，a CysLT2R antagonist，dose and time dependent ly at tenuates brain injury and inhibits microgl ial inf lammation af ter focal cerebral ischemia in rats[J].Neuroscience，2015,291:53-69.

[3]張鵬暉，張建亭.黃連解毒湯藥理作用研究進(jìn)展[J].浙江中醫(yī)雜志，2012，47(6):458-460.

[4]黃春燕，姜莉莉，王瑋，等.RP-HPLC同時(shí)測(cè)定黃連解毒湯7種活性成分[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2011，23(11):15-19.

[5]Ciceri P，Rabuf fetti M，Monopol i A，et al.Production of leukot rienes in a model of focal cerebral ischaemia in the rat[J].Br J Pharmacol，2001，133(8): 1323-1329.

[6]Tomimoto H，Shibata M，Ihara M，et al.A comparative study on the expression of cyclooxygenase and 5-l ipoxygenase during cerebral ischemia in humans[J]. Acta Neuropathol，2002，104(6):601-607.

[7]Radmark O，and Samuelsson B.5-l ipoxygenase:regulation and possible involvement in atherosclerosis [J].Prostaglandins Other Lipid Mediat，2007，83(3): 162-174.

[8]錢智磊，李歡，朱華旭，等.黃連解毒湯中指標(biāo)性成分藥動(dòng)學(xué)與藥效學(xué)相關(guān)性的初步研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(11):122-128.

[9]涂獻(xiàn)坤，楊衛(wèi)忠，石松生，等.黃芩苷通過(guò)抑制5-脂氧合酶活性減輕大鼠腦缺血炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[J].解剖學(xué)雜志，2014，37(1):51-53.

[10]Li CT，Zhang WP，F(xiàn)ang SH，et al.Baical in at tenuates oxygen glucose deprivation induced injury by inhibiting oxidative st ress-mediated 5-lipoxygenase activation in PC12 cel ls[J].Acta Pharmacol Sin，2010，31(2):137-144.

2016-11-18

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目黃連解毒湯活性部位對(duì)體內(nèi)外神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，編號(hào)：2012ZA025

# 通訊作者：張 琦，E-mail：zhangqiwzh@163.com