蘋果醋飲料中的有機(jī)酸分析

李曦，陳倩，唐偉，仲伶俐，付成平，楊曉鳳*

1(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，四川 成都，610066) 2(中國(guó)綠色食品發(fā)展中心，北京，100081)

蘋果醋飲料中的有機(jī)酸分析

李曦1，陳倩2，唐偉2，仲伶俐1，付成平1，楊曉鳳1*

1(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，四川 成都，610066) 2(中國(guó)綠色食品發(fā)展中心，北京，100081)

建立蘋果醋飲料中9種有機(jī)酸的分離檢測(cè)方法并對(duì)20種不同品牌的蘋果醋飲料樣品進(jìn)行分析。色譜柱：Waters sunfire C18；流動(dòng)相：0.01 mol/L (NH4)2HPO4(pH 3.0)；柱溫：35 ℃；流速：0.9 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：200 nm。在優(yōu)選的色譜條件下9種有機(jī)酸(草酸、乙酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、富馬酸、馬來(lái)酸、乳酸和琥珀酸)得到良好分離，每個(gè)樣品均含有5種以上有機(jī)酸，最多可達(dá)到7種。樣品各自的有機(jī)酸總量可達(dá)到3.0～8.0 g/kg，平均含量5.6 g/kg，以檸檬酸、蘋果酸、乙酸平均含量較高，分別可達(dá)到2.66、1.7、1.1 g/L。20個(gè)樣品中只有2個(gè)樣品(原汁發(fā)酵產(chǎn)品)符合GB/T30884《蘋果醋飲料》中對(duì)總酸、乳酸、蘋果酸和檸檬酸含量的要求，絕大部分產(chǎn)品的蘋果酸和檸檬酸含量超出標(biāo)準(zhǔn)要求。

蘋果醋；有機(jī)酸；反相高效液相色譜

蘋果醋是近年興起的一種健康飲品，是以新鮮蘋果或蘋果汁為原料發(fā)酵成乙醇，然后接入醋酸菌種，兩次發(fā)酵代謝的物質(zhì)具有的酯香和蘋果汁特有的果香融合在一起，進(jìn)而調(diào)配出不同酸度的飲料[1]。市面上的蘋果醋主要有蘋果醋飲料和蘋果醋調(diào)味品2種產(chǎn)品類型。蘋果醋調(diào)味品總酸含量比蘋果醋飲料高，主要用于食品調(diào)味，國(guó)外的此類蘋果醋消費(fèi)量很大[2]。蘋果醋飲料是以蘋果醋、果汁、水為原料加入其他調(diào)味劑制成的飲料，成本低而營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，兼具調(diào)節(jié)血壓、增強(qiáng)消化功能、減肥等功效[3]，是我國(guó)20世紀(jì)90年代新起的繼碳酸飲料、飲用水、果汁和茶飲料之后的“第四代”飲料。蘋果醋飲料的酸味是其特征感官指標(biāo)，其酸味質(zhì)量體現(xiàn)在有機(jī)酸的含量和組成上。蘋果醋飲料中含有大量的有機(jī)酸，除了揮發(fā)性酸乙酸外，還含有大量乳酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、草酸、蘋果酸等不揮發(fā)酸[4]。這些有機(jī)酸決定了果醋的酸味質(zhì)量，尤其是蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸能夠緩沖乙酸的刺激性，使其酸味更加柔和、醇厚，并賦予特色的酸味[5-6]，這對(duì)于風(fēng)味較淡的蘋果醋產(chǎn)品質(zhì)量尤為重要。

有機(jī)酸組成和含量決定了蘋果醋飲料的口感和營(yíng)養(yǎng)，為了了解市場(chǎng)上的蘋果醋飲料的酸味質(zhì)量，作者對(duì)市面上20種不同品牌蘋果醋中的9種有機(jī)酸進(jìn)行了檢測(cè)，包括草酸、乙酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、富馬酸、馬來(lái)酸、乳酸和琥珀酸。目前測(cè)定有機(jī)酸的方法有氣相色譜法、液相色譜法、離子色譜法等。氣相色譜法需衍生處理，操作繁瑣，準(zhǔn)確度較低；離子色譜法多采用稀強(qiáng)酸，如稀鹽酸和稀硫酸作淋洗液，對(duì)設(shè)備有一定腐蝕作用[8-9]。本文采用高效液相色譜法分析有機(jī)酸可以克服上述不足之處，并可同時(shí)檢測(cè)多種有機(jī)酸，操作簡(jiǎn)易重復(fù)性強(qiáng)。趙芳等[10]用高效液相色譜方法對(duì)蘋果醋中的5種有機(jī)酸進(jìn)行分析，分析的有機(jī)酸種類較少且分析時(shí)間長(zhǎng)(14 min)，并且檸檬酸分離度不佳；李俶等[11]對(duì)南酸棗及棗糕中的7種有機(jī)酸進(jìn)行分析，前處理方法較復(fù)雜，需過(guò)固相萃取小柱，且乳酸和乙酸分離度不佳；陳義倫等[12]對(duì)原汁蘋果醋中的7種有機(jī)酸進(jìn)行分析，分析時(shí)間合適(9 min)，但據(jù)樣品圖譜反映有機(jī)酸分離不佳，定量準(zhǔn)確度不高。上述及相關(guān)文獻(xiàn)都存在樣品量少，有機(jī)酸種類少，且分離度有待提高的問(wèn)題。

本文旨在建立一種簡(jiǎn)單高效的有機(jī)酸檢測(cè)方法：前處理簡(jiǎn)便、各有機(jī)酸的分離度滿足需求、總的分離時(shí)間短，以對(duì)市場(chǎng)上20種不同品牌蘋果醋飲料中的9種有機(jī)酸進(jìn)行分析，并將檢測(cè)到的有機(jī)酸結(jié)果與國(guó)標(biāo)GB/T30884《蘋果醋飲料》[7]中的有機(jī)酸指標(biāo)相比照，探究市場(chǎng)上蘋果醋飲料與標(biāo)準(zhǔn)的符合程度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

20種不同品牌的蘋果醋飲料從成都各大超市購(gòu)得。

H3PO4(色譜純)，天津科密歐化學(xué)試劑公司；(NH4)2HPO4(分析純)，阿拉丁試劑；草酸、乙酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、富馬酸、馬來(lái)酸、乳酸、琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品，德國(guó)DR公司；所有分離用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1100高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取草酸0.125 g、酒石酸0.563 g、蘋果酸1.000 g、乳酸1.000 g、乙酸1.000 g、馬來(lái)酸0.031 g、檸檬酸1.000 g、富馬酸0.031 g、琥珀酸1.000 g至25 mL容量瓶中，用超濾水定容至刻度配制成混標(biāo)儲(chǔ)備液。混標(biāo)中上述各標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為5.0、22.5、40.0、40.0、40.0、1.25、40.0、1.25、40.0 mg/mL。分別量取混標(biāo)溶液0.02、0.1、0.2、4.0、10.0 mL定容至100 mL容量瓶中，用0.45 μm濾膜過(guò)濾后，得到不同濃度的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液。

1.3.2 樣品前處理[7]

取5.00 mL蘋果醋飲料樣液于10 mL容量瓶中，加入0.2 mL 1 mol/L的H3PO4，用蒸餾水定容，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，過(guò)濾液待上機(jī)。

1.3.3 色譜條件[13]

色譜柱：Waters sunfire C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：0.01 mol/L (NH4)2HPO4，用1 mol/L H3PO4調(diào)至pH=3.0；流速：0.9 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)：200 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱選擇

對(duì)以下3種色譜柱的分離效果進(jìn)行了比較：Waters sunfire C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Thermo hypersil gold C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Agilent Zorbax SB-AQ柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。9種有機(jī)酸在上述色譜柱中都能出峰，但Thermo色譜柱分離度不佳，草酸和酒石酸不能完全分開(kāi)；Zorbax柱的分離時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，且部分峰形對(duì)稱性不好。3種色譜柱中以Agilent sunfire C18柱的分離效果最佳：各有機(jī)酸的分離度好，峰形較對(duì)稱，且出峰時(shí)間快，總的分離時(shí)間控制在10 min以內(nèi)。3種色譜柱柱子規(guī)格和填充物粒徑大小都一樣，2個(gè)C18柱具有相同的鍵合相，或因不同廠家的鍵合基質(zhì)和鍵合技術(shù)的差異導(dǎo)致性能的差異，而Zorbax SB-AQ具有親水性的表面，因而保留作用比許多傳統(tǒng)的C18色譜柱要強(qiáng)從而導(dǎo)致出峰時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。因而實(shí)驗(yàn)采用Waters sunfire C18柱對(duì)9種有機(jī)酸進(jìn)行色譜分析。

2.2 流動(dòng)相選擇

比較KH2PO4、HCl和(NH4)2HPO4作為流動(dòng)相緩沖鹽的分離效果，固定流動(dòng)相的緩沖鹽濃度為0.01 mol/L，流速為0.9 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm，Agilent sunfire C18為色譜柱，對(duì)有機(jī)酸混合標(biāo)液進(jìn)行測(cè)定，其中草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、馬來(lái)酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸的濃度分別為10、45、80、80、80、2.5、80、2.5、80 μg/mL。

圖1 不同溶劑作流動(dòng)相時(shí)的標(biāo)樣和樣品圖譜Fig.1 The chromatograms of standards and samples using different solvents as the mobile phase

結(jié)果表明，以HCl作流動(dòng)相(圖1-A)，蘋果酸、乳酸、乙酸、馬來(lái)酸、檸檬酸5 種有機(jī)酸的分離度較好，但草酸和酒石酸的分離度不好，琥珀酸和富馬酸峰形也有重疊；以KH2PO4為流動(dòng)相(圖1-B)草酸和酒石酸的分離度不佳，且馬來(lái)酸峰形有拖尾現(xiàn)象；以(NH4)2HPO4(圖1-C)作流動(dòng)相分析效果最好，各酸的分離度和峰形均滿足分離需求，9種有機(jī)酸在10 min內(nèi)出峰完畢，且以此條件對(duì)樣品1進(jìn)行分析，雜質(zhì)和有機(jī)酸也能分離開(kāi)來(lái)，能滿足檢測(cè)需求(圖1-D)。緩沖鹽的種類直接影響流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，而流動(dòng)相的離子強(qiáng)度對(duì)可解離化合物的色譜峰峰形有顯著影響，因此3種不同離子強(qiáng)度的緩沖鹽對(duì)各有機(jī)酸的分離呈現(xiàn)不同的效果[14]。由圖1可見(jiàn)三者的背景吸收有著明顯差異，(NH4)2HPO4的背景吸收是最小的，干擾最小也最靈敏的。綜合考慮，選擇(NH4)2HPO4為流動(dòng)相緩沖鹽。

2.3 流動(dòng)相pH值選擇

以0.01 mol/L的(NH4)2HPO4作為流動(dòng)相，用H3PO4調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值分別為2.0、3.0和4.0，考察流動(dòng)相pH值對(duì)混合標(biāo)液中有機(jī)酸分離的影響。結(jié)果表明，pH對(duì)分離效果的影響很大：pH為2.0時(shí)琥珀酸和富馬酸分離不佳(圖2-A)，pH為4.0時(shí)草酸和酒石酸分離不佳且琥珀酸峰丟失(圖2-B)，只有當(dāng)pH=3.0時(shí)9種有機(jī)酸分離效果最佳(見(jiàn)圖1-C)。流動(dòng)相的pH影響樣品的離子化狀態(tài)，通常流動(dòng)相的PH值必須高于或低于樣品的pKa1.5個(gè)單位，而本文所測(cè)的有機(jī)酸的pKa范圍較廣(1.2～6.2)，按此原理選擇pH值則超出了C18色譜柱的使用范圍(pH 2～8)。此外，色譜柱本身的性質(zhì)也對(duì)流動(dòng)相pH選擇有影響。色譜柱主要都是硅膠基質(zhì)，現(xiàn)有的填料處理工藝無(wú)法將硅膠上殘余的硅羥基全部去除，硅羥基會(huì)造成樣品峰拖尾，一般認(rèn)為硅羥基的pKa在3.5到4.5之間，低pH值能幫助抑制硅羥基的活性，減小拖尾，從而改善峰形，提高分離度[13]。因而在pH值為3.0時(shí)，各有機(jī)酸獲得了最佳的分離效果。

圖2 pH值為2.0(A)和4.0(B)時(shí)標(biāo)樣的色譜圖Fig.2 The chromatograms of standards at pH 2.0(A) and pH 4.0(B)

2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

本實(shí)驗(yàn)使用二極管陣列檢測(cè)器(DAD)進(jìn)行檢測(cè)，混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣后對(duì)各有機(jī)酸的DAD圖譜進(jìn)行分析：9種有機(jī)酸的吸收強(qiáng)度從191 nm到400 nm的紫外波段基本呈下降趨勢(shì)，在190到220區(qū)間下降幅度最大，因而選取195、200、205和210 nm四個(gè)波長(zhǎng)對(duì)混合標(biāo)液進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢測(cè)波長(zhǎng)越低各有機(jī)酸的吸收強(qiáng)度越高，但是基線噪音也隨之增大。因而綜合考慮選擇200 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，各有機(jī)酸吸收強(qiáng)度較高且基線噪音可接受。

2.5 線性范圍和檢出限

將不同濃度的有機(jī)酸混標(biāo)溶液從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣，確定各有機(jī)酸的保留時(shí)間，計(jì)算各自的峰面積(每個(gè)樣平行進(jìn)樣3次)。按實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制各有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以有機(jī)酸濃度(X)對(duì)色譜峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程(見(jiàn)表1)，以S/N計(jì)算檢出限。九種有機(jī)酸的峰面積和質(zhì)量濃度的相關(guān)系數(shù)都在0.994～0.999之間，在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 精密度

以圖1-C所示的混標(biāo)溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，根據(jù)所得峰面積分別計(jì)算精密度，9種有機(jī)酸的RSD范圍在1.0%～4.4% 之間，表明儀器精密度良好，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)(n=5)

2.7 方法回收率

選擇1號(hào)樣品為加標(biāo)基質(zhì)，九種有機(jī)酸的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表，回收率在83.8%～108.4%，證明該方法的準(zhǔn)確性較高，適用于蘋果醋中有機(jī)酸的檢測(cè)分析。

表3 回收率試驗(yàn)

2.8 樣品有機(jī)酸含量

使用優(yōu)選的色譜條件對(duì)20種蘋果醋飲料分別進(jìn)行檢測(cè)，得到其有機(jī)酸的含量，檢測(cè)結(jié)果如表4。

表4 蘋果醋樣品有機(jī)酸含量 單位：mg/kg

由檢測(cè)結(jié)果可以看出：

(1)20種蘋果醋飲料中檢出了7種有機(jī)酸：草酸、乙酸、檸檬酸、蘋果酸、富馬酸、馬來(lái)酸、乳酸。酒石酸和琥珀酸在實(shí)驗(yàn)所選20種蘋果醋飲料中均未能檢出。郭燕等[5]在檢測(cè)蘋果果實(shí)中的有機(jī)酸時(shí)發(fā)現(xiàn)所選品種中只有喬納金蘋果有檢出酒石酸，且含量甚微，在蘋果醋發(fā)酵過(guò)程中酒石酸含量會(huì)逐漸下降[15]，因而可能未檢出；而符笳茵等[16]在對(duì)不同品種醋中有機(jī)酸比較時(shí)也未能在蘋果醋中檢測(cè)到酒石酸和琥珀酸。4種酸(草酸、蘋果酸、乙酸和富馬酸)在20種蘋果醋飲料中均被檢測(cè)出，檸檬酸也在19種蘋果醋飲料中被檢出，其次是乳酸被檢出13次，馬來(lái)酸被檢出5次。實(shí)驗(yàn)所選的蘋果醋飲料均含有5種以上有機(jī)酸，最多可達(dá)到7種有機(jī)酸。

(2)實(shí)驗(yàn)所選20種蘋果醋飲料各自的有機(jī)酸總量可達(dá)到3.0～8.0 g/kg，平均含量5.6 g/kg。其中以檸檬酸、蘋果酸、乙酸平均含量較高，平均含量可達(dá)到2.66、1.7、1.1 g/kg。蘋果中本身就含有極高的蘋果酸，約占總酸總量90%左右[17]，而檸檬酸和乙酸則應(yīng)是蘋果酒精發(fā)酵的綜合產(chǎn)物。

(3)對(duì)照國(guó)家推薦標(biāo)準(zhǔn)GB/T30884《蘋果醋飲料》，實(shí)驗(yàn)所選20種蘋果醋飲料均符合“總酸含量≥3 g/kg”的要求，乳酸也基本符合標(biāo)準(zhǔn)中的“乳酸含量<250 mg/kg”要求。與趙芳[10]、陳義倫[12]等的研究結(jié)果一致[10,12]，大部分樣品的蘋果酸和檸檬酸含量都超出了標(biāo)準(zhǔn)的最大值范圍，蘋果酸和檸檬酸的平均含量高達(dá)1.7 g/kg及2.8 g/kg，而標(biāo)準(zhǔn)的要求為“蘋果酸含量50～1 000 mg/kg”“檸檬酸含量≤300 mg/kg”，樣品含量超出標(biāo)準(zhǔn)如此之多，可能在生產(chǎn)過(guò)程中存在人工添加的行為。20個(gè)樣品中只有2個(gè)樣品(16號(hào)和17號(hào))符合蘋果酸含量小于1 000 mg/kg、檸檬酸含量小于300 mg/kg的要求，這2個(gè)樣品標(biāo)簽標(biāo)注為蘋果原汁發(fā)酵產(chǎn)品。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)蘋果醋飲料中有機(jī)酸的檢測(cè)條件進(jìn)行了篩選，確定了以0.01 mol/L (NH4)2HPO4為流動(dòng)相(pH 3.0)，Waters sunfire C18為色譜柱，9種有機(jī)酸(草酸、乙酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、富馬酸、馬來(lái)酸、乳酸和琥珀酸)在200 nm處得到完全分離。進(jìn)而對(duì)市面上常見(jiàn)的20種蘋果醋飲料進(jìn)行了有機(jī)酸成分的分析。檢測(cè)結(jié)果顯示不同品牌蘋果醋飲料含有的有機(jī)酸種類差異不大，平均都含有5種及以上有機(jī)酸，最多可達(dá)7種。樣品各自的有機(jī)酸總量可達(dá)到3.0～8.0 g/kg，平均含量5.6 g/kg，其中以檸檬酸、蘋果酸、乙酸平均含量較高，分別可達(dá)到2.66、1.7、1.1 g/kg。而在所有20個(gè)樣品中只有2個(gè)樣品符合標(biāo)準(zhǔn)GB/T30884《蘋果醋飲料》中對(duì)總酸、乳酸、蘋果酸和檸檬酸含量的要求，絕大部分產(chǎn)品的蘋果酸和檸檬酸含量超出標(biāo)準(zhǔn)要求。

由此可見(jiàn)，市面上的蘋果醋飲料就有機(jī)酸組成上來(lái)說(shuō)差異不大，均含有較豐富的有機(jī)酸種類，而含量上蘋果酸和檸檬酸普遍過(guò)高，有可能存在人工添加的行為。蘋果醋曾經(jīng)被譽(yù)為繼碳酸飲料、飲用水、果汁和茶飲料之后的“第四代飲料”，而今發(fā)展卻良莠不齊，人均消費(fèi)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到預(yù)期，由本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，可能需要更加規(guī)范的生產(chǎn)方式和更加嚴(yán)格的市場(chǎng)監(jiān)管。

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Organic acid analysis in apple vinegar beverage

LI Xi1, CHEN Qian2, TANG Wei2, ZHONG Ling-li1,FU Cheng-ping1, YANG Xiao-feng1*

1(Analysis and Determination Center, Sichuan Acedemy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China)2(China Green Food Development Center, Beijing 100081, China)

Nine organic acids in apple vinegar beverage detecting method was established and the method was applied in 20 kinds of apple vinegar beverage. The separation was performed by 200 nm a C18column with 0.01 mol/L diammonium phosphate solution as mobile phase (pH 3.0). Nine kinds of organic acids (oxalic acid, acetic acid, citric acid, malic acid, tartaric acid, fumaric acid, maleic acid, lactic acid and succinic acid) were completely separated under this condition. Each sample contained at least 5 kinds of acids, the most is up to 7 kinds of organic acids in 20 kinds of apple vinegar beverage. Oxalic acid, malic acid, acetic acid and fumaric acid were detected in all samples. The total organic acids content of the selected apple vinegar beverage can reach 3.0-8.0 g/kg, with an average of 5.6 g/kg. Citric acid, malic acid and acetic acid are higher on average content among others, with an average content of 2.66, 1.7, 1.1 g/L respectively. Only two out of 20 samples met with national standard GB/T30884 apple vinegar beverage on the content of total acid, lactic acid, malic acid and citric acid. The malic acid content and citric acid content of the majority of product were beyond the standard requirements.

apple vinegar;organic acid; reversed phase high performance liquid chromatography

10.13995/j.cnki.11 1802/ts.201702038

碩士研究生(楊曉鳳副研究員為通訊作者，E-mail：1945004861@qq.com)。

2016-06-06，改回日期：2016-06-30