不同甜橙品種果汁中檸檬苦素含量的變化

李一兵，龔桂芝，彭祝春，王艷杰，王炯，洪棋斌

(西南大學(xué) 柑桔研究所/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，國家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶，400712)

不同甜橙品種果汁中檸檬苦素含量的變化

李一兵，龔桂芝，彭祝春，王艷杰，王炯，洪棋斌*

(西南大學(xué) 柑桔研究所/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，國家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶，400712)

為了減少檸檬苦素對(duì)橙汁品質(zhì)的影響，為橙汁加工的原料品種和加工時(shí)間選擇提供參考，對(duì)20個(gè)甜橙品種的鮮榨果汁與巴氏滅菌果汁，在7個(gè)不同成熟期，采用高效液相色譜法檢測了檸檬苦素和諾米林含量。結(jié)果表明：各成熟階段的所有測試甜橙品種的鮮榨果汁與巴氏滅菌果汁均能檢測到檸檬苦素，巴氏滅菌果汁中檸檬苦素含量更高，平均是鮮汁的約2倍；隨著果實(shí)的成熟，檸檬苦素含量總體逐步降低，到11月中旬時(shí)，試驗(yàn)甜橙品種的鮮榨果汁與巴氏滅菌果汁的檸檬苦素含量已低于人的苦味閾值，適于橙汁加工；不同甜橙品種甚至不同臍橙品種之間，檸檬苦素的含量存在明顯差異；諾米林含量與檸檬苦素含量呈現(xiàn)類似變化，但含量更低，不是導(dǎo)致橙汁苦味的主要因素。此外，短期的冷凍貯藏對(duì)檸檬苦素的含量影響不大。

甜橙汁；檸檬苦素；諾米林；后苦味

橙汁是世界上最大的果汁加工品，富含VC、類胡蘿卜素、葉酸、黃酮類化合物和類檸檬苦素、優(yōu)質(zhì)水溶性纖維等營養(yǎng)功能成分[1]。隨著我國人民生活和收入水平提高，橙汁已經(jīng)開始漸入人們的日常生活，成為最受歡迎的果汁產(chǎn)品之一[2]。

目前，我國橙汁加工的原料品種存在不少問題：原料品種熟期不配套，早熟品種缺乏，臍橙占比非常高，加工季早期的果汁酸度偏高。采用低酸甜橙品種果汁進(jìn)行調(diào)配，是解決橙汁酸度偏高的途徑之一，但酸度較低的甜橙品種，如臍橙、冰糖橙等，其果汁普遍存在明顯的“后苦”(delayed bitterness)問題，制約了這些品種的加工利用。

“后苦”通常由檸檬苦素類化合物引起，它是一類高含氧的三萜化合物，主要存在于蕓香科和楝科植物中[3-5]。在完整的果實(shí)中通常以無苦味的前體檸檬苦素A-環(huán)內(nèi)酯(1imonoateA-ring lactone，LARL)存在；榨汁或果實(shí)受到傷害后，在酸性條件下，經(jīng)檸檬苦素D-環(huán)內(nèi)酯水解酶(1imoninD-ring lactone hydrolase，LDRLase)催化作用，LARL迅速轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)烈苦味的檸檬苦素，形成“后苦”現(xiàn)象[6]。隨著果實(shí)成熟度提高，橙汁的“后苦”有逐步減輕的現(xiàn)象[7-8]，但“后苦”減輕的時(shí)間和程度以及與甜橙品種的關(guān)系目前尚無報(bào)道。

在加工過程中采用樹脂吸附、酶法分解等技術(shù)處理檸檬苦素[9-10]，是降低橙汁苦味的備選策略，但延長的加工環(huán)節(jié)增加了橙汁的成本，也影響橙汁的風(fēng)味。選取合適的品種或成熟期果實(shí)進(jìn)行加工，是解決“后苦”最有效的途徑。

本研究選擇20個(gè)早中熟甜橙品種，包括臍橙、低酸甜橙和普通甜橙，對(duì)不同成熟期果實(shí)的果汁，采用HPLC檢測檸檬苦素的含量變化，通過對(duì)不同品種和不同時(shí)期果實(shí)中的檸檬苦素差異進(jìn)行了分析評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

所有甜橙品種均采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所國家柑橘種質(zhì)重慶資源圃和國家柑橘品種改良中心育種圃，如表1所示。試驗(yàn)材料采樣從2015年10月10日起，每隔10日采樣1次，至2015年12月09日止，共采樣7次。每次均采取不同部位和方向的果實(shí)，果形較大的品種6個(gè)，果形較小的品種10個(gè)。

表1 用于檸檬苦素含量分析的20個(gè)甜橙品種

續(xù)表1

品種名稱類型采集地清家臍橙(Seikenavelorange)臍橙國家柑橘品種改良中心育種圃福本臍橙(Fukumotonavelorange)臍橙國家柑橘品種改良中心育種圃林尚臍橙選(Linshangselection)臍橙國家柑橘品種改良中心育種圃華臍珠心系(Washingtonnucellarline)臍橙國家柑橘品種改良中心育種圃紐荷爾臍橙(Newhallnavelorange)臍橙國家柑橘品種改良中心育種圃紐荷爾臍橙選(Newhallselection)臍橙國家柑橘品種改良中心育種圃眉紅臍橙(Meihongnavelorange)臍橙國家柑橘品種改良中心育種圃冰糖橙(Bingtangcheng)低酸甜橙國家柑橘品種改良中心育種圃少核新會(huì)橙(Xinhuisweetorange)低酸甜橙國家柑橘品種改良中心育種圃桃葉橙(Taoyeorange)低酸甜橙國家柑橘種質(zhì)重慶資源圃埃及一號(hào)(SuccariNucellarLine1)無酸甜橙國家柑橘品種改良中心育種圃德州甜橙(Texassweetorange)早熟甜橙國家柑橘品種改良中心育種圃哈姆林(Hamlinsweetorange)早熟甜橙國家柑橘品種改良中心育種圃早金甜橙(Earlygold)中熟甜橙國家柑橘品種改良中心育種圃甲處金兒柑(JiachuJinergan)早中熟甜橙國家柑橘品種改良中心育種圃馬賽(Marsai)中熟甜橙國家柑橘品種改良中心育種圃梨橙2號(hào)(Li2)中熟甜橙國家柑橘品種改良中心育種圃無核雪柑(WuheXuegan)中熟甜橙國家柑橘品種改良中心育種圃

1.1.2 試驗(yàn)試劑

檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品和諾米林標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC純，上海源葉生物科技公司)、色譜級(jí)的乙腈和甲醇(美國Fisher公司)、二氯甲烷(分析純)、水為超純水。

1.1.3 試驗(yàn)設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀，美國Agilent；Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；KQ5200型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-5203，上海亞榮生化儀器廠；分液漏斗。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 檸檬苦素提取

采集的甜橙果實(shí)清洗干凈后擦干，手工壓榨取汁，果汁過濾后分別取30 mL分裝到三角瓶內(nèi)，每種果汁準(zhǔn)備4份(標(biāo)注為A、B、C、D)。A果汁直接進(jìn)行提取試驗(yàn)；B果汁進(jìn)行巴氏滅菌，具體操作為微波爐加熱75 s(確保果汁溫度在85～95 ℃之間維持40 s以上)，冷卻至室溫后進(jìn)行提取試驗(yàn)；C果汁采用上述方法巴氏滅菌后冷卻，保鮮膜封口，-18 ℃凍存24 h后進(jìn)行提取試驗(yàn)；D果汁直接用保鮮膜封口，-18 ℃凍存24 h后進(jìn)行提取試驗(yàn)。

參考趙二勞等[11-15]的方法——利用超聲波提取檸檬苦素，略有改進(jìn)。具體方法如下：30 mL果汁中加入30 mL二氯甲烷，室溫下超聲處理40 min后，轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，分層后將下層的萃取液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)三角瓶內(nèi)后，收集上層液并將其反復(fù)超聲萃取3次，合并收集漏斗下層的萃取液。將收集的下層液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入1.5 mL乙腈溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC分析。

1.2.2 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品和諾米林標(biāo)準(zhǔn)品，溶解于色譜純級(jí)的乙腈中后配制濃度為1 g/L的母液。再利用母液配制500.000 0、250.000 0、125.000 0、62.500 0、31.250 0、15.625 0、3.125 0、1.562 5 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)液相色譜檢測結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 高效液相色譜法的測定條件

參照HUI等[16-19]進(jìn)行HPLC檢測。本試驗(yàn)設(shè)定的液相色譜檢測條件如下，檢測波長210 nm；進(jìn)樣量15 μL；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為水和乙腈，以流速1 mL/min進(jìn)行梯度洗脫，即0～15 min，V(水)∶V(乙腈)=70∶30；15～25 min，V(水)∶V(乙腈)=50∶50。

1.2.4 試驗(yàn)回收率和準(zhǔn)確性分析

采用加標(biāo)回收的方法對(duì)檸檬苦素提取的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證和評(píng)價(jià)。根據(jù)對(duì)加標(biāo)后的果汁中檸檬苦素含量和未加標(biāo)的果汁中檸檬苦素含量變化分析，可知本試驗(yàn)檸檬苦素的回收率為97%以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.28%。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮榨果汁中檸檬苦素的含量變化

各成熟階段的所有測試甜橙品種的鮮榨果汁均能檢測到檸檬苦素，含量隨著果實(shí)的成熟而逐漸降低，如圖1所示。

1-馬爾斯；2-特洛維塔；3-福本臍橙；4-華臍珠心系；5-林尚臍橙選；6-眉紅臍橙；7-紐荷爾臍橙；8-紐荷爾臍橙選；9-清家臍橙；10-埃及1號(hào)；11-冰糖橙；12-少核新會(huì)橙；13-桃葉橙；14-德州甜橙；15-哈姆林；16-甲處金兒柑；17-梨橙2號(hào)；18-馬賽；9-無核雪柑；20-早金甜橙圖1 不同成熟期甜橙鮮榨果汁中檸檬苦素的含量變化Fig.1 Limonin contents in fresh juice of 20 sweet orange cultivars at different mature stage

測試初期的2次分析，鮮汁中檸檬苦素的含量最高，20個(gè)樣品中最大值分別為28.71 mg/L和27.51 mg/L，最小值分別為0.74 mg/L和0.52 mg/L。從圖1可以看出，品種間的差異非常顯著。含量最高的測試品種為低酸的冰糖橙，最低的則為無核雪柑。低酸的桃葉橙中含量分別為12.73 mg/L和7.64 mg/L，無酸的埃及甜橙分別為11.91 mg/L和10.75 mg/L；7個(gè)臍橙品種平均值分別為6.42 mg/L和5.71 mg/L，已超過或接近人口感的檸檬苦素閾值；普通甜橙平均值分別為3.65 mg/L和3.59 mg/L，在20個(gè)試驗(yàn)品種中較低。

鮮汁中檸檬苦素含量的明顯降低出現(xiàn)在11月中旬，20個(gè)樣品的平均值為1.70 mg/L，已遠(yuǎn)低于人口感的檸檬苦素閾值(6 mg/L)，低酸的冰糖橙和桃葉橙以及無酸的埃及一號(hào)在所有測試品種中雖然仍比較高，其值依次為3.13，2.66和4.76 mg/L，相對(duì)于前期已顯著降低，低于人口感的檸檬苦素閾值。

2.2 巴氏滅菌果汁中檸檬苦素的含量變化

巴氏滅菌是保證果汁貯運(yùn)安全的常規(guī)而必要措施。對(duì)比分析鮮果汁和巴氏滅菌處理果汁中檸檬苦素的含量變化，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)品種的巴氏滅菌處理后果汁中檸檬苦素含量均有增加，如圖2所示。增加幅度在全部品種的所有測試點(diǎn)的平均值為2.07，即巴氏殺菌后橙汁的檸檬苦素含量平均增加2倍左右。

1-馬爾斯；2-特洛維塔；3-福本臍橙；4-華臍珠心系；5-林尚臍橙選；6-眉紅臍橙；7-紐荷爾臍橙；8-紐荷爾臍橙選；9-清家臍橙；10-埃及1號(hào)；11-冰糖橙；12-少核新會(huì)橙；13-桃葉橙；14-德州甜橙；15-哈姆林；16-甲處金兒柑；17-梨橙2號(hào)；18-馬賽；19-無核雪柑；20-早金甜橙圖2 不同成熟期甜橙巴氏滅菌果汁中檸檬苦素的含量變化Fig.2 Limonin contents in pasteurized juice of 20 sweet orange cultivars at different mature stage

增加幅度隨成熟度的增加表現(xiàn)出逐步縮小并趨于穩(wěn)定的趨勢。在測試初期，增加幅度較大，成熟后期增加幅度變小且趨于穩(wěn)定，10月10日首次測試的所有樣品的平均增加幅度為2.72，10月3次測試的所有樣品的平均增加幅度為2.36，而11月以后4次測試的平均增加幅度為1.83。

增加幅度在品種類型間也存在一定的差異。將7次測試結(jié)果進(jìn)行平均，馬爾斯甜橙果汁的增加幅度最大，達(dá)到3.37倍，其次為清家臍橙，為2.81倍；增加幅度最小的為桃葉橙和梨橙2號(hào)甜橙，分別為1.31倍和1.38倍。

臍橙果汁中檸檬苦素含量受巴氏滅菌處理的影響較大，進(jìn)行巴氏滅菌后果汁中檸檬苦素的含量平均是鮮汁中檸檬苦素含量的2.15倍，變化范圍在1.65～3.28之間。但不同臍橙品種之間表現(xiàn)明顯差異，福本臍橙和林尚臍橙選系巴氏殺菌果汁的檸檬苦素含量相對(duì)較低，相對(duì)鮮汁的增加幅度也相對(duì)較小，在11月上旬的檸檬苦素含量已分別降低到5.24 mg/L和2.14 mg/L，低于人口感的檸檬苦素閾值，可以作為臍橙品種中較適合果汁加工的品種利用。

2.3 不同甜橙品種果汁中諾米林的含量分析

諾米林是檸檬苦素類物質(zhì)合成的前體物質(zhì)，也是構(gòu)成橙汁苦味的重要成分。與檸檬苦素相比，橙汁中諾米林的含量較低，受巴氏滅菌處理的影響不大，但同樣在品種間和成熟度間差異明顯，在整個(gè)成熟過程中的變化規(guī)律和檸檬苦素相接近，表現(xiàn)為成熟早期含量相對(duì)較高，中后期快速下降，尤其在11月中旬后，其含量僅約為同時(shí)期檸檬苦素含量的1/10，對(duì)橙汁的苦味貢獻(xiàn)可以忽略不計(jì)。

測試初期的2次分析中，20個(gè)甜橙品種鮮汁中諾米林含量的平均值分別為2.86 mg/L和1.53 mg/L，是整個(gè)觀察過程中含量最高的時(shí)期。11月中旬之后，全部試驗(yàn)品種諾米林的平均值一般在0.30 mg/L左右，和同時(shí)期3 mg/L左右的檸檬苦素含量均值相比明顯偏低，其對(duì)橙汁的苦味貢獻(xiàn)基本可以忽略。

在試驗(yàn)甜橙品種間，諾米林含量表現(xiàn)出與檸檬苦素含量非常相似的變化，尤其在測試初期，檸檬苦素含量較高的低酸和無酸甜橙、臍橙，其諾米林含量也比較高。測試初期的2次分析中，諾米林含量在低酸的冰糖橙分別為7.20 mg/L和6.51 mg/L，桃葉橙分別為6.23 mg/L和4.90 mg/L，都接近同時(shí)期檸檬苦素含量的1/2，可能對(duì)冰糖橙和桃葉橙果汁的苦味也有一定的貢獻(xiàn)。

和檸檬苦素不同，諾米林含量受巴氏滅菌處理的影響不大。巴氏滅菌果汁在試驗(yàn)初期的2次分析中平均值為2.92 mg/L和1.55 mg/L，和鮮汁中含量基本保持一致。

2.4 短期冷凍貯藏對(duì)檸檬苦素含量的影響

對(duì)鮮榨果汁和巴氏滅菌果汁分別冷凍貯藏24 h后進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)檸檬苦素含量的變化與未冷凍貯藏的果汁相比變化不大。20個(gè)試驗(yàn)品種中，鮮榨果汁和冷凍貯藏24 h后果汁的檸檬苦素含量變化系數(shù)平均值為1.2，而巴氏滅菌果汁和冷凍貯藏24 h后果汁的變化系數(shù)平均值則為1.0。其中，鮮榨果汁與冷凍貯藏24 h后果汁比較中，低酸甜橙品種冰糖橙、少核新會(huì)橙和桃葉橙，以及普通甜橙中的哈姆林、早金甜橙的變化系數(shù)略偏高于平均值，約為1.5±0.2，巴氏滅菌果汁則在短期冷凍貯藏后檸檬苦素含量變化系數(shù)基本和平均值持平。大多數(shù)試驗(yàn)品種的果汁在短期冷凍貯藏后和儲(chǔ)存前檸檬苦素含量變化不大，基本持平的數(shù)據(jù)可以看作是鮮汁和巴氏滅菌果汁的試驗(yàn)重復(fù)結(jié)果，相關(guān)數(shù)據(jù)也支持了鮮汁和巴氏滅菌果汁的結(jié)論。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)所用的甜橙品種在11月中旬以后，其鮮汁和巴氏滅菌果汁檸檬苦素的含量均已達(dá)到人口感檸檬苦素閾值(6 mg/L)以下。檸檬苦素含量在降低的同時(shí)，諾米林的含量呈相同趨勢降低，而且含量非常低。文獻(xiàn)表明[20-22]，在11月中旬以后，檸檬苦素類似物在許多甜橙品種的其他部位含量是逐漸下降的，在種子中尤為明顯，其次是果皮、果肉，與本試驗(yàn)得到的結(jié)果較為一致。因此，在一般年份，11月中旬可作為臍橙和普通甜橙加工制汁的比較適宜的起始點(diǎn)。

在橙汁生產(chǎn)中一般以普通甜橙品種為加工原料，但哈姆林等早中熟普通甜橙品種在成熟季早期存在檸檬酸含量較高等問題，以低酸或無酸品種的橙汁對(duì)高酸橙汁進(jìn)行調(diào)配，可降低酸含量，也是解決橙汁酸度偏高的途徑之一[23]，但分析發(fā)現(xiàn)，酸度較低的甜橙品種，如冰糖橙、桃葉橙、臍橙等，在較早的季節(jié)，其檸檬苦素和諾米林的含量均比較高，尤其是目前產(chǎn)業(yè)中有較大栽培面積的冰糖橙和多數(shù)臍橙品種，其鮮汁和巴氏滅菌后果汁中檸檬苦素的含量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于人口感的檸檬苦素閾值，因此對(duì)其用于果汁的調(diào)配需注意檸檬苦素和諾米林的影響，以免因苦味而影響消費(fèi)者的消費(fèi)意愿。

在測試的甜橙品種中，也發(fā)現(xiàn)一些普通甜橙品種的果汁中含有的檸檬苦素含量在測試初期就比較低，隨著果實(shí)的成熟度增加，果汁中檸檬苦素的含量變化也并不顯著，如特洛維塔、少核新會(huì)橙、無核雪柑。雖然臍橙品種總體的檸檬苦素含量比較高，但福本臍橙和林尚臍橙選系巴氏殺菌果汁的檸檬苦素含量相對(duì)較低，相對(duì)鮮汁的增加幅度也相對(duì)較小，在11月上旬的檸檬苦素含量已明顯低于人口感的檸檬苦素閾值。這些普通甜橙和臍橙品種可以作為較適合果汁加工的品種利用。

果汁的“后苦”，一般認(rèn)為是在酸性條件下，檸檬苦素A-環(huán)內(nèi)酯在相關(guān)水解酶(LDRLase)作用下，迅速轉(zhuǎn)化為檸檬苦素所致。但本研究發(fā)現(xiàn)，低酸甜橙冰糖橙的鮮汁和巴氏滅菌汁的檸檬苦素的含量在20個(gè)甜橙品種中最高，無酸甜橙品種埃及一號(hào)，其鮮汁和巴氏滅菌汁的檸檬苦素含量在不同成熟階段也較高。這與酸性條件下LDRLase催化LARL迅速轉(zhuǎn)化為檸檬苦素的認(rèn)知有一定矛盾，可能LDRLase的催化作用，并不需要酸性條件支持，亦可能低酸的冰糖橙和無酸的埃及一號(hào)甜橙檸檬苦素的含量本身比較高，因此，甜橙果實(shí)的檸檬酸含量與檸檬苦素A-環(huán)內(nèi)酯轉(zhuǎn)化的關(guān)系尚有待研究。

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The analysis of limonin content change in orange juice made from different cultivars ofCitrussinensisOsbeck

LI Yi-bing, GONG Gui-zhi, PENG Zhu-chun, WANG Yan-jie, WANG Jiong, HONG Qi-bin*

(Citrus Research Institute，South West University/Chinese Academy of Agricultural Sciences，National Citrus Engineering Research Center，Chongqing 400712，China)

To avoid the negative effect of limonin on orange juice and to set a reference for the selection of sweet orange varieties and their mature stage for juice processing, the contents of limonin and nomilin in fresh juice and pasteurized juice of 20 cultivars ofCitrussinensisOsbeck at seven different mature stages were analyzed using high performance liquid chromatography. The results were as follows: Limonin can be detected in fresh juice and pasteurized juice from all sweet orange cultivars at all tested mature stage. The content of limonin in pasteurized juice is higher and about 2 times of that in the fresh juice. Along the ripening of the fruit, the content of the limonin gradually decreased. Until mid-November, the limonin content of fresh juice and pasteurized juice in most sweet orange cultivars has fallen below the bitterness threshold for common people. Therefore, mid-November is a better time for orange juice processing of most cultivars. The content of limonin existed significant differences among tested varieties of sweet orange and even among the navel orange. The change of nomilin contents was very similar to limonin, but its content is much lower than limonin and is not the main factor of juice bitterness. In addition, a short term frozen storage had little effect on limonin content change in orange juice.

orange juice；limonin；nomilin；delayed bitterness

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702034

碩士研究生(洪棋斌副研究員為通訊作者，E-mail：hongqb@sina.com)。

國家科技支撐計(jì)劃2013(BAD02B02)；重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃(cstc2014jcyjA80037)

2016-06-21，改回日期：2016-07-20