川貝母水提取物對(duì)放射性肺炎小鼠模型治療作用的研究

武彥舒，李玉潔

川貝母水提取物對(duì)放射性肺炎小鼠模型治療作用的研究

武彥舒1，李玉潔2

目的 探討川貝母水提物對(duì)放射性肺炎小鼠的治療作用。方法 60只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為治療組、陽(yáng)性藥組、空白組和模型組，治療組、陽(yáng)性藥組和模型組小鼠每天給予胸部照射(18 Gy)，照射后治療組給予川貝母水提取物(231 mg/kg)，陽(yáng)性藥組給予地塞米松(1.5 mg/kg)，空白組與模型組則給予等量生理鹽水。治療30 d后處死小鼠，取小鼠肺，部分肺組織制備勻漿，檢測(cè)其中氧化應(yīng)激指標(biāo)(MDA、SOD、GSH-Px)，炎性因子(IL-6、TNF-α、IL-12、hs-CRP)含量。其余肺組織行HE及Masson染色，分別觀察其肺泡炎發(fā)生情況及膠原沉淀情況。結(jié)果 HE與Masson染色結(jié)果顯示，空白組小鼠無(wú)肺泡炎及膠原沉積，治療組小鼠僅出現(xiàn)輕度肺泡炎及膠原沉積，模型組主要為中度及重度肺泡炎及膠原沉積，治療組小鼠肺泡炎及膠原沉積評(píng)分均明顯低于模型組。治療組肺組織IL-6、TNF-α、IL-12、hs-CRP及MDA含量均明顯低于模型組，而SOD與GSH-PX明顯高于模型組。結(jié)論 川貝母水提取物治療放射性肺炎小鼠具有較好的療效，值得進(jìn)行深入研究。

川貝母；水提取物；放射性肺炎

0 引言

放射性肺炎是胸部放射治療中常見(jiàn)的一種并發(fā)癥，如果不進(jìn)行有效治療可造成患者出現(xiàn)放射性肺纖維化，最終導(dǎo)致死亡[1]。西醫(yī)對(duì)于該疾病以預(yù)防為主，通過(guò)減少放射劑量來(lái)降低發(fā)病率，但仍不可避免肺損傷；治療方面則主要使用大劑量抗生素及糖皮質(zhì)激素等藥物，但部分患者仍存在療效不佳、不良反應(yīng)過(guò)大等諸多不足[2]。因此，優(yōu)化放射性肺炎的治療方法是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)亟需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。有報(bào)道顯示，傳統(tǒng)中醫(yī)藥對(duì)于放射性肺炎具有較好的治療效果。川貝母是祖國(guó)醫(yī)學(xué)中止咳化痰與清熱潤(rùn)肺之要藥，臨床應(yīng)用其治療呼吸系統(tǒng)疾病，但目前尚無(wú)采用川貝母治療放射性肺炎的相關(guān)報(bào)道[3]。為此，本課題組通過(guò)觀察川貝母水提取物對(duì)放射性肺炎小鼠的治療作用，為川貝母的應(yīng)用及放射性肺炎的治療藥物研發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器 APO-9型放射治療機(jī)(中國(guó)核動(dòng)力研究設(shè)計(jì)院放射儀器有限公司)，CF-109型組織包埋機(jī)(江蘇省阿爾法科技有限公司)，OL1-3型電子顯微鏡(美國(guó)奧林匹斯公司)，DP-3型石蠟切片機(jī)(日本島津公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2月齡C57BL/6雌鼠60只(SPF級(jí))，體重范圍(20±2)g，平均體重20.6 g，購(gòu)買(mǎi)于陜西省疾病控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，由西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院小鼠飼養(yǎng)室代飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)小鼠合格證編號(hào)：SCXK(陜)2015-1627。于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)期間飼料與飲水均不限制，自然光照，飼養(yǎng)溫度為室溫，濕度為55%。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作流程應(yīng)嚴(yán)格參照中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》[4]進(jìn)行。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑 川貝母水提取物浸膏購(gòu)買(mǎi)于武漢健民制藥有限公司健民醫(yī)藥研究院，批號(hào)：2015101109，根據(jù)該研究院檢測(cè)結(jié)果，本批次水提物浸膏每克相當(dāng)于8.2 g川貝母生藥，密度為1.2 g/mL。陽(yáng)性藥地塞米松購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：98110923。白介素(IL)-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)及IL-12檢測(cè)所需試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，批號(hào)分別為98079021、98672012、98027643、98110232。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)與丙二醛(MDA)檢測(cè)所需試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生科有限公司，批號(hào)分別為2015010922、2015021134、2014120341。Masson染色和HE染色所需試劑盒與抗體均購(gòu)自南京建成生物研究所，批號(hào)分別為SP2032及SP09021。

1.2 分組方法 采用文獻(xiàn)[5]中對(duì)于放射性肺炎動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的推薦分組方法，利用隨機(jī)數(shù)字表法將“1.1.2”項(xiàng)中小鼠平均分為4組：空白組、陽(yáng)性藥組、治療組及模型組，每組15只，各組均于相同條件下飼養(yǎng)。

1.3 給藥劑量的確定 按參考文獻(xiàn)中公式[6]，成人劑量(mg/kg)(體重按60 kg計(jì))=小鼠劑量(mg/kg)/12.3；結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及藥典[7-8]中川貝母水提取物的推薦成人劑量(1.13 g/d)，換算本研究中每只小鼠(體重按20 g計(jì))每天用量：1.13/60×12.3=231 mg/kg。

1.4 放射方法 根據(jù)文獻(xiàn)[9]推薦的放射性肺炎造模方法與劑量，以10%水合氯醛對(duì)各組小鼠進(jìn)行麻醉，空白組小鼠麻醉后不給予放射處理；其余組小鼠麻醉后，將四肢固定于治療床，取仰臥位，充分暴露小鼠胸部，屏蔽其腹部、頭部與四肢，調(diào)整放射機(jī)照射小鼠胸部，照射上至小鼠前肢兩腋窩中點(diǎn)，下至胸部劍突水平位置，照射視野范圍為3.0 cm×1.8 cm，小鼠全肺單次照射劑量為18 Gy，放射參數(shù)為36 MV光子，每天照射1次，連續(xù)照射30 d。

1.5 給藥方法 小鼠于每天放射處理后3 h進(jìn)行灌胃給藥，其中陽(yáng)性藥組小鼠給予地塞米松(1.5 mg/mL)，治療組小鼠給予川貝母水提取物浸膏(231 mg/kg)，空白組和模型組則給予等量生理鹽水，各組小鼠均連續(xù)給藥30 d。

1.6 血液及肺標(biāo)本處理 最后一次給藥8 h后，利用尾靜脈取血法進(jìn)行取血，取血完成后，利用頸椎脫臼法處死所有小鼠，開(kāi)胸取雙側(cè)肺，以4%多聚甲醛固定，保存至-80 ℃冰箱中待用。

1.7 檢測(cè)指標(biāo)

1.7.1 肺部勻漿氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 取“1.6”項(xiàng)小鼠右側(cè)肺一半，采用玻璃勻漿器制備肺組織勻漿液，分別采用化學(xué)比色法、黃嘌呤氧化酶法及硫代巴比妥酸比色法檢測(cè)其中GSH-Px、SOD及MDA。

1.7.2 肺部勻漿炎性因子檢測(cè) 取“1.7.1”項(xiàng)中肺部組織勻漿，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)IL-6、TNF-α及IL-12；采用超敏乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測(cè)hs-CRP。

1.8 組織病理檢查 取“1.6”項(xiàng)中剩余右側(cè)肺，采用常規(guī)HE(蘇木精-伊紅)染色，光鏡觀察各組小鼠肺部病理組織結(jié)構(gòu)。另取“1.6”項(xiàng)中左側(cè)肺，采用Masson試劑染色，光鏡觀察膠原染色情況。

采用Szapiel[10]半定量方法對(duì)HE染色進(jìn)行肺泡炎評(píng)定，利用Masson染色進(jìn)行膠原沉積評(píng)定，其中小鼠肺泡炎發(fā)生情況分為4個(gè)不同的等級(jí)：4級(jí)即重度肺泡炎，小鼠肺泡炎面積大于全顯微鏡視野面積的50%，記為4分；3級(jí)即中度肺泡炎，小鼠肺泡炎面積為全顯微鏡視野面積的20%～50%，記為3分；2級(jí)即輕度肺泡炎，小鼠肺泡炎面積小于顯微鏡全視野的20%，記為2分；1級(jí)即小鼠無(wú)肺泡炎出現(xiàn)，記為1分。肺部膠原沉積亦分為4個(gè)不同的等級(jí)：4級(jí)即重度膠原沉積，小鼠肺部膠原沉積面積大于全顯微鏡視野面積的51%，記為4分；3級(jí)即中度膠原沉積，小鼠肺部膠原沉積面積為全顯微鏡視野面積的20%～50%，記為3分；2級(jí)即輕度膠原沉積，小鼠肺部膠原沉積面積小于全顯微鏡視野面積的20%，記為2分；1級(jí)即小鼠肺部無(wú)膠原沉積，記為1分。

2 結(jié)果

2.1 肺部勻漿氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 治療后，空白組、治療組及陽(yáng)性藥組小鼠肺部勻漿中GSH-Px與SOD含量均明顯高于模型組，而MDA含量明顯低于模型組，各組分別與模型組相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠肺部勻漿氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

注：方差分析效應(yīng)量F=7.129，P=0.005<0.01。a.空白組與模型組比較，b.陽(yáng)性藥組與模型組比較，c.治療組與模型組比較，d.陽(yáng)性藥組與空白組比較，e.陽(yáng)性藥組與治療組比較，f.治療組與空白組比較

2.2 肺部勻漿炎性因子檢測(cè)結(jié)果 治療后，空白組、治療組及陽(yáng)性藥組小鼠肺部勻漿中IL-6、TNF-α、IL-12及hs-CRP含量均明顯低于模型組，各組分別與模型組相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠治療前后炎性因子含量檢測(cè)結(jié)果

注：方差分析效應(yīng)量F=8.231，P=0.001<0.01。a.空白組與模型組比較，b.陽(yáng)性藥組與模型組比較，c.治療組與模型組比較，d.陽(yáng)性藥組與空白組比較，e.陽(yáng)性藥組與治療組比較，f.治療組與空白組比較

2.3 HE染色結(jié)果 如圖1所示，空白組小鼠肺部無(wú)肺泡炎改變；陽(yáng)性藥組、治療組與模型組則出現(xiàn)不同程度的肺泡間隔增厚、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及肺泡炎改變，陽(yáng)性藥組及治療組多為輕度肺泡炎，模型組主要是中級(jí)及重級(jí)肺泡炎。空白組、陽(yáng)性藥組及治療組肺部肺泡炎評(píng)分明顯低于模型組，各組分別與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.4 Masson染色結(jié)果 如圖2顯示，空白組中無(wú)膠原沉積，陽(yáng)性藥組、治療組與模型組中則均有不同程度膠原沉積現(xiàn)象，但治療組及陽(yáng)性藥組均為輕度膠原沉積，模型組則主要為中度或重度膠原沉積?？瞻捉M、陽(yáng)性藥組及治療組小鼠肺部膠原沉積評(píng)分均明顯高于模型組，各組分別與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3 各組小鼠肺部肺泡炎評(píng)分結(jié)果

注：方差分析效應(yīng)量F=9.124，P<0.05?？瞻捉M與模型組比較，t=8.120，P<0.05；陽(yáng)性藥組與模型組比較，t=7.972，P<0.05；治療組與模型組比較，t=7.683，P<0.05；陽(yáng)性藥組與空白組比較，t=1.923，P>0.05；陽(yáng)性藥組與治療組比較，t=1.762，P>0.05；治療組與空白組比較，t=3.561，P<0.05

圖1 各組小鼠治療后肺組織HE染色圖(400×)

圖2 各組小鼠治療后肺組織Masson染色圖(400×)

組別只數(shù)HE染色評(píng)分空白組151.00±0.00陽(yáng)性藥組151.17±0.14治療組151.22±0.16模型組153.41±0.67

注：方差分析效應(yīng)量F=7.982，P<0.05?？瞻捉M與模型組比較，t=9.668，P<0.05；陽(yáng)性藥組與模型組比較，t=8.132，P<0.05；治療組與模型組比較，t=7.918，P<0.05；陽(yáng)性藥組與空白組比較，t=1.273，P>0.05；陽(yáng)性藥組與治療組比較，t=1.117，P>0.05；治療組與空白組比較，t=3.382，P<0.05

3 討論

放射性肺炎主要是免疫介導(dǎo)的胸部局部放射性反應(yīng)，其發(fā)病機(jī)制主要是射線直接作用患者DNA，導(dǎo)致機(jī)體遺傳物質(zhì)損傷，從而引起氧化應(yīng)激紊亂，間接啟動(dòng)肺部組織凋亡途徑以及局部炎癥的級(jí)聯(lián)效應(yīng)，最終導(dǎo)致肺部出現(xiàn)損傷[11]。放射性肺炎發(fā)生后，患者肺部受損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞等肺內(nèi)效應(yīng)細(xì)胞釋放多種細(xì)胞因子，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，造成其肺部膠原蛋白的大量生成與累積，最終導(dǎo)致放射性肺纖維化[12]。目前，對(duì)于放射性肺炎的治療仍無(wú)特效藥物，臨床常用的大劑量激素等治療方法極易造成嚴(yán)重的不良反應(yīng)，故尋找一種可有效防治放射性肺損傷的藥物在臨床上顯得極為重要。中藥的不良反應(yīng)一般較輕，故在放射性肺炎的治療上具有一定優(yōu)勢(shì)。川貝母是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中用于呼吸道疾病的常用藥物之一，具有止咳化痰、清熱潤(rùn)肺之功效，多用于治療與緩解干咳少痰、咯痰帶血、肺熱燥咳及陰虛勞嗽等癥狀[13]。本研究采用川貝母水提物治療放射性肺炎，為臨床該病的治療及川貝母的新藥研發(fā)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究采用C57BL/6小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停擃?lèi)型小鼠胸部照射后肺部層黏連蛋白與纖連蛋白的高表達(dá)程度優(yōu)于其他類(lèi)型小鼠，故其更易發(fā)生肺纖維化，造模成功率高，而其對(duì)放射耐受性亦較好，死亡率較低，是建立放射性肺損傷動(dòng)物模型的首選之一[14]。此外，由于放射性肺炎可逐漸發(fā)展為肺纖維化，故在對(duì)該類(lèi)型疾病治療效果的評(píng)價(jià)中，不僅需通過(guò)HE染色來(lái)判斷其肺泡炎發(fā)生情況，還應(yīng)通過(guò)Masson染色判斷膠原沉積情況來(lái)評(píng)價(jià)肺部纖維化程度[15]。本研究結(jié)果表明，治療組小鼠肺泡炎評(píng)分及膠原沉積評(píng)分均明顯低于模型組，提示川貝母水提物對(duì)放射所造成的肺泡炎及膠原沉積均具有較好的改善作用，對(duì)預(yù)防放射線可能導(dǎo)致的肺纖維化具有積極作用。與此同時(shí)，由于射線直接照射于正常肺部細(xì)胞可引起局部氧化應(yīng)激水平紊亂，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，最終可進(jìn)一步加劇組織損傷。因此，對(duì)治療后小鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎癥因子含量進(jìn)行檢測(cè)，可有效評(píng)價(jià)藥物對(duì)小鼠肺組織細(xì)胞的保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明，治療組小鼠肺組織中MDA、IL-6、TNF-α、IL-12及hs-CRP含量均明顯低于對(duì)照組，而SOD與GSH-Px含量則明顯高于對(duì)照組，提示川貝母水提物可有效改善小鼠肺組織中氧化應(yīng)激及炎癥水平，從而達(dá)到促進(jìn)疾病恢復(fù)的目的。

盡管本課題取得了較為客觀的結(jié)果，但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中仍存在諸多問(wèn)題。首先，由于本研究為初步探索性研究，故僅根據(jù)參考文獻(xiàn)中對(duì)于放射性肺炎的一般推薦分組方法，采用四組進(jìn)行研究，而未對(duì)多劑量展開(kāi)研究，后續(xù)還應(yīng)該對(duì)量效關(guān)系展開(kāi)深入研究；其次，本研究未對(duì)具體機(jī)制及相關(guān)藥效成分進(jìn)行研究；最后，本研究給藥劑量主要是由參考文獻(xiàn)及藥品說(shuō)明書(shū)中推薦劑量計(jì)算而來(lái)，是否還有其他更優(yōu)給藥劑量，還需要深入探討。

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Preventive and therapeutic effect of water extraction offritillariacirrhosaon radiation-induced lung injury in mice models

WU Yan-shu1,LI Yu-jie2

(Department of Pharmacy,Yulin Second Hospital,Yulin 719000,China;2.College of Basic Medical Sciences,Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 450046,China)

Objective To investigate the therapeutic effects offritillariacirrhosawater extraction on the mice with radiation-induced lung injury.Methods Sixty C57BL/6 mice were divided into four groups:treatment group,positive group,control group and model group.The mice in treatment group,positive group and model group were exposed to radiation of 18 Gy which was delivered to the thorax.The treatment group and positive group received water extraction offritillariacirrhosa(231 mg/kg) and hexadecadrol (1.5 mg/kg) daily after the radiation,while the control group and model group received solution physiologique.The mice were sacrificed 30 days after radiation and the lungs of mice were fixed and sectioned.The levels of MDA,SOD,GSH-Px,IL-6,TNF-α,IL-12 and hs-CRP in the pulmonary homogenate of mice were detected.The alveolitis and collagen deposition was observed by HE and Masson staining.Results HE and Masson staining showed that the lung was normal in control group and there were mild alveolar inflammatory changes and collagen deposition in treatment group and moderate changes in model group.The scores of HE and Masson in treatment group were lower than those of model group.The levels of MDA,IL-6,TNF-α,IL-12 and hs-CRP in treatment group were lower than those of model group,while the levels of SOD and GSH-PX were higher.Conclusion The water extraction offritillariacirrhosahas good effect on mice with radiation-induced lung injury and worth further research.

Fritillariacirrhosa;Water extraction;Radiation-induced lung injury

2016-08-12

1.榆林市第二醫(yī)院藥劑科，陜西 榆林 719000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046

10.14053/j.cnki.ppcr.201703005

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