ICP-MS法測(cè)定添食金屬納米顆粒后家蠶組織中的金屬含量

袁本高，張東陽(yáng)，李 龍，武國(guó)華,

(1.江蘇科技大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212018；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，農(nóng)業(yè)部蠶桑產(chǎn)品及食用昆蟲質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，江蘇 鎮(zhèn)江 212018)

ICP-MS法測(cè)定添食金屬納米顆粒后家蠶組織中的金屬含量

袁本高1，張東陽(yáng)2，李 龍2，武國(guó)華1,2

(1.江蘇科技大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212018；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，農(nóng)業(yè)部蠶桑產(chǎn)品及食用昆蟲質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，江蘇 鎮(zhèn)江 212018)

為研究添食金屬或金屬氧化物納米顆粒后家蠶體內(nèi)金屬元素含量的變化規(guī)律，建立了微波消解結(jié)合電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)測(cè)定家蠶血液、中腸和絲腺中Cu和Ti元素含量的方法。實(shí)驗(yàn)中分別給5齡3天家蠶喂食濃度為500.00 mg/L納米Cu和納米TiO2懸浮液；72 h后，剪破家蠶腹足收集家蠶血淋巴，并解剖收集中腸和絲腺。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Cu和Ti元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 95和0.999 89，兩種元素的加標(biāo)回收率均在96.6%～105.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD小于3.7%。結(jié)果表明，對(duì)于納米TiO2實(shí)驗(yàn)組，家蠶血液和絲腺中的Ti元素含量與空白組相比變化不大，而中腸的Ti元素含量明顯增加為(181.46±9.58) μg/g，約為空白組含量(63.39±6.44) μg/g的3倍(p<0.05)；在納米Cu組中，家蠶血液中的Cu元素含量有輕微的變化，而中腸和絲腺中的含量增加較多，分別為(82.73±1.72) μg/g和(3.88±0.17) μg/g，約為空白組含量(11.68±0.46) μg/g和(1.77±0.26) μg/g 的7和2倍(p<0.05)。該方法可準(zhǔn)確地檢測(cè)喂食納米顆粒后，家蠶組織中的金屬元素含量及其變化，可為進(jìn)一步研究家蠶的納米生物效應(yīng)提供有力支持。

家蠶；電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)；納米銅；納米二氧化鈦；生物效應(yīng)

納米材料是三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍(1～100 nm)或者由該尺度范圍的物質(zhì)為基本結(jié)構(gòu)單元所構(gòu)成的材料總稱。與宏觀物質(zhì)相比，納米材料因迥異的表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)和量子限域效應(yīng)等，使其具有獨(dú)特的光、電、磁、熱、力學(xué)等性能[1]，已被廣泛應(yīng)用于化妝品、服裝、食品、能源、國(guó)防、電子等領(lǐng)域[2-3]。隨著納米材料的廣泛使用，其暴露于動(dòng)物、人體和環(huán)境的概率越來越大，而這種暴露帶來的安全性問題也愈發(fā)引人重視。為了更好地了解納米材料對(duì)生物體造成的生物效應(yīng)及其作用機(jī)制，亟需對(duì)納米材料在生物體內(nèi)的分布、代謝、排泄以及累積造成的器官損傷等做出系統(tǒng)地檢測(cè)和評(píng)估，這是因?yàn)榱私饧{米材料在生物體內(nèi)不同組織中的分布是研究生物效應(yīng)的基礎(chǔ)。

目前，放射性同位素示蹤技術(shù)是研究納米材料在生物體內(nèi)分布和行為的最理想方法[4]，但由于同位素標(biāo)記的可限性，該技術(shù)不便普及使用。對(duì)于含有金屬元素的納米材料，可通過測(cè)定生物體內(nèi)和器官中特定金屬元素含量的方法來追蹤它們?cè)谏矬w內(nèi)的運(yùn)行與代謝規(guī)律。目前，檢測(cè)生物體內(nèi)金屬元素的方法主要有原子吸收光譜法(AAS)[5]、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(ICP-AES)[6]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)[7]等。其中，ICP-MS法具有進(jìn)樣量少、檢出限低、靈敏度高、線性范圍寬、檢測(cè)速度快、能同時(shí)測(cè)定多種元素等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛用于生物樣品中金屬含量的測(cè)定。

從納米材料出現(xiàn)至今，有大量關(guān)于納米材料生物效應(yīng)的研究報(bào)道，但多以哺乳動(dòng)物(如小白鼠和兔子等)作為研究模型。例如，Chen等[8]通過給小白鼠分別口腔喂食納米、微米和離子形式的金屬銅，72 h后用ICP-MS法測(cè)定其各組織中銅含量，發(fā)現(xiàn)納米銅只在血液、肝、腎組織中的含量變化較為明顯，而在其他組織中基本不吸收納米銅。Rupal等[9]研究發(fā)現(xiàn)，TiO2、ZnO和Al2O3能明顯提升小鼠紅細(xì)胞、肝、腦內(nèi)的活性氧水平，并能改變一些抗氧化酶的活性，進(jìn)而造成一系列的氧化損傷。近年來，關(guān)于哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)引發(fā)了一系列倫理道德爭(zhēng)議，而且哺乳動(dòng)物飼養(yǎng)費(fèi)用較高，不利于大批量的實(shí)驗(yàn)。為克服這些問題，人們開始尋找一些有代表性的無脊椎動(dòng)物進(jìn)行生物研究，如蚱蜢、秀麗線蟲、果蠅等，但由于它們身體體積太小，在進(jìn)行生物效應(yīng)研究時(shí)會(huì)受到一定的限制。而家蠶作為無脊椎動(dòng)物的一種，用于遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物已有百年之久，其體積相對(duì)適中，容易解剖，并能很好地分離出完整的器官。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，家蠶和哺乳動(dòng)物對(duì)一些物質(zhì)有著相同的代謝機(jī)制[10]，因此家蠶的納米材料生物效應(yīng)研究結(jié)果對(duì)哺乳動(dòng)物的研究具有一定的借鑒意義。

本工作擬采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定納米材料在家蠶組織中的含量和變化規(guī)律，希望為進(jìn)一步研究納米材料的生物效應(yīng)和作用機(jī)制提供必要的測(cè)定方法和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器和試劑

ICP-MS X Series 2型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；MARS Xpress微波消解儀：美國(guó)CEM公司產(chǎn)品；MilliQ超純水儀：法國(guó)Millipore公司產(chǎn)品； WGl-230B電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；BHW-09C恒溫加熱趕酸儀：上海博通化學(xué)科技有限公司產(chǎn)品；超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司產(chǎn)品；磁力攪拌器：德國(guó)IKA公司產(chǎn)品；電子天平：瑞士Mettler公司產(chǎn)品。

納米銅顆粒(Cu NPs)、納米二氧化鈦顆粒(TiO2NPs)：粒徑均為20 nm，合肥艾維納米科技有限公司產(chǎn)品；HNO3(電子級(jí))：阿拉丁試劑(上海)有限公司產(chǎn)品；Ti(SO4)2、CuCl2·2H2O：均為分析級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；質(zhì)譜調(diào)諧液(Li、Co、In、U濃度均為10 mg/L)：美國(guó)Thermo Fisher 公司產(chǎn)品；單元素鍺(72Ge)、鈧(45Sc)、銅(65Cu)、鈦(47Ti)標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度為1 000.00 mg/L)：阿拉丁試劑(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制 500.00 mg/L納米懸浮液的配制：分別取250.00 mg納米銅和二氧化鈦于500.00 mL超純水中，為了保證相應(yīng)的Cu和Ti元素濃度一致，經(jīng)計(jì)算分別取852.41 mg CuCl2、1 199.95 mg Ti(SO4)2，在30 ℃、100 Hz下超聲30 min，隨后機(jī)械攪拌30 min。

標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液的配制：用1%電子級(jí)硝酸作為稀釋溶液配制不同濃度梯度的Cu、Ti離子溶液，Cu濃度梯度為0、50、100、200、600 μg/L，Ti濃度梯度為0、100、200、400、800 μg/L。內(nèi)標(biāo)溶液72Ge、45Sc的濃度均為5 μg/L。

離子溶液的配制：分別取852.41 mg CuCl2、1 199.95 mg Ti(SO4)2于500 mL超純水中，在30 ℃、100 Hz下超聲30 min，隨后機(jī)械攪拌30 min。

質(zhì)譜調(diào)諧液的配制：用1%電子級(jí)硝酸稀釋濃度為10 mg/L母液，配制成1 ng/L質(zhì)譜調(diào)諧液。

1.2.2 家蠶飼養(yǎng)及染毒 供試家蠶品種為菁松×皓月，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所提供。選擇發(fā)育整齊的家蠶于蠶室常規(guī)桑葉飼養(yǎng)至5齡第3天，飼養(yǎng)溫度為(25±1) ℃，濕度為60%～70%。

用去離子水清洗桑葉，自然條件下晾干，然后分別用配制好的納米懸浮液和離子溶液均勻噴灑桑葉，自然晾干后，喂食5 齡第3天家蠶幼蟲，并以噴灑超純水的桑葉作為空白組，此后用新鮮桑葉常規(guī)飼養(yǎng)。每組50頭幼蠶，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 家蠶組織采集與處理 在喂食染毒桑葉72 h后，從各實(shí)驗(yàn)組中隨機(jī)選出30頭家蠶進(jìn)行解剖。首先通過剪破家蠶第二腹足收集家蠶血淋巴，隨后迅速解剖，收集家蠶中腸和絲腺，并在超純水中反復(fù)沖洗，去除中腸中殘留的桑葉，然后立即置于-20 ℃冰箱中，存儲(chǔ)備用。

將家蠶中腸和絲腺置于干燥箱中，于80 ℃加熱烘干48 h，并將組織磨碎。準(zhǔn)確稱取0.05 g烘干的家蠶組織樣品或量取0.50 mL家蠶血液于聚四氟乙烯消解罐中，加入5 mL硝酸，用微波消解儀中的升溫模式消解樣品，消解程序列于表1。待消解結(jié)束并冷卻至室溫后，將消解罐敞口放入恒溫加熱趕酸儀中，于146 ℃趕酸處理45 min。待冷卻至室溫后，將消解液轉(zhuǎn)移至25.00 mL 容量瓶中，并用1%稀硝酸定容。儀器正常工作條件下采用Xt標(biāo)準(zhǔn)模式檢測(cè)相應(yīng)樣品中的Cu或Ti含量，同時(shí)測(cè)定試劑空白。

表1 微波消解程序Table 1 Procedures of microwave digestion

1.2.4 金屬元素含量的計(jì)算

式中：ω1為家蠶固體組織中金屬元素的含量(μg/g)；ω2為家蠶血液中金屬元素含量(mg/L)；C為ICP-MS法直接測(cè)得的消解液中金屬元素濃度(μg/L)；m為固體樣品取樣量(g)；V為樣品消解溶液的定容體積(mL)；V0為血液取樣體積(μL)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.5對(duì)數(shù)據(jù)和圖表進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，SPSS 19.0軟件對(duì)樣品數(shù)據(jù)做單因素的方差分析，最小顯著性差異法(LSD)做組間數(shù)據(jù)的顯著性差異分析，當(dāng)p<0.05時(shí)認(rèn)為數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 微波消解條件的優(yōu)化

以電子級(jí)硝酸為消解體系，家蠶組織為分析樣品，對(duì)硝酸用量、微波消解最高溫度和最高溫度下微波消解的保持時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，確保消解液澄清無顆粒物，樣品中的金屬元素全部溶解在消解液中[11-13]。在優(yōu)化過程中，硝酸用量分別設(shè)定為4、5、6 mL，微波消解最高溫度分別設(shè)定為170、180 ℃，最高溫度下的保持時(shí)間分別設(shè)定為15、25 min，優(yōu)化結(jié)果列于表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在硝酸用量為5、6 mL，微波消解最高溫度為180 ℃，保持時(shí)間為25 min條件下，能得到澄清透明的消解溶液，且由ICP-MS測(cè)得的結(jié)果偏差較小，具有較好的穩(wěn)定性；其他條件下得到的消解溶液較為渾濁(含有明顯的顆粒物)，且測(cè)得的數(shù)據(jù)結(jié)果偏低、重現(xiàn)性不佳。因此，采用硝酸用量5 mL、微波消解最高溫度180 ℃、保持時(shí)間25 min對(duì)樣品進(jìn)行消解。

2.2 ICP-MS參數(shù)的優(yōu)化

在檢測(cè)樣品中金屬含量時(shí)，儀器的工作參數(shù)直接影響測(cè)定的靈敏度和精確度，因此測(cè)定前應(yīng)對(duì)儀器的工作參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，具體參數(shù)列于表3。

2.3 質(zhì)譜干擾的校正

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀主要存在質(zhì)譜型干擾和非質(zhì)譜型干擾，其中非質(zhì)譜型干擾主要指基體干擾。這一干擾主要是由高濃度的基體成分抑制分析離子流，導(dǎo)致離子強(qiáng)度降低和靈

注：*表示ICP-MS測(cè)定結(jié)果，其數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差

敏度下降造成的，此外，溶液中溶解和未溶解的固體也會(huì)產(chǎn)生一定的基體干擾[14]。目前消除基體干擾的方法主要有標(biāo)準(zhǔn)加入法、基體匹配法、同位素稀釋法、基體分離法、內(nèi)標(biāo)法等[15]，其中內(nèi)標(biāo)法是最簡(jiǎn)單有效的方法之一。然而，也有研究指出，采用同一內(nèi)標(biāo)對(duì)不同質(zhì)量數(shù)范圍的元素進(jìn)行校正，部分元素的測(cè)定結(jié)果可能產(chǎn)生更大的偏差[16]。因此，在選擇內(nèi)標(biāo)時(shí)，應(yīng)選擇電離電勢(shì)及質(zhì)量數(shù)接近被測(cè)元素的物質(zhì)來改善各種基體干擾以及儀器長(zhǎng)期穩(wěn)定性的漂移。依據(jù)內(nèi)標(biāo)選取的原則，本實(shí)驗(yàn)選用72Ge和45Sc作為內(nèi)標(biāo)測(cè)定Cu和Ti，以校正此干擾。非質(zhì)譜型干擾主要包括元素干擾和分子離子干擾，其中元素干擾主要來自同量異位素和少量的雙電荷離子，分子離子干擾主要來自等離子體和樣品基體[12]。實(shí)驗(yàn)中對(duì)Ti和Cu測(cè)定的非質(zhì)譜干擾主要是由同量異位素和多原子離子造成的。

Ti元素存在46Ti、47Ti、48Ti、49Ti、50Ti 5種同位素，其中46Ti、48Ti、50Ti 分別受同量異位素46Ca、48Ca、50V、50Cr 的干擾，而48Ti、49Ti、50Ti 又容易受到S、O和P、O等多原子離子不同程度的干擾，同時(shí)49Ti檢測(cè)過程中的背景值較高，與45Sc質(zhì)量數(shù)相差較大。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇47Ti作為最終的檢測(cè)元素確定樣品中的Ti含量，并以45Sc為內(nèi)標(biāo)。

Cu元素有63Cu和65Cu 2種同位素。由于在ICP-MS中，Ar氣作為電離氣體，使63Cu易受到Ar、Na和O、Ti等多原子離子的干擾，因此本實(shí)驗(yàn)選擇65Cu作為最終的檢測(cè)元素測(cè)定樣品中的Cu含量，并以72Ge為內(nèi)標(biāo)。

2.4 檢出限和標(biāo)準(zhǔn)曲線

在儀器優(yōu)化狀態(tài)下，各元素的檢測(cè)限是連續(xù)10次測(cè)定產(chǎn)生的信號(hào)，以3倍空白溶液信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)差作為儀器的檢出限(3δ)，其標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、線性范圍列于表4。由此可知，該檢測(cè)方法得到的Cu和Ti標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 95和0.999 89。

表4 金屬元素的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 4 Limit of detections, standard curve equations, correlation coefficients and detection limits of the metallic elements

注：*所指單位為檢測(cè)液中金屬元素濃度單位

2.5 方法的準(zhǔn)確度及精密度

2.5.1 ICP-MS法準(zhǔn)確度 為了評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度，對(duì)家蠶血液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。將血液樣品等量分成兩份，一份樣品按常規(guī)處理，另一份樣品分別加入低、中、高3種濃度的Cu和Ti元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后以相同的方式處理，在儀器優(yōu)化參數(shù)下測(cè)定，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度。同時(shí)，使用連續(xù)3天測(cè)得的結(jié)果計(jì)算日內(nèi)和日間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果列于表5。可見，ICP-MS法測(cè)定樣品中的金屬元素含量具有較高的準(zhǔn)確度。

表5 ICP-MS法測(cè)定Cu和Ti元素的準(zhǔn)確度和回收率Table 5 Accuracy and recoveries of Cu and Ti elements by ICP-MS

注：*所指單位為實(shí)際樣品中金屬元素濃度單位

2.5.2 MD-ICP-MS法的精密度及重現(xiàn)性

為了驗(yàn)證MD-ICP-MS法的精密度及重現(xiàn)性，平行稱取8份樣品，進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)，對(duì)每份樣品的消解液進(jìn)行8次測(cè)量。本方法在檢測(cè)Cu元素時(shí)，所得結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2.0%～3.7%之間，而Ti元素的RSD在1.0%～2.6%之間，說明該方法具有良好的精密度和重現(xiàn)性。

2.6 喂食納米顆粒后家蠶各組織中金屬元素的含量變化

2.6.1 添食TiO2納米顆粒和Ti(SO4)2溶液

分別將納米TiO2顆粒懸浮液和Ti(SO4)2溶液噴灑于桑葉上，晾干后喂食5齡3天家蠶幼蟲，按1.2.3節(jié)方法采集家蠶血液、中腸和絲腺，然后測(cè)定Ti元素含量，結(jié)果示于圖1?？梢姡倚Q大多數(shù)組織中的Ti元素含量出現(xiàn)了不同程度的變化。家蠶血液中的Ti元素含量分布示于圖1a，可見，喂食Ti(SO4)2溶液后，家蠶血液中的Ti元素含量(3.77±0.25) mg/L，與空白組含量(3.97±0.08) mg/L相比沒有顯著變化(p>0.05)，而添食TiO2納米組家蠶血液中的Ti元素含量為(3.28±0.05) mg/L，與空白組和離子組相比略有下降(p<0.01)。家蠶中腸中的Ti元素含量分布示于圖1b，可見，在喂食相應(yīng)物質(zhì)后，納米組和離子組家蠶中腸的Ti元素含量分別為(181.46±9.58) μg/g和(646.06±25.51) μg/g，與空白組含量(63.39±6.44) μg/g相比均有明顯的增加(p<0.001)，分別為空白組的3倍和10倍左右，即納米組與離子組中腸中的Ti元素含量比約為1∶3 。家蠶絲腺中的Ti元素含量分布示于圖1c，可看出，離子組家蠶絲腺中的Ti元素含量與空白組相比有明顯提升(p<0.01)，分別為(17.68±1.45) μg/g和(13.63±0.57) μg/g，增加了30%左右，而納米組家蠶絲腺中的Ti元素含量為(13.14±0.30) μg/g，與空白組相比并沒有明顯的變化(p>0.05)。上述結(jié)果表明，家蠶在攝食兩種形態(tài)Ti后，組織中的Ti元素含量均發(fā)生了不同程度的變化，且與Ti(SO4)2溶液相比，TiO2顆粒更不易被家蠶絲腺等組織吸收。

2.6.2 添食Cu納米顆粒和CuCl2溶液 在分別給5齡3天家蠶幼蟲喂食噴灑有納米Cu懸浮液和CuCl2溶液的桑葉后，測(cè)定家蠶血液、中腸和絲腺中的Cu元素含量，結(jié)果示于圖2。可見，家蠶各組織中的Cu元素含量均出現(xiàn)了不同程度的變化。家蠶血液中的Cu元素含量分布示于圖2a，可以看出，納米組家蠶血液中的Cu元素含量為(0.67±0.01) mg/L，與空白組含量(0.61±0.01) mg/L相比增加了10%左右(p<0.05)，而離子組家蠶血液中的Cu元素含量為(3.26±0.17) mg/L，較其它兩組有明顯的提升(p<0.05)，約為5倍。家蠶中腸中的Cu元素含量分布示于圖2b，可以發(fā)現(xiàn)，納米組和離子組家蠶中腸中的Cu元素含量分別為(82.73±1.72) μg/g和(512.67±2.02) μg/g，與空白組含量(11.68±0.46) μg/g相比均有極為顯著的提高(p<0.001)，分別為空白組的7倍和50倍左右，同時(shí)離子組與納米組相比也增加了6倍左右(p<0.001)。家蠶絲腺中的Cu元素含量分布示于圖2c，可以發(fā)現(xiàn)，在喂食相應(yīng)物質(zhì)后，納米組和離子組家蠶絲腺中的Cu元素含量分別為(3.88±0.17) μg/g和(4.05±0.09) μg/g，與空白組含量(1.77±0.26) μg/g相比均有明顯提高(p<0.001)，約為空白組的2倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種形態(tài)Cu進(jìn)入家蠶體內(nèi)后，都會(huì)引起家蠶不同組織中Cu元素含量的變化，其中變化最明顯的是家蠶中腸。當(dāng)Cu進(jìn)入到中腸以后，部分Cu會(huì)在中腸累積，也有部分Cu會(huì)進(jìn)入到家蠶的血液及其它組織中。同時(shí)也可看出，離子形態(tài)Cu較納米顆粒Cu更容易在家蠶組織及血液中吸收和累積。

注：*為兩組之間的顯著性差異，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001圖1 喂食72 h后家蠶體內(nèi)各組織中的Ti元素含量Fig.1 Concentration of Ti in the tissues of silkworm after 72 h feeding

注：*為兩組之間的顯著性差異，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001圖2 喂食72 h后家蠶體內(nèi)各組織中的Cu元素含量Fig.2 Concentration of Cu in the tissues of silkworm after 72 h feeding

通過比對(duì)兩組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在給5齡3天家蠶幼蟲喂食納米顆粒及相應(yīng)的離子溶液后，家蠶各組織中的Cu和Ti元素含量均出現(xiàn)了一定程度的變化。通過分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在添食兩種納米顆粒后，家蠶各組織中的金屬元素含量呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。雖然兩種金屬在進(jìn)入家蠶體內(nèi)后，大部分納米顆?；蛘唠x子形態(tài)的金屬都會(huì)在家蠶中腸累積或隨糞便排出體外，但兩種金屬在其它組織中的分布卻有明顯差別。由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，Cu比TiO2更容易穿過家蠶中腸進(jìn)入家蠶血液和絲腺等組織中。Zhou等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)，Cu離子能夠影響家蠶絲素蛋白構(gòu)象的改變，對(duì)形成絲素蛋白β-折疊有明顯的促進(jìn)作用；而Sinan等[19]也發(fā)現(xiàn)，這種β-折疊結(jié)構(gòu)的增加能夠改善絲素蛋白的穩(wěn)定性。因此，Cu可能是家蠶吐絲過程中必需的元素之一，它被家蠶選擇性地吸收，并利用吐絲過程調(diào)節(jié)絲素蛋白結(jié)構(gòu)，以提高其中β-折疊結(jié)構(gòu)的含量，進(jìn)而改善家蠶絲纖維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。Hao 等[20]研究也發(fā)現(xiàn)，將鯉魚暴露在含有納米ZnO或塊狀ZnO環(huán)境中一段時(shí)間后，納米ZnO更容易在鯉魚體內(nèi)累積，且主要分布在鯉魚的肝臟和鰓，而塊狀ZnO主要分布在鯉魚的腸道。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，納米組家蠶中腸中的相應(yīng)金屬元素含量是空白組的數(shù)倍。中腸作為家蠶抵制納米顆粒作用于其他組織的第一道防線，能在一定程度上減少納米顆粒的吸收和對(duì)家蠶其它組織造成的損傷。

3 結(jié)論

本研究以家蠶為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，建立了微波消?電感耦合等離子體質(zhì)譜檢測(cè)喂食納米顆粒72 h后家蠶血液、中腸和絲腺等組織中相應(yīng)金屬元素含量的方法。實(shí)驗(yàn)以Sc、Ge為內(nèi)標(biāo)對(duì)Ti和Cu含量進(jìn)行檢測(cè)，可較好地消除基質(zhì)干擾。在優(yōu)化的儀器工作條件下，兩種待測(cè)元素的加標(biāo)回收率均在96.6%～105.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于3.7%。結(jié)果表明，該方法具有準(zhǔn)確度高、精密度好、測(cè)試效率高等優(yōu)點(diǎn)，適用于檢測(cè)金屬元素在家蠶各組織中的分布，可為研究納米顆粒的生物效應(yīng)提供有效的分析方法。

應(yīng)用該方法測(cè)定添食納米材料后5齡3天家蠶血液、中腸和絲腺中的金屬元素含量，結(jié)果表明，各組織中相應(yīng)的金屬元素大多發(fā)生不同程度的變化。其中，中腸作為最先接觸納米顆粒的組織器官，有相當(dāng)量的納米顆粒殘留在其中，而大部分是經(jīng)中腸由糞便排出體外。喂食納米顆粒后，中腸中相應(yīng)的金屬含量增加明顯，因此家蠶中腸可能是納米顆粒的主要蓄積作用靶器官。此外，本實(shí)驗(yàn)采用家蠶作為研究納米材料生物效應(yīng)的模式生物，便于進(jìn)行大批量的養(yǎng)殖和實(shí)驗(yàn)研究，且實(shí)驗(yàn)周期較短，既節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本，又可消除因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的一系列倫理道德爭(zhēng)議，是較好的納米材料生物效應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究平臺(tái)。

[1] GMOSHINSKI I V, KHOTIMCHENKO S A, POPOV V O, et al. Nanomaterials and nanotechnologies：methods of analysis and control[J]. Russian Chemical Reviews, 2013, 82 (1): 48-76.

[2] ARORA S, RAJWADE J M, PAKNIKAR K M. Nanotoxicology and in vitro studies: the need of the hour[J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2012, 258: 151-165.

[3] FERREIRA A J, CEMLYN-JONES J, CORDEIRO C R. Nanoparticles, nanotechnology and pulmonary nanotoxicology[J]. Revista Portuguesa de Pneumologia, 2013, 19(1): 28-37.

[4] ZHANG Z Y, ZHAO Y L, CHAI Z F. Application of radiotracer techniques for the pharmacology and toxicology studies of nanomaterials[J]. Chinese Science Bulletin, 2009, 54(2): 173-182.

[5] D′HAESE P C, LANDEGHEM G F, LAMBERTS L V, et al. Measurement of strontium in serum, urine, bone, and soft tissues by Zeeman atomic absorption spectrometry[J]. Clinical Chemistry, 1997, 43(1): 121-128.

[6] USUDA K, KONO K, HAYASHI S, et al. Determination of reference concentrations of strontium in urine by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry[J]. Environmental Health and Preventive Medicine, 2006, 11(1): 11-16.

[7] ERIK B, DICK S, THEO N, et al. ICP-MS in drug development: high-throughput analysis of strontium and calcium in bone, tissue and plasma[J]. Bioanalysis, 2013, 5(23): 2 875-2 887.

[8] CHEN Z, MENG H, YUAN H, et al. Identification of target organs of copper nanoparticles with ICP-MS technique[J]. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, 2007, 272(3): 599-603.

[9] RUPAL S, SAIMAH S, ABHISHEK Y, et al. Effects of sub-acute exposure to TiO2, ZnO and Al2O3nanoparticles on oxidative stress and histological changes in mouse liver and brain[J]. Drug Chemical Toxicology, 2014, 37(3): 336-347.

[10]ASAMI Y, HORIE R, HAMAMOTO H, et al. Use of silkworms for identification of drug candidates having appropriate pharmacokinetics from plant sources[J]. BMC Pharmacology, 2010, 10(7): 1-6.

[11]曹璨. 微波消解-ICP-MS法測(cè)定中鏈甘油三酸酯中銅、鉛、鉻、鎳、錫[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2014，35(4)：341-346.

CAO Can. Determination of Cu, Pb, Cr, Ni and Sn in medium chain triglycerides by microwave digestion-ICP-MS[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2014, 35(4): 341-346(in Chinese).

[12]蔚亦沛，別振英，羅旭，等. 濕法消解-ICP-MS法測(cè)定煙用接裝紙中的二氧化鈦[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2015，36(1)：10-13.

WEI Yipei, BIE Zhenying, LUO Xu, et al. Determination of titanium dioxide in tipping paper by wet digestion-ICP-MS[J]. Chinese Tobacco Science, 2015, 36(1): 10-13(in Chinese).

[13]李龍，高曉陽(yáng)，陳艾亭，等. 微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定麻黃中的銅、錳、鋅、鎳[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2013，34(3)：157-162.

LI Long, GAO Xiaoyang, CHEN Aiting, et al. Determination of copper, manganese, zinc and nickel in herbal ephedrae by ICP-MS with microwave digestion[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2013, 34(3): 157-162(in Chinese).

[14]齊文啟. 環(huán)境監(jiān)測(cè)實(shí)用技術(shù)[M]. 北京：中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社，2006：207-208.

[15]搖劉鴻. ICP-MS測(cè)定鏑鐵合金中雜質(zhì)元素的分析方法研究[D]. 長(zhǎng)沙：中南大學(xué)，2007.

[16]HU J Y, WANG H Z. Determination of trace elements in super alloy by ICP-MS[J]. Mikrochimica Acta, 2001, 137(3/4): 149-155.

[17]ZHOU L, CHEN X, SHAO Z Z, et al. Effect of metallic ions on silk formation in the mulberry silkworm,Bombyxmori[J]. Journal of Physical Chemistry, 2005, 109(35): 16 937-16 945.

[18]ZHOU L, CHEN X, SHAO Z Z, et al. Copper in the silk formation process ofBombyxmorisilkworm[J]. Federation of European Biochemical Societies, 2003, 554: 337-341.

[19]SINAN K, XU Z, IHLE B, et al. Nanoconfinement controls stiffness, strength and mechanical toughness of beta-sheet crystals in silk[J]. Nature Materials, 2010, 9(4): 359-367.

[20]HAO L H, CHEN L, HAO J M, et al. Bioaccumulation and sub-acute toxicity of zinc oxide nanoparticles in juvenile carp (Cyprinuscarpio): a comparative study with its bulk counterparts[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2013, 91: 52-60.

Determination of Metal Contents in the Tissues of Silkworm after Fed with Nanoparticles Using Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry

YUAN Ben-gao1, ZHANG Dong-yang2, LI Long2, WU Guo-hua1,2

(1.SchoolofEnvironmentalandChemicalEngineering,JiangsuUniversityofScienceandTechnology,Zhenjiang212018,China; 2.LaboratoryofQuality&SafetyRiskAssessmentforSericulturalProductsandEdibleInsects,MinistryofAgriculture,SericulturalResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Zhenjiang212018,China)

With the popularity of nanomaterials, an increasing number of nanoproducts are used in our daily life, and as a result, the opportunities of exposure to nanomaterials for humans are greatly increased. Given such wide exposure of nanoparticles (NPs), the biosecurity of NPs had attracted people's attention. During the toxicological study of NPs, it is crucial important to know their distribution in animal tissues. In order to study the variation of the metallic element contents in theBombyxmoriafter feeding the metal/metal oxide NPs, a method for determination of copper and titanium in hemolymph, silk gland and midgut of the fifth-instar silkworm larvae was developed by microwave digestion-inductively coupled plasma-mass spectrometry (MD-ICP-MS). Compared with other measurement techniques, ICP-MS has many advantages, such as less sample consumption, low detection limit, high sensitivity and wide linear range. In the experiment, the 3-day-old larvae of fifth-instarBombyxmoriwere fed with mulberry leaves sprayed with the suspension of Cu NPs and TiO2NPs (at concentration of 500.00 mg/L), respectively. Seventy-two hours after treatment with the nanoparticles, the samples of the larval hemolymph, silk gland and midgut were obtained by cutting through one of the prolegs and dissecting the larvae. The samples were digested by microwave digestion with the model of Ramp to Temperature: nitric acid dosage 5 mL, maximum temperature 180 ℃, hold time 25 min, and the determination was detected by the ICP-MS under the optimum condition. In this study, the correlation coefficients for Cu and Ti are 0.999 95 and 0.999 89, respectively. The recoveries of the two elements are between 96.6% and 105.4%, and both the relative standard deviations(RSDs) are less than 3.7%. The results indicated that the contents of Ti in the hemolymph and silk gland only have a little change compared with the control group, while the content of Ti in the midgut (181.46±9.58) μg/g is about three times higher than that of the control group (63.39±6.44) μg/g for the group treated with TiO2NPs. In the group treated with Cu NPs, the Cu content in the hemolymph has no obvious change, while the contents in the midgut (82.73±1.72) μg/g and silk gland (3.88±0.17) μg/g are about two and seven times higher than that of the control group (11.68±0.46) μg/g, (1.77±0.26) μg/g, respectively. In this paper, the contents of Cu and Ti in the hemolymph, silk gland and midgut of larvae of fifth-instar silkworm had been determined accurately by MD-ICP-MS. This may provide a useful method to study the variation of the metallic element contents in the tissues ofBombyxmoriafter fed with the metal/metal oxide nanoparticles, which will support the further study of biological effects of nanoparticles on silkworm. The distribution tests of NPs based onBombyxmorican solve some problems, such as high costs and highly ethical and moral controversy. Since the metabolic mechanism ofBombyxmoriwas similar to mammal, the toxicity study of NPs onBombyxmorimight provide data support for the biological safety evaluation of NPs and method for reference to toxicity studies of other nanomaterials.

Bombyxmori; inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS); Cu NPs; TiO2NPs; biological effect

2016-03-07;

2016-07-28

江蘇特聘教授科研基金(蘇教師[2012]27)資助

袁本高(1987—)，男(漢族)，山東菏澤人，碩士研究生，化學(xué)工程專業(yè)。E-mail: yuanbengao@163.com

武國(guó)華(1963—)，男(漢族)，安徽人，研究員，從事質(zhì)譜在生物學(xué)中的應(yīng)用研究。E-mail: georgew511@hotmail.co.uk
網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-12-28；網(wǎng)絡(luò)出版地址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20161228.0924.004.html

O657.63

A

1004-2997(2017)02-0256-09

10.7538/zpxb.youxian.2016.0069