高速逆流色譜分離純化花色苷研究進展

栗瑜婉，劉清清，徐貞貞

(1中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京 100081；2中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；3西北大學化工學院，西安 710069)

高速逆流色譜分離純化花色苷研究進展

栗瑜婉1,2，劉清清1，3，徐貞貞1

(1中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京 100081；2中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；3西北大學化工學院，西安 710069)

高速逆流色譜(HSCCC)技術(shù)是一種連續(xù)高效的新型液—液分配色譜技術(shù)，本文綜述了花色苷單體的商業(yè)化現(xiàn)狀及利用逆流色譜法分離純化花色苷單體的研究進展。

高速逆流色譜；花色苷；分離純化；研究進展

花色苷是一類重要的植物化學成分，屬于多酚類化合物[1]?；ㄉ罩饕植加邗r花、水果、蔬菜和谷類豆類等植物中[2]，是一種天然水溶性色素，可以賦予植物紅、紫、藍、黑等不同的顏色[3]。據(jù)報道，現(xiàn)有27個科、72個屬植物的根、莖、葉、花和果實等器官的細胞中含有花色苷，來源十分豐富[4]。

已報道的花色素有23種，其中自然界中常見的主要有矢車菊色素(Cy)、飛燕草色素(Dp)、矮牽牛色素(Pt)、芍藥色素(Pn)、天竺葵色素(Pg)和錦葵色素(Mv)六大類[4]，自然條件下游離的花青素極少見，多以花色苷形式存在[5]。已報到的花色苷有500余種[3]。花色苷具有一定的生理活性，如改善視覺功能[6]、改善大腦功能[7]、抗肥胖癥[8]、抗糖尿病[9]、抗心血管疾病[10]和抗癌癥[11]等?；ㄉ者€可用作天然色素(歐盟食品添加劑編號E163)及功能食品添加劑等。近年來，對花色苷研究的熱點已從資源評價、定性定量、穩(wěn)定性及簡單的體外抗氧化活性分析等領(lǐng)域轉(zhuǎn)向?qū)ζ渖砘钚缘难芯?。目前，對花色苷的生理活性研究均采用花色苷單體、提取物或富含花色苷的食品在人、動物和細胞三大體系進行實驗?；谏鲜?，從天然產(chǎn)物中分離純化花色苷單體具有重要意義。

1 花色苷及其單體商業(yè)化情況概述

市售花色苷粗提取物種類及品種繁多，但商業(yè)化的花色苷單體極其有限，市售花色苷單體僅為30余種，以Cy、Dp、Pn、Mv、Pt和Pg六大類為主，其總量不足已報到花色苷單體總量的1%。目前，全球生產(chǎn)花色苷單體的公司不足10家，如挪威的“Polyphenols Laboratories”、美國“INDOFINE Chemical”和“ChromaDex”、法國“Extrasynthese”及國內(nèi)的“上海同田”等公司。其中“Polyphenols Laboratories”是全球最早也是目前規(guī)模最大的花色苷單體生產(chǎn)公司，可提供36種花色苷單體。表1羅列了市售28種花色苷單體的中文名稱、CAS號及分子式信息，其中Cy類9種、Dp類6種、Pn類5種、Mv類4種、Pn和Pg各2種，且均為非?；ㄉ铡Ｉ唐坊ㄉ諉误w種類不足極大地制約了花色苷生理功能和作用機理的相關(guān)研究，因此開展分離純化花色苷單體的工作極具重要性和挑戰(zhàn)性。

2 高速逆流色譜法制備花色苷單體研究現(xiàn)狀

高速逆流色譜法(HSCCC)是20世紀80年代初，由美國國立健康研究院的Ito和Bowman在液液分配色譜的基礎(chǔ)上研究和發(fā)展起來的一種現(xiàn)代色譜分離制備技術(shù)[12]。與傳統(tǒng)的液—固色譜相比，它的固定相和流動相都是液體，不需要固體支撐，避免了因不可逆吸附而引起的樣品損失、失活、變性等弊端，且被分離物質(zhì)與液態(tài)固定相之間能可充分接觸，使得樣品的制備量大大提高[13]。我國自1978年3月開展逆流色譜技術(shù)的相關(guān)研究，是繼美國、日本之后較早開展應(yīng)用逆流色譜的國家[14]。HSCCC具有連續(xù)、高效、制備量大等優(yōu)點，已經(jīng)被成功地應(yīng)用于花色苷的分離純化[15-16]。

2.1 溶劑體系對花色苷分離效果的影響

花色苷多具極性，因此分離純化花色苷多采用極性較強的溶劑體系，常用正丁醇(BuOH)和水作為兩項基本溶劑，同時由于花色苷在較低pH值下(pH<2)以穩(wěn)定的花色烊陽離子形式，因此溶劑體系中也常含有三氟乙酸(TFA)，三氟乙酸的溶劑濃度0.01%～0.1%不等[17-18]。研究表明，甲基叔丁基醚(MTBE)：BuOH：乙腈(ACN)：水：TFA的溶劑體系是HSCCC法分離花色苷單體的最常用溶劑體系(表2)。由于花色苷具有多樣性，溶劑體系的差異化有益于不同花色苷單體的分離純化，因此分離不同植物源花色苷時，應(yīng)針對具體的花色苷單體進行溶劑體系優(yōu)化[15，18-19]。通常，較高疏水性的溶劑體系有利于中極性的低聚花色苷及含雙糖苷的花色苷被流動相洗脫，此時單花色苷可在固定相中保留，而較低疏水性的溶劑體系可將高極性單花色苷通過流動相洗脫[15]。

表1 部分市售花色苷標準品

HSCCC溶劑體系的優(yōu)化一般通過調(diào)整系統(tǒng)中BuOH的比例、考察待分離花色苷單體在溶劑體系中的分配系數(shù)來實現(xiàn)：K值較小時目標花色苷分離效果不好，而K值較大，洗脫時間又會過長，因此通常分配系數(shù)K值在0.5～2之間可得到最適合分離溶劑體系[20]。分配系數(shù)優(yōu)化越好，花色苷分離效果越好，如Chen等[21]與Li等[20]分別從藍果忍冬及黑米糠提取物中分別分離出1種花色苷單體，純度分別為98.1% (MTBE：BuOH：ACN：水：TFA=2：2：1：5：0.01)與96.89% (MTBE：BuOH：ACN：水：TFA=2：2：1：5：0.1)；易建華等[22]采用MTBE：BuOH：ACN：水：TFA=2：2：1：5：0.01的溶劑體系從紫甘藍中分理處3種花色苷單體，雖然花色苷種類有所提升，但每種單體的純度也有所下降，僅為76.28%、45.46%和91.46%。分離花色苷種類越多，對分配系數(shù)的優(yōu)化的要求越高：Qiu等[23]利用溶劑體系MTBE：BuOH：ACN：水：TFA=1：4：1：5：0.01從紫甘薯中純化出4種花色苷單體，且4種花色苷純度顯著提高，分別為95.5%、95.0%、97.8%和96.3%；陸英等[24]利用溶劑體系MTBE：BuOH：ACN：0.2%TFA=2：5：1：6從紫甘薯(廣紫薯135)中純化得到2種花色苷單體，兩種組分純度分別為98.7%與96.8%。通過比較上述紫甘藍和紫甘薯的實驗結(jié)果，兩個研究的目標花色苷均為酰基化花色苷，且目標原料中花色苷的種類也較多，此時適當調(diào)高BuOH的比例的溶劑體系，更有利于極性較弱的?；ㄉ諉误w的分離。

2.2 其他因素對花色苷分離效果的影響

除劑體系外，儀器選擇，洗脫方式、轉(zhuǎn)向和轉(zhuǎn)速、樣品濃度、進樣方式以及柱溫等也不同程度的影響分離效果[25]。Schwarz等[16]采用經(jīng)典溶劑體系MTBE：BuOH：ACN：水=3：1：1：5(采用0.1%的TFA酸化)利用不同流速(5.0、2.5 mL/min)從黑接骨木汁中分別純化得到了cyanidin 3-glucoside與cyanidin 3，5-diglucoside。而Sheng等[26]發(fā)現(xiàn)，較快流速得到花色苷單體的分離效果較差、峰重疊較嚴重，在較低流速1.5 mL/min的流速下，從桑葚花色苷粗提物中分離出4種花色苷。此外，增加分離級數(shù)也可有效增強花色苷分離效果，如Li等[27]采用兩級HSCCC技術(shù)，從木瓜花瓣中分離純化出3種花色苷與3種花色素，且所有花色苷單體及花色素純度均高于95%。

3 結(jié)論與展望

花色苷類物質(zhì)的生理活性是近年來的研究熱點，但由于市售花色苷單體種類極其有限，極大地制約了單體的機理研究工作。由于其種類繁多，大規(guī)模制備技術(shù)存在局限性，因此進一步研究其制備技術(shù)、突破花色苷分離工作的局限性，對研究不同花色苷單體在細胞、動物等研究模型的中可能的吸收機制和作用機理，可為全面評價花色苷類物質(zhì)生理活性提供重要理論依據(jù)，因此，花色苷單體的工業(yè)化生產(chǎn)意義重大，此類產(chǎn)品的商業(yè)化價值較高，市場潛力巨大。同時，HSCCC技術(shù)在花色苷高效分離及工業(yè)化生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用，值得進一步挖掘?！?/p>

表2 近10年部分HSCCC分離純化花色苷

[1]Navas，M.J.，et al.Analysis and Antioxidant Capacity of Anthocyanin Pigments.Part IV：Extraction of Anthocyanins[J]. Critical Reviews in Analytical Chemistry，2012，42(4)：313-342.

[2]孫建霞，張燕，孫志健，等.花色苷的資源分布以及定性定量分析方法研究進展[J]. 食品科學，2009,30(5)：263-268.

[3]Escribano-Bailon，M.T.，C.Santos-Buelga，and J.C.Rivas-Gonzalo.Anthocyanins in cereals[J]. Journal of Chromatography A，2004,1054(1-2)：129-141.

[4]Bueno，J.M.，et al.Analysis and Antioxidant Capacity of Anthocyanin Pigments.Part I：General Considerations Concerning Polyphenols and Flavonoids[J]. Critical Reviews in Analytical Chemistry，2012,42(2)：102-125.

[5]孫建霞,等.花色苷的資源分布以及定性定量分析方法研究進展[J]. 食品科學，2009，30(5)：259-264.

[6]Nakaishi，H.Effects of Black Currant Anthocyanoside Intake on Dark Adaptation and VDT Work-induced Transient Refractive Alteration in Healthy Humans[J]. Alternative Medicine Review，2000,5(6)：553-563.

[7]Shukitt-Hale，B.，et al.Plum juice，but not dried plum powder，is effective in mitigating cognitive deficits in aged rats[J]. Nutrition，2009,25(5)：567-573.

[8]Titta，L.，et al.Blood orange juice inhibits fat accumulation in mice[J]. International Journal of Obesity，2010,34：578-588.

[9]Prior，R.L.，et al.Whole berries versus berry anthocyanins：interactions with dietary fat levels in the C57BL/6J mouse model of obesity[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry，2008,56(3)：647-653.

[10]Mink，P.J.，et al.Flavonoid intake and cardiovascular disease mortality：a prospective study in postmenopausal women1-4[J]. American Journal of Clinical Nutrition，2007,85(3)：895-909.

[11]Ha，U.S.Anthocyanin Induces Apoptosis of DU-145 Cells In Vitro and Inhibits Xenograft Growth of Prostate Cancer[J]. Yonsei Medical Journal，2015,56(1)：16-23.

[12]Ito，Y.and R.L.Bowman，Countercurrent chromatography：liquid-liquid partition chromatography without solid support[J]. Science，1970,167(3916)：281-283.

[13]Degenhardt，A.，et al.，Preparative isolation of anthocyanins by high-speed countercurrent chromatography and application of the color activity concept to red wine[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry，2001,48(12)：5812-8.

[14]張?zhí)煊?逆流色譜技術(shù)的開發(fā)利用和動向[J]. 國際科技交流，1988(6).

[15]Valls，J.，et al.Advanced separation methods of food anthocyanins，isoflavones and flavanols[J]. Journal of Chromatography A，2009,1216(43)：7143-7172.

[16]Schwarz，M.，et al.Application of high-speed countercurrent chromatography to the large-scale isolation of anthocyanins[J]. Biochemical Engineering Journal，2003,14(3)：179-189.

[17]尚遠宏，曾楨，田金鳳.應(yīng)用高速逆流色譜分離天然產(chǎn)物中成分的研究進展[J]. 西南民族大學學報(自然科學版)，2016，42(2)：156-161.

[18]Renault，J.H.，et al.Preparative separation of anthocyanins by gradient elution centrifugal partition chromatography[J]. Journal of Chromatography A，1997,763(1-2)：345-352.

[19]胡曉丹，孫愛東，張德權(quán).高速逆流色譜分離紫蘇葉花色素苷的研究[J]. 中藥材，2010(10)：1586-1588.

[20]Li，B.，et al.Combination of high-speed countercurrent chromatography and reversed phase C18 chromatography for large-scale isolation of cyanidin-3-O-β-d-glucoside from black rice bran extract[J]. Industrial Crops and Products，2012,37(1)：88-92.

[21]Chen，L.，et al.Isolation of cyanidin 3-glucoside from blue honeysuckle fruits by high-speed counter-current chromatography[J]. Food Chem，2014,152：386-90.

[22]易建華.高速逆流色譜分離純化紫甘藍花色苷[J]. 食品與機械，2012.

[23]Qiu，F(xiàn).，et al.Preparative isolation and purification of anthocyanins from purple sweet potato by high-speed counter-current chromatography[J]. Journal of Separation Science，2009,32(12)：2146-2151.

[24]陸英，等.高速逆流色譜制備分離紫甘薯花色苷[J]. 分析化學，2011，39(6)：851-856.

[25]曹雪麗.高速逆流色譜分離技術(shù)[M].北京：化學工業(yè)出版社，2005：39-53.

[26]Sheng，F(xiàn).，et al.Separation and identification of anthocyanin extracted from mulberry fruit and the pigment binding properties toward human serum albumin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2014,62(28)：6813-6819.

[27]Li，S.，et al.Combination of supercritical fluid extraction with counter-current chromatography to isolate anthocyanidins from the petals of Chaenomeles sinensis based on mathematical calculations[J]. Journal of Separation Science，2013,36(21-22)：3517-3526.

[28]Chen，L.，et al.Isolation of cyanidin 3-glucoside from blue honeysuckle fruits by high-speed counter-current chromatography[J]. Food Chemistry，2014(152)：386-390.

[29]Du，Q.，J.Zheng，and Y.Xu.Composition of anthocyanins in mulberry and their antioxidant activity[J]. Journal of Food Composition and Analysis，2008,21(5)：390-395.

[30]易建華，潘毛頭，朱振寶.高速逆流色譜分離純化紫甘藍花色苷[J]. 食品與機械，2012,28(6)：129-132.

[31]Sun，C.，et al.Purification and anti-tumour activity of cyanidin-3-O-glucoside from Chinese bayberry fruit[J]. Food Chemistry，2012,131(4)：1287-1294.

[32]Montilla，E.C.，et al.Anthocyanin composition of black carrot Cultivars antonina，beta sweet，deep purple，and purple haze[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011,59(7)：3385-3390.

[33]Montilla，E.C.，et al.Preparative isolation of anthocyanins from Japanese purple sweet potato varieties by high-speed countercurrent chromatography[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010,58(18)：9899-9904.

(責任編輯 李婷婷)

Research Advancements of Separation and Purification of Anthocyaninsby High Speed Counter-Current Chromatography

LI Yu-wan1，2，LIU Qing-qing1，3，XU Zhen-zhen1

(1Institute of Quality Standard & Testing Technology for Agro-products，Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Agro-food Safety and Quality，Ministry of Agriculture，Beijing 100081，China；2College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China；3College of Chemical Engineering，Northwest University，Xi’an 710069，China)

High-Speed Counter-Current Chromatography(HSCCC)is a kind of efficient productive chromatographic technique based on continous liquid-liquid partition.The research advancements of of commercial application of individual anthocyanins and separation and purification of individual anthoaynins by HSCCC were reviewed.

High-Speed Counter-Current Chromatography (HSCCC)；anthocyanin；separation and purification；research advancement

國家自然科學基金項目(項目編號：31401666)；中國農(nóng)業(yè)大學2016大學生國家創(chuàng)新項目(項目編號：201610019046)。

粟瑜琬(1997— )，女，本科生，研究方向：食品科學。

徐貞貞(1985— )，女，博士，助理研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全。