葡萄籽原花青素緩解硝基苯酚誘導的免疫毒性

萬一方，葉思言，段淑琪，杜聲杰，阮馨慰，許美玉

(北京林業(yè)大學生物科學與技術學院/林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室，北京 100083)

葡萄籽原花青素緩解硝基苯酚誘導的免疫毒性

萬一方，葉思言，段淑琪，杜聲杰，阮馨慰，許美玉

(北京林業(yè)大學生物科學與技術學院/林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室，北京 100083)

3-甲基-4-硝基苯酚(PNMC)是重要的汽車尾氣有效活性成分，對小鼠脾淋巴細胞具有免疫毒性作用。作為食物多酚類物質(zhì)，原花青素具有抑制各種毒性作用，而葡萄籽富含原花青素。用細胞活力分析和ELISA實驗，研究葡萄籽原花青素對PNMC免疫毒性影響結(jié)果表明：葡萄籽原花青素顯著抑制PNMC對脾淋巴細胞增殖的毒性作用，緩解PNMC對脾T淋巴細胞分泌白細胞介素2、4及顆粒酶B功能的損傷作用。測定OH·、SOD、GSH-Px 和MDA指標的抗氧化試驗結(jié)果表明：葡萄籽原花青素緩解PNMC對脾淋巴細胞的免疫毒性作用與其抗氧化作用具有密切關系。

葡萄籽原花青素；3-甲基-4-硝基苯酚；緩解免疫毒性；脾淋巴細胞

機動車尾氣排放已經(jīng)成為我國大中城市空氣污染的重要來源之一，柴油車尾氣顆粒的有效成分硝基苯酚類物質(zhì)PNMC，不僅可以改變大鼠血液中生化指標，降低血液中的白細胞(淋巴細胞)的數(shù)量[1]，而且對大鼠的脾臟的重量及脾T淋巴細胞的數(shù)量都具有選擇性影響[2]。脾淋巴細胞包括T細胞和B細胞，T細胞通過產(chǎn)生及釋放白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-4(IL-4)和顆粒酶B(granzyme-B)等細胞因子來發(fā)揮其免疫作用。PNMC不僅抑制小鼠脾淋巴細胞增殖，也影響脾T淋巴細胞分泌細胞因子[3]。有研究表明，具有抗氧化作用的物質(zhì)，能夠降低機動車尾氣造成的機體損害[4]。

我國葡萄資源較為豐富，而大多數(shù)的葡萄用于釀酒。工業(yè)酒的生產(chǎn)伴隨著大量的垃圾，每年生產(chǎn)出數(shù)以萬噸計釀酒葡萄廢棄物，其中主要包括葡萄皮、葡萄籽等[5-6]。大多數(shù)葡萄籽被丟棄，利用率很低，造成了極大的資源浪費[6]。葡萄籽中富含多酚類物質(zhì)，原花青素是葡萄籽中的主要多酚物質(zhì)[7]。原花青素具有很強的抗氧化作用，其自由基清除能力比維生素C和維生素E高很多[8-9]。近年來，原花青素被報道具有緩解硝基苯酚PNP誘導的生殖細胞氧化損傷等各種毒性作用[10]。因此，葡萄籽原花青素可能具有緩解硝基苯酚誘導免疫毒性的作用。研究葡萄籽原花青素對汽車尾氣活性成分誘導的免疫毒性影響，不僅為葡萄籽的有效科學利用提供理論依據(jù)，也對解決由空氣污染引起的健康問題的防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清潔級8w齡昆明雄性小鼠(軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心)；PNMC(TCI，日本)；RPMI 1640培養(yǎng)基(北京協(xié)和醫(yī)學院細胞中心)；酶標儀(BIO-RAD)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo SCIENTIFIC)；胎牛血清(Hyclone)。

1.2 方法

1.2.1 葡萄籽原花青素提取 葡萄籽粉碎后經(jīng)石油醚脫脂并干燥，準確稱取1.0 g干燥脫脂葡萄籽粉置于100 mL三角瓶中，加入20 mL pH 4.0的緩沖液，調(diào)節(jié)纖維素酶液活力至100 U/mg，45 ℃酶解1.0 h后迅速升溫至90 ℃充分滅活，1 500 r/min離心分離并保存上清液，加入70%的乙醇溶液于50 ℃水浴30 min后進行抽濾、70℃減壓蒸餾濃縮至沒有液滴滴出、濃縮物經(jīng)冷凍干燥得葡萄籽原花青素粗提物。在100 mL錐形瓶中加入5 g經(jīng)前處理好的AB-8大孔樹脂，再加入50 mL 3 mg/mL 原花青素粗提物水溶液，放入25 ℃搖床中振蕩吸附24 h(振蕩速度為160 r/min)，過濾除去未吸附的原花青素粗提物水溶液，蒸餾水沖洗過的樹脂倒入50 mL 50%的乙醇中25 ℃、160 r/min解吸24 h，濾出解析液、70 ℃減壓蒸餾濃縮至沒有液滴滴出，冷凍干燥得到葡萄籽原花青素提取物。

1.2.2 小鼠脾淋巴細胞的制備 小鼠脫頸處死，放入75%乙醇中殺菌3min。無菌狀態(tài)下取脾，置于200目篩網(wǎng)上，一邊滴加RPMI 1640完全培養(yǎng)基，一邊輕輕研磨，沖洗并收集篩網(wǎng)上脾研磨液。向脾研磨液中加入5.0mL RPMI 1640完全培養(yǎng)基均質(zhì)，離心(1 500r/min、5min)得脾細胞沉淀，取適量NH4Cl(0.8%，w/v)裂解液裂解紅細胞3min。再次離心(1 500r/min、5min)分離得細胞沉淀，用PBS緩沖液洗滌細胞沉淀2次，再用PRMI 1640完全培養(yǎng)基洗滌細胞沉淀1次，離心(1 500r/min、5min)得細胞沉淀。加入RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸脾細胞。用臺盼藍對脾細胞進行染色，活細胞計數(shù)將存活率控制在95%以上。

1.2.3 細胞活力測定 制備濃度為5×106cells/mL脾淋巴細胞懸液，向96孔板中加入脾淋巴細胞單細胞懸液100μL/well，37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。按實驗設計每孔加入100μL樣品，對照組為RPMI 1640完全培養(yǎng)基、染毒組為10-4mol/L PNMC、保護組為10-4mol/L PNMC。將加完樣的96孔細胞培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。向96孔細胞培養(yǎng)板中加入20μL/well的MTT溶液，繼續(xù)置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。小心吸棄150μL上清液，每孔加入150μL DMSO，搖床20min。將96孔細胞培養(yǎng)板于570nm波長下用酶標儀測定各孔吸光值(OD)并記錄。

1.2.4 細胞因子的測定 向96孔板中加入脾淋巴細胞單細胞懸液100μL/well，37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。然后按實驗設計每孔加入100μL樣品，其中對照組為RPMI 1640完全培養(yǎng)基、染毒組10-4mol/L PNMC、保護組為10-4mol/L PNMC+1.0μg/mL 原花青素，再置于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。收集上清液待測。按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書的方法測定上清液中各個細胞因子的含量。

1.2.5 OH·、MDA、SOD及GSH-Px水平的測定 脾淋巴細胞單細胞懸液以100μL/well的添加量加入96孔細胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。然后按實驗設計每孔加入100μL樣品，其中對照組為RPMI 1640完全培養(yǎng)基、染毒組為10-4mol/L PNMC、保護組為10-4mol/L PNMC+1.0μg/mL PC，再置于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h按照抗氧化實驗方法測定。OH·水平通過酶標儀550nm各孔吸光值(OD)確定、MDA水平通過酶標儀532nm各孔吸光值(OD)確定、SOD水平通過酶標儀450nm各孔吸光值(OD)確定、GSH-Px活性的測定包括酶促反應和顯色反應，最后酶標儀412nm測定各管吸光度值(OD)。

1.2.6 統(tǒng)計學分析 所有試驗均進行3組重復試驗，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準偏差來表示，方差分析使用SPSS軟件進行a post hoc test及Tukey’s test，P<0.05為統(tǒng)計學上顯著性差異、P<0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄籽原花青素緩解硝基苯酚對脾淋巴細胞的增殖毒性

為研究葡萄籽原花青素對PNMC誘導脾淋巴細胞增殖毒性的影響，將脾淋巴細胞分為對照組(control)、染毒劑組(PNMC)和保護組(PNMC+PC)等3個組，培養(yǎng)48h后通過MTT法檢測細胞活力。對照組為用正常培養(yǎng)基處理的細胞，染毒劑組為用10-4mol/L PNMC處理的細胞，保護組為10-4mol/L PNMC和 1.0μg/mL原花青素(PC)處理的細胞。細胞活力實驗結(jié)果顯示，單獨用PNMC處理的染毒劑組脾淋巴細胞活力明顯下降至87.60%(與對照組相比，P<0.05)，而當PNMC與PC共同處理脾淋巴細胞時，細胞活力為95.38%(與PNMC組相比，P<0.05；與對照組相比，無顯著性差異)，細胞活力下降得到顯著抑制，基本恢復到對照組的水平(圖1)。以上結(jié)果表明，葡萄籽原花青素能夠顯著抑制PNMC對小鼠脾淋巴細胞產(chǎn)生的增殖毒性作用。

圖1 葡萄籽原花青素緩解硝基苯酚 對脾淋巴細胞的增殖毒性 注：脾淋巴細胞與培養(yǎng)基(control)、PNMC(10-4mol/L)、PNMC(10-4mol/L)+ PC(1.0μg/mL)共培養(yǎng)48h，PC代表原花青素；與對照相比，*P<0.05為顯著性差異；與PNMC相比，#P<0.05為顯著性差異

2.2 葡萄籽原花青素緩解硝基苯酚干擾脾T淋巴細胞分泌細胞因子功能作用

脾臟是人體最大的免疫器官，可以調(diào)節(jié)造血功能和免疫系統(tǒng)，是機體抵御外界入侵的天然防線。脾臟中含有大量的淋巴細胞，其中脾T淋巴細胞可分泌多種細胞因子來調(diào)節(jié)免疫功能，IL-2、IL-4和granzyme-B是由脾T淋巴細胞分泌的3種重要的具有免疫調(diào)節(jié)功能的細胞因子。為研究葡萄籽原花青素是否具有緩解PNMC干擾脾T淋巴細胞分泌細胞因子功能作用，通過ELISA實驗測定細胞因子濃度來進行評估。ELISA實驗結(jié)果表明，當PNMC處理小鼠脾淋巴細胞時，顯著地降低了小鼠脾細胞分泌細胞因子IL-2、IL-4和granzyme-B的水平。對照組脾淋巴細胞分泌IL-2、IL-4和granzyme-B分別為460、32.0、432.23 pg/mL，而PNMC處理過的染毒劑組的脾細胞分泌量分別降至163、23.78、223.73 pg/ mL。 當用原花青素同時處理暴露于PNMC的脾淋巴細胞時，其分泌細胞因子IL-2、IL-4和granzyme-B的水平，又上調(diào)至364、29.61、400.96 pg/mL(圖2C)，即細胞因子分泌量下降得到抑制。以上結(jié)果表明，葡萄籽原花青素具有顯著抑制PNMC干擾脾淋巴細胞分泌細胞因子功能作用。

圖2 葡萄籽原花青素緩解硝基苯酚對脾T淋巴細胞分泌細胞因子功能損傷 注：小鼠脾淋巴細胞和培養(yǎng)基(control)、PNMC(10-4mol/L)、PNMC(10-4mol/L)+PC(1.0μg/mL)共培養(yǎng)48h，細胞分泌IL-2(A)、IL-4(B)、granzyme-B(C)的水平；與對照相比,*P<0.05為顯著性差異、**P<0.01為極顯著性差異；與PNMC相比，#P<0.05為顯著性差異

2.3 葡萄籽原花青素緩解硝基苯酚對脾淋巴細胞的氧化毒性

為了檢測葡萄籽原花青素是否可以抑制由PNMC在脾淋巴細胞引起的氧化應激作用，本研究通過檢測OH·、SOD、GSH-Px 和MDA水平來評估其抗氧化活性。抗氧化試驗結(jié)果顯示，脾淋巴細胞暴露于PNMC后，OH·和MDA含量得到顯著上升，OH·含量從660.9U/mL增加至853.3U/mL(圖3A)、MDA水平從0.53mmol/mL上升至0.60 mmol/mL(P<0.05)(圖3D)。相反地，和對照組相比，PNMC降低了脾淋巴細胞內(nèi)SOD和GSH-Px的活性，均具有顯著性。SOD活性分別降低至對照的84.3%(P<0.05)(圖3B)，GSH-Px的活性降低至對照的70.7%(P<0.05)(圖3C)。然而，當葡萄籽原花青素聯(lián)合PNMC共培養(yǎng)脾淋巴細胞后，OH·和MDA含量上升和SOD和GSH-Px活性降低得到顯著抑制。 OH·含量僅為819.9U/mL(單獨接觸PNMC組為853.3U/mL，下降具有顯著性，P<0.05，圖3A)，MDA水平由單獨接觸PNMC組的0.6 mmol/mL下調(diào)至0.5 mmol/mL(下降具有顯著性，P<0.05，圖3D)。相反地，與單獨的PNMC處理組相比，顯示聯(lián)合原花青素共培養(yǎng)后脾淋巴細胞內(nèi)抗氧化酶 SOD活性84.3%恢復至89.9%(P<0.01，圖3B)、GSH-Px活性從70.7%恢復至104.6%(P<0.05，圖3C)。以上結(jié)果表明，葡萄籽原花青素顯著緩解硝基苯酚對脾淋巴細胞的氧化毒性作用。

圖3 葡萄籽原花青素對暴露于PNMC的脾淋巴細胞內(nèi)OH·、SOD、GSH-Px 和MDA水平的影響 注：小鼠脾淋巴細胞和培養(yǎng)基(control)、PNMC(10-4mol/L)、PNMC(10-4mol/L)+PC(1.0μg/mL)共培養(yǎng)48h，細胞內(nèi)OH·(A)、SOD(B)、GSH-Px(C)、MDA(D)的水平；與對照相比,*P<0.05為顯著性差異；與PNMC相比,#P <0.05為顯著性差異

3 結(jié)論

本文研究葡萄籽原花青素對汽車尾氣有效活性成分PNMC誘導小鼠脾淋巴細胞產(chǎn)生免疫毒性影響的結(jié)果表明，葡萄籽原花青素不僅顯著緩解PNMC對小鼠脾淋巴細胞產(chǎn)生的增殖毒性，還可以緩解PNMC對脾T淋巴細胞分泌細胞因子功能的損傷，起到保護脾淋巴細胞的作用。葡萄籽原花青素對PNMC誘導的免疫毒性的抑制作用與其抗氧化性具有密切的關系。◇

[1]Arziani BA，et al.Influence of some simple phenols on biochemical and morphological indices of rat blood[J]. Georgian Med News，2010(180)：69-76.

[2]Li Q，et al.Kawada T.Effect of oral exposure to fenitrothion and 3-methyl-4-nitrophenol on splenic cell populations and histopathological alterations in spleen in Wistar rats[J]. Hum Exp Toxicol，2011，30(7)：665-667.

[3]Yang LB，Ma SH，Wan YF，et al.In vitro effect of 4-pentylphenol and 3-methyl-4-nitrophenol on murine splenic lymphocyte populations and cytokine/granzyme production[J/OL].Journal of Immunotoxicology，2016.

[4]Yin XJ，Ma JY，Antonini JM，et al.Roles of reactive oxygen species and heme oxygenase-1 in modulation of alveolar macrophage-mediated pulmonary immune responses to Listeria monocytogenes by diesel exhaust particles[J]. Toxicol Sci，2004，82(1)：143-153.

[5]薛雯，房玉林，袁照程.葡萄廢棄物的開發(fā)利用及葡萄循環(huán)經(jīng)濟研究概況[J]. 西北林學院學報，2013，28(6)：253-259.

[6]高璐，王瀅，饒勝其，等.葡萄籽原花青素提取物對衰老模型小鼠抗氧化作用[J].食品科學，2014，35(23)：253-256.

[7]李豆，王珊珊.葡萄籽中原花青素的提取及應用現(xiàn)狀[J]. 生物技術進展，2015(5)：335-339.

[8]Bagchi D，Garg A，Krohn RL.et al.Oxygen free radical scavenging abilities of vitamins C and E，and a grape seed proanthocyanidin extract in vitro[J]. Res Commun Mol Pathol Pharmacol，1997，95(2)：179-189.

[9]Bagchi D，et al.Free radicals and grape seed proanthocyanidin extract：importance in human health and disease prevention[J]. Toxicology，2000，148(2-3)：187-197.

[10]涂瓏瓏.槲皮素和原花青素對4-硝基酚誘導的小鼠生精細胞損傷的緩解作用[D]. 杭州：浙江大學，2013.

(責任編輯 李婷婷)

Grape Seed Proanthocyanidin Attenuates Immunotoxicity Induced by Nitrophenol

WAN Yi-fang，YE Si-yan，DUAN Shu-qi，DU Sheng-jie，RUAN Xin-wei，XU Mei-yu

(College of Biological Science and Technology，Beijing Forestry University / Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety，Beijing 100083，China)

3-methyl-4-nitrophenol (PNMC)，as a kind of important component of vehicle emissions，has been shown to confer toxicity in splenocytes.Proanthocyanidin，as a dietary polyphenols, has been shown to confer inhibitory activity against a variety of toxins，and grape seed is rich in proanthocyanidins.The effects of grape seed proanthocyanidin on immunotoxicity induced by PNMC in murine splenic lymphocytes were investigated by Cell Viability Assay and ELISA，and the results showed that grape seed proanthocyanidin significantly enhanced proliferation of splenocytes exposed to PNMC，as well as the production of T cell-related cytokines and granzymes includinginterleukin-2，interleukin-4，andgranzyme-Bin the cells exposed to PNMC.These effects were associated with a decrease in oxidative stress，as evidenced by changes in OH·，SOD，GSH-Px，and MDA levels.

grape seed proanthocyanidin；3-methyl-4-nitropheno(PNMC)；attenuates immunotoxicity；splenic lymphocyte

北京林業(yè)大學“北京市大學生科學研究與創(chuàng)業(yè)行動計劃”(項目編號：S201510022036)；北京市自然科學基金(項目編號：8142029)。

萬一方(1996— )，女，本科生，研究方向：食品科學與工程。

許美玉(1965— )，女，副教授，研究方向：食品免疫與功能性食品。