斯氏艾美耳球蟲感染兔血常規(guī)及肝臟功能分析

(南通大學(xué)實驗動物中心，江蘇南通226001)

斯氏艾美耳球蟲感染兔血常規(guī)及肝臟功能分析

宋鴻雁，景瑾，蔣熒梅，邵義祥

(南通大學(xué)實驗動物中心，江蘇南通226001)

為了對斯氏艾美耳球蟲感染兔的血常規(guī)、肝功能和凝血4項進行檢測分析。通過孢子化的斯氏艾美耳球蟲卵囊口服接種的途徑感染8只2月齡的無球蟲新西蘭兔，8只不感染的設(shè)為陰性對照組。感染30 d后，心臟采血采集血液樣本，測量血常規(guī)、肝功能和凝血4項等血液指標。血液檢測結(jié)果顯示，與肝功能相關(guān)的8項指標中，僅有谷氨酰肽轉(zhuǎn)移酶、血清膽堿酯酶差異顯著，其余均差異極顯著，血常規(guī)和凝血4項亦差異極顯著。表明兔感染斯氏艾美耳球蟲1個月后肝功能嚴重受損。

斯氏艾美耳球蟲;新西蘭兔;血常規(guī);肝功能;凝血4項

兔是主要的經(jīng)濟動物，也是重要的實驗動物之一，其質(zhì)量關(guān)系到以兔為實驗對象的生物醫(yī)學(xué)研究結(jié)果、生物醫(yī)藥產(chǎn)品安全性評價結(jié)果的準確性、可靠性，也影響到兔相關(guān)制品的質(zhì)量和安全性。然而兔球蟲病嚴重影響家兔的生長和健康，是養(yǎng)兔業(yè)發(fā)展的巨大威脅。據(jù)文獻報道，實驗兔普遍感染球蟲，宋鴻雁等［1］對幾個主要實驗兔供應(yīng)基地進行了流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示，被調(diào)查的實驗兔場球蟲感染率為100%，且均為混合感染。

斯氏艾美耳球蟲(E．stiedai)是目前發(fā)現(xiàn)的兔球蟲中致病力強、危害大的一種球蟲，主要侵害兔肝臟膽管上皮細胞，引起嚴重的肝球蟲病，在臨床上以腹瀉、生長緩慢、消瘦為主要特征，甚至造成兔大批死亡。肝臟具有新陳代謝、合成蛋白、生物轉(zhuǎn)化等重要功能，是機體最大的解毒器官，肝臟一旦病變會造成一系列嚴重的影響。

本試驗通過孢子化的斯氏艾美耳球蟲卵囊口服感染無球蟲新西蘭兔，分析比較未感染斯氏艾美耳球蟲的新西蘭兔和感染的新西蘭兔血常規(guī)、肝功能和凝血4項等血液指標，來研究斯氏艾美耳球蟲對兔的致病性，為探索兔球蟲病的診斷與預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實驗動物普通級新西蘭兔16只，雌雄不拘，2月齡，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供，實驗動物使用許可證號:SYXK(蘇)2012－0030，飼養(yǎng)在南通大學(xué)實驗動物中心標準化的代養(yǎng)觀察室內(nèi)，飼養(yǎng)籠具全部經(jīng)火焰噴燒處理(單籠飼養(yǎng))，自由采食飲水。

1．2 主要儀器全自動血細胞分析儀(950FS)，美國Drew Scientific公司生產(chǎn);全自動生化分析儀(日立7600型)，珠式會社日立高新技術(shù)生產(chǎn);MC-4000全自動血凝分析儀，德國美創(chuàng)生產(chǎn)。

1．3 無球蟲兔的培育健康的兩月齡的新西蘭兔16只，在飲水中加入地克珠利、鹽酸氯苯胍等抗球蟲藥物，自由采食和飲水。每天收集兔糞，用飽和食鹽水漂浮法檢查球蟲卵囊，直至查不到卵囊為止。停藥4周后，再檢查球蟲卵囊，連查1周，均沒有檢測到卵囊為無球蟲兔。

1．4 實驗兔的感染8只新西蘭兔經(jīng)口接種斯氏艾美耳球蟲孢子化卵囊1×105/只，8只陰性對照兔在相鄰房間按相同條件飼養(yǎng)，接種1周后，每天檢測糞便，直至發(fā)現(xiàn)卵囊。

1．5 全血的采集接種30 d后，心臟采血法每只兔子采血6 mL，其中2 mL EDTAK2抗凝檢測血常規(guī);2 mL肝素抗凝檢測肝功能;2 mL枸櫞酸鈉抗凝檢測凝血4項。

1．6 實驗兔血液指標檢測2 mL EDTAK2抗凝的全血，經(jīng)全自動血細胞分析儀測定白細胞(WBC)、淋巴細胞(LY)、嗜酸性粒細胞(EOS)、血小板(PLT)等血常規(guī)指標。2 mL肝素抗凝的全血經(jīng)全自動生化分析儀測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血清白蛋白(ALB)、總膽紅素(TBIL)、乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(ALP)、谷氨酰肽轉(zhuǎn)移酶(GGT)、血清膽堿酯酶(ChE)等肝功能指標的含量。2 mL枸櫞酸鈉抗凝的全血經(jīng)全自動血凝儀測定凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)、纖維蛋白原(FIB)。

1．7 數(shù)據(jù)處理分析所有試驗計量數(shù)據(jù)均采用STATA V 10．0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理。數(shù)據(jù)結(jié)果用珔X±SD表示，對照組與試驗組的樣本均數(shù)比較采用配對t檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 血常規(guī)檢測結(jié)果與陰性對照組相比，WBC、LY、EOS在感染斯氏艾美耳球蟲的實驗兔的外周血中含量極顯著高于對照組的實驗兔，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01);PLT的含量則極顯著低于對照組的實驗兔，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01)，見表1。

表1 對照組和感染組實驗兔血常規(guī)指標

表1 對照組和感染組實驗兔血常規(guī)指標

注:與對照組相比，*P＜0．05，＊＊P＜0．01，下表同

2．2 肝功能檢測結(jié)果與陰性對照組相比，ALT、AST、T-BIL、LDH、ALP在感染斯氏艾美耳球蟲的實驗兔的外周血中含量極顯著高于對照組的實驗兔，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01);GGT的含量顯著高于對照組的實驗兔，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05); ALB的含量極顯著低于對照組的實驗兔，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01);ChE的含量顯著低于對照組的實驗兔，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)，見表2。

表2 對照組和感染組實驗兔肝功能指標

表2 對照組和感染組實驗兔肝功能指標

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2．3 凝血4項檢測結(jié)果與陰性對照組相比，PT、APTT、TT在感染斯氏艾美耳球蟲的實驗兔的外周血中含量極顯著高于未感染球蟲的實驗兔，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01);FIB的含量極顯著低于對照組的實驗兔，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01)，見表3。

表3 對照組和感染組實驗兔凝血4項指標

表3 對照組和感染組實驗兔凝血4項指標

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3 討論

肝臟是人體內(nèi)臟中最大的實體器官，也是擁有最多功能的器官，包括合成酶、消化解毒、過濾凈化血液、調(diào)節(jié)血糖等等［2］。肝臟對來自體內(nèi)和體外的許多非營養(yǎng)性物質(zhì)如各種藥物、毒物以及體內(nèi)某些代謝產(chǎn)物，具有生物轉(zhuǎn)化的作用，可通過新陳代謝將它們徹底分解或以原形排出體外。若肝臟功能受到損傷，則會使各種代謝、消化功能紊亂，體內(nèi)毒素增加，從而影響機體的生長發(fā)育。此外，肝臟與機體凝血功能的正常發(fā)揮也有著密切的關(guān)系，能夠調(diào)節(jié)機體的凝血、抗凝與纖溶之間的動態(tài)平衡［3］，對人體凝血系統(tǒng)的完整性起到了重要的保證作用。血液中各種成分能比較客觀的反映機體的指標，雖然國內(nèi)已經(jīng)建立了兔血液學(xué)參數(shù)標準，但由于不同的目的，需要不同日齡及體重的兔，以及地理環(huán)境的不一樣，其血液學(xué)參數(shù)指標可能有一定的差異［4］。

肝臟功能出現(xiàn)問題的一個重要指標是ALT的升高，是肝臟有炎癥或肝細胞受損的重要指標［5］。AST廣泛存在于機體組織細胞中，有研究表明，AST活性隨肝細胞損傷的程度而升高。ALT和AST在正常血漿中含量很低，且含量比較穩(wěn)定。當肝臟合成蛋白質(zhì)的能力下降時，ALB會發(fā)生量和質(zhì)的變化，并且ALB越低，說明病情越嚴重［6］。此外，在臨床診斷中最普遍的生理指標便是LDH、ALP、GGT、ChE，這些指標的變化均能說明肝臟功能有不同程度的損傷。本試驗中斯氏艾美耳球蟲侵入肝臟，這些生理指標均有顯著變化，說明斯氏艾美耳球蟲對實驗兔肝臟造成了極大的損傷。

在血常規(guī)中，白細胞是人體與疾病斗爭的“衛(wèi)士”，具有吞噬異物并產(chǎn)生抗體，抗御病原體入侵等能力［7］。嗜酸性粒細胞是白細胞的一部分，占白細胞總數(shù)的0．5%～5%，在寄生蟲侵入時極為敏感。在過敏反應(yīng)、寄生蟲感染和其他免疫反應(yīng)中嗜酸性粒細胞(EOS)極為活躍［8］，嗜酸性粒細胞顯著上升。血小板起到十分重要的凝血作用，而血小板的減少會極大的影響患者機體的凝血功能。本試驗中，白細胞和嗜酸性粒細胞顯著上升，而血小板顯著下降，凝血4項進一步分析結(jié)果表明，實驗組和對照組各項指標均存在極顯著差異。

肝臟與機體凝血功能的正常發(fā)揮有著密切的關(guān)系，能夠調(diào)節(jié)機體的凝血、抗凝與纖溶之間的動態(tài)平衡，對人體凝血系統(tǒng)的完整性起到了重要的保證作用［9］。肝細胞為人體合成大量的凝血因子以及抗凝物質(zhì)和纖溶酶原［10］。當肝功能受損時，表現(xiàn)多種凝血功能缺陷［3］，引起蛋白合成減少而造成的凝血障礙以及凝血因子缺乏而造成的凝血時間延長。人體內(nèi)14種凝血因子中有12種由肝臟參與合成，肝細胞受到嚴重損害時，肝細胞大量壞死，蛋白合成能力下降，也使得凝血因子的合成逐漸減少。本試驗中斯氏艾美耳球蟲侵入肝臟，由正常肝細胞合成、分泌到血液中的各種凝血因子顯著減少，引起PT、APTT、TT延長，纖維蛋白質(zhì)(FIB)下降，血小板顯著下降。

本試驗分析比較了對照組和感染斯氏艾美耳球蟲的實驗兔的血常規(guī)、肝功能和凝血4項等血液指標。結(jié)果顯示，血常規(guī)中感染組的WBC、LY、EOS極顯著上升，PLT極顯著下降;肝功能中感染組的ALT、AST、T-BIL、LDH、ALP極顯著增高，GGT顯著上升，ALB極顯著下降，ChE顯著下降;凝血4項中感染組的PT、APTT、TT極顯著增高，F(xiàn)IB極顯著減少。這些結(jié)果均說明斯氏艾美耳球蟲對兔的危害極大，嚴重制約養(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展，深入研究兔球蟲病尤其是斯氏艾美耳球蟲病對機體功能的影響，探討早期診斷、預(yù)防控制與治療措施有著重要的理論意義和實用價值。

［1］宋鴻雁，朱順星，劉春，等．江蘇省實驗兔球蟲感染情況調(diào)查研究［J］．動物醫(yī)學(xué)進展，2012，33(12):88-91．

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［3］Lisman T，Caldwell S H，Burroughs A K，et al．Hemostasis and thrombosis in patients with liver disease:the ups and downs［J］．Hepatol，2010，53(2):362-71．

［4］潘永全，韓志剛，王勝，等．不同日齡新西蘭兔血液學(xué)部分參數(shù)觀察［J］．醫(yī)學(xué)動物防制，2004，20(1):20-23．

［5］Long H Nguyen，David Chao，Joseph K Lim，et al．Histologic Changes in Liver Tissue From Patients With Chronic Hepatitis B and Minimal Increases in Levels of Alanine Aminotransferase:A Metaanalysis and Systematic Review［J］．Clinical Gastroenterology and Hepatology，2014，12(8):1262-1266．

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［7］Julie Lasselin，Javaid-ur Rehman，Torbjornkerstedt，et al．Effect of long-term sleep restriction and subsequent recovery sleep on the diurnal rhythms of white blood cell subpopulations［J］．Brain，Behavior，and Immunity，2015，47(s1):93-99．

［8］Jeronimo S M B，Duggal P，Braz R F S，et al．An emerging peri-urban pattern of infection with Leishmania chagasi，the protozoan causing visceral leishmaniasis［J］．Scandinavian Journal of Infectious Diseases，2004，36(6-7):443-449．

［9］Patrick G，Northup，Stephen H，et al．Coagulation in Liver Disease: A Guide for the Clinician［J］．Clinical gastroenterology and hepatology，2013，11(9):1064-1074．

［10］Anna K．Kopec，James P．Luyendyk．Coagulation in liver toxicity and disease:Role of hepatocyte tissue factor［J］．Thrombosis Research，2014，133(1):S57-S59．

Routine blood tests and liver function analysis of Eimeria stiedai－infected rabbits

SONG Hong-yan，JING Jin，JIANG Ying-mei，SHAO Yi-xiang
(Laboratory Animal Center of Nantong University，Nantong 226001，China)

Routine blood tests，liver functions and four characteristics of blood coagulation of Eimeria stiedai-infected rabbits were detected and analyzed．Sporulated oocysts were given orally to eight coccidian-free two-month-old New Zealand rabbits，and eight uninfected New Zealand rabbits were set up as the negative control group．After 30 days，blood samples from the rabbit hearts were collected for routine blood tests，liver functions and four characteristics of blood coagulation were analyzed．Blood tests showed that glutamine transferase and serum cholinesterase were significantly different from those in the non-infected controls．Other extremely significant differences were observed in the biochemical indices of liver function，routine blood tests and four blood coagulation characteristics．Liver function ofrabbits infected with E．stiedai for a month was severely impaired．

Eimeria stiedai，New Zealand rabbits，routine blood tests，liver functions，four characteristics of blood coagulation

SHAO Yi-xiang

S865．1

A

:0529-6005(2017)01-0027-03

2015-11-26

國家自然科學(xué)基金(31301926);江蘇省自然科學(xué)基金(BK20130388)

宋鴻雁(1982-)，女，副教授，博士，主要從事實驗動物學(xué)研究，E-mail:15051277939@163．com

邵義祥，E-mail:shaoyx@ntu．edu．cn