羊肚菌生長過程中土壤酶變化規(guī)律研究

趙 苗，張 能，謝敬宜，賀新生

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010）

羊肚菌生長過程中土壤酶變化規(guī)律研究

趙 苗，張 能，謝敬宜，賀新生*

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010）

測定羊肚菌生長過程中的土壤酶活性、總碳并分析其變化規(guī)律，為羊肚菌人工栽培研究提供理論支持。采用3，5-二硝基水楊酸比色法定期測定土壤蔗糖酶、淀粉酶、纖維素酶活性；高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶活性；儀器分析法測定土壤總碳，并與土壤酶活性進行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，羊肚菌大田播種以后，蔗糖酶與纖維素酶活性均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，淀粉酶活性則表現(xiàn)先降低再升高后降低的變化趨勢，過氧化氫酶的變化趨勢則與淀粉酶恰恰相反，各種酶活性（過氧化氫酶活除外）的變化程度十分接近；土壤酶活性隨羊肚菌種植時間的延長而呈現(xiàn)獨有的變化規(guī)律，其規(guī)律不因種植前土壤酶活性水平的高低發(fā)生變化。

羊肚菌；土壤酶；總碳；變化規(guī)律

土壤酶主要來源于土壤微生物活動分泌、植物根系分泌和植物殘體以及土壤動物，能積極參與土壤中營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)，在土壤養(yǎng)分的循環(huán)代謝過程中起著重要作用，是各種生化反應(yīng)的催化劑[1-3]。土壤酶活性與土壤生物數(shù)量[4]、生物多樣性密切相關(guān)[5]。有關(guān)研究表明，土壤酶活性與土壤肥力相關(guān)，可以衡量土壤生物學(xué)活性，是土壤生態(tài)系統(tǒng)功能的關(guān)鍵[6]。過氧化氫酶參與土壤中的氧化還原反應(yīng)，其活性可以表征土壤腐殖質(zhì)化強度大小和有機質(zhì)轉(zhuǎn)化速度，并且與土壤微生物的數(shù)量和活性相關(guān)[7]。土壤蔗糖酶可以增加土壤中的易溶性營養(yǎng)物質(zhì)，其活性與有機質(zhì)的轉(zhuǎn)化和呼吸強度有密切關(guān)系[8]，并且與土壤有機碳存在顯著正相關(guān)[9]。纖維素酶則是土壤碳素循環(huán)主要參與者之一[10]。

目前為止，羊肚菌是唯一可以開放式種植于大田的珍稀食藥用菌[11]，2015年～2016年的栽培面積已經(jīng)達到1 333 hm2以上。但現(xiàn)有栽培技術(shù)并不穩(wěn)定，菌種、土壤、氣候、光照等均對羊肚菌的產(chǎn)量產(chǎn)生一定的影響，且無法預(yù)測羊肚菌是否出菇。羊肚菌栽培過程中必須把菌種均勻撒播在土壤內(nèi)，羊肚菌菌絲主要分布在表層0～20（30）cm的耕作層土壤內(nèi)，吸收土壤、基料、菌種培養(yǎng)料和土表層營養(yǎng)料袋中的營養(yǎng)物質(zhì)。實際上栽培的羊肚菌是典型的土生真菌，其生長過程與土壤有密切的關(guān)系。由于羊肚菌主要在冬季栽培，植物根系及土壤動物皆處于休眠狀態(tài)，土壤內(nèi)細菌、真菌和放線菌數(shù)量也顯著降低[12]，在羊肚菌栽培周期內(nèi)，羊肚菌可能是影響土壤酶活性的最主要因素。由于無法預(yù)測羊肚菌是否出菇，選取的樣本有很大的不出菇風(fēng)險，本人也測定到幾組未出菇羊肚菌栽培大田的土壤酶活性，但限于羊肚菌品種和土壤類型與本研究不同，不予列出，但可以作為參考，各種酶活性變化趨勢均與本研究結(jié)果不同。目前尚未有研究報道羊肚菌生長過程內(nèi)的土壤酶活性的動態(tài)變化。本研究測定了羊肚菌常規(guī)栽培模式下，羊肚菌生長過程內(nèi)的幾種主要參與碳循環(huán)的土壤酶活性的動態(tài)變化，并分析其變化規(guī)律。這將有利于了解羊肚菌在生長周期內(nèi)的生長狀態(tài)，為選擇更合適的栽培條件提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取位于綿陽市梓潼縣油坪村一隊的2塊面積近似的相互獨立的水稻田A和B，A、B互為對照，均采用羊肚菌的常規(guī)栽培模式栽培同一羊肚菌菌種。分別于種植前、種植后20 d、40 d、60 d、80 d（可見少量原基）、100 d（廣泛出菇），采用取土器采集0～15 cm土層的樣品，每塊樣地按S型路線隨機采集15個以上重復(fù)樣品。土壤采集后立刻篩去石塊、可見植物殘體和土壤動物等，在室內(nèi)避光處自然風(fēng)干，然后用四分法取適量土壤稍加研磨后速過60目篩，充分混勻并裝袋，立即測試分析；再取適量已過60目的樣品，進一步過100目篩后用于土壤總碳及其理化性質(zhì)測定。

采集少量種植后20 d、40 d、60 d后地表土壤，置于培養(yǎng)皿中，用清水輕輕洗滌至能肉眼看見羊肚菌菌絲，發(fā)現(xiàn)羊肚菌菌絲密度大致相同。

1.2 土壤酶的測定

采用3,5-二硝基水楊酸比色法定期測定土壤蔗糖酶、淀粉酶、纖維素酶活性，高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶活性。蔗糖酶、淀粉酶、纖維素酶活性測定需設(shè)置無機質(zhì)對照和無土壤對照，并繪制相應(yīng)的酶標(biāo)曲線。過氧化氫酶活性測定需設(shè)置無土壤對照。

1.2.1 蔗糖酶活性的測定

稱取5.000 g風(fēng)干土壤樣品，置于50 mL三角瓶中，加入15 mL8%蔗糖溶液、5 mL的pH5.5的磷酸緩沖液以及5滴甲苯；完全搖勻后，在恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完畢后，迅速過濾，吸取1 mL濾液到容量瓶中，加入3 mL的3,5-二硝基水楊酸，沸騰水浴加熱5 min，立刻把容量瓶移到自流下冷卻3 min，用蒸餾水定容至10 mL，于分光光度計波長508 nm處進行比色。蔗糖酶活性以24 h，1 g干土生成葡萄糖毫克數(shù)表示，蔗糖酶活性（H1）公式為：

式中：a為實驗組得到的葡萄糖毫克數(shù)；b為無機質(zhì)對照組得到的葡萄糖毫克數(shù)；c為無土壤對照組得到的葡萄糖毫克數(shù)。

1.2.2 淀粉酶活性的測定

稱取5.000 g風(fēng)干土壤樣品，置于50 mL三角瓶中，加入15 mL的pH5.6乙酸-磷酸緩沖液，再加入0.5 mL甲苯，搖勻放置15 min。再加入10 mL的2%淀粉，搖勻，放置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用致密的濾紙進行過濾，取1 mL濾液到容量瓶中，加入2 mL的3,5-二硝基水楊酸，沸騰水浴加熱5 min，立刻把容量瓶移到自流下冷卻3 min，用蒸餾水定容至10 mL，于分光光度計波長508 nm處進行比色。淀粉酶活性以24 h，1 g干土生成麥芽糖毫克數(shù)表示，淀粉活性（H2）公式為：

注：a1為實驗組得到的麥芽糖毫克數(shù)；b1為無機質(zhì)對照組得到的麥芽糖毫克數(shù)；c1為無土壤對照組得到的麥芽糖毫克數(shù)。

1.2.3 纖維素酶活性的測定

稱取5.000 g風(fēng)干土壤樣品，置于50 mL三角瓶中，加入1%羧甲基纖維素溶液5 mL、pH5.5醋酸鹽緩沖液15 mL以及甲苯1 mL，在培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)72 h（培養(yǎng)過程中分時間段搖瓶2次）。培養(yǎng)結(jié)束后，用濾紙過濾，吸取1mL濾液到容量瓶中，加入3 mL的3,5-二硝基水楊酸，沸騰水浴加熱 5 min，立刻把容量瓶移到自流下冷卻3 min，用蒸餾水定容至10 mL，于分光光度計波長540 nm處進行比色。纖維素酶活性以72 h，1 g干土生成葡萄糖毫克數(shù)表示，纖維素活性（H3）公式為：

式中：a2為實驗組得到的葡萄糖毫克數(shù)；b2為無機質(zhì)對照組得到的葡萄糖毫克數(shù)；c2為無土壤對照組得到的葡萄糖毫克數(shù)。

1.2.4 過氧化氫酶活性的測定

稱取2.000 g風(fēng)干土壤樣品，置于100 mL三角瓶中，注入蒸餾水40 mL以及0.3%過氧化氫溶液5 mL，震蕩20 min后，加入1.5 mol·L-1H2SO45 mL，懸液用慢速型濾紙過濾后，移液器吸取濾液25 mL，用0.02 mol·L-1高錳酸鉀溶液滴定，終點為淡粉紅色。過氧化氫酶活性以20 min，1 g干土消耗的0.02 mol·L-1KMnO4體積數(shù)表示，過氧化氫酶活性（H4）公式為：

式中：a3為滴定25 mL原始的過氧化氫混合液所消耗的高錳酸鉀量；b3為滴定土壤濾液所消耗的高猛酸鉀量；t為高錳酸鉀滴定度的校正值。

1.3 土壤總碳測定

取適量過100目篩的土壤樣品，使用Vario ELCUBE元素分析儀測定土壤總碳含量。

1.4 土壤理化性質(zhì)測定

采用常規(guī)分析法測定土壤基本理化指標(biāo)：采用重鉻酸鉀容量法測定有機質(zhì)含量；采用原子吸收分光光度計法測定速效鉀含量；采用碳酸氫鈉浸提和鉬銻抗比色法測定有效磷含量。

表1 播種前后土壤理化指標(biāo)Tab.1 Soil physicochemical indic before and after planting

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤酶的動態(tài)變化

2.1.1 土壤蔗糖酶的動態(tài)變化

采用3,5-二硝基水楊酸比色法定期測定水稻田A和B內(nèi)土壤蔗糖酶的活性，發(fā)現(xiàn)蔗糖酶活性的變化趨勢大致相同，均是先增高后降低，見圖1。

圖1 水稻田A、B內(nèi)土壤蔗糖酶活性的變化Fig.1 Variation of invertase activity in soil of rice field A and B

從圖1中可以發(fā)現(xiàn)，播種前水稻田A的土壤蔗糖酶活性遠遠高于水稻田B的土壤蔗糖酶活性。播種羊肚菌后，2塊水稻田內(nèi)的土壤蔗糖酶活性隨時間延長而升高，播種后20 d內(nèi)土壤蔗糖酶活性顯著升高，水稻田A的土壤蔗糖酶活性較播種前升高了2.6 mg·g-1，水稻田B的土壤蔗糖酶活性較播種前升高了3.3 mg·g-1，可能是羊肚菌菌絲在土壤內(nèi)生物量快速增加，同時分泌出越來越多的蔗糖酶；在播種60 d左右時，蔗糖酶活性達到峰值，水稻田A的土壤蔗糖酶活性較播種前升高了3.6 mg·g-1，水稻田B的土壤蔗糖酶活性較播種前升高了4.5 mg·g-1；播種60 d后，蔗糖酶活性隨時間的升高而降低；播種后100 d時（已出菇）的土壤蔗糖酶活性已低于種植前的土壤酶活性，此時水稻田A的土壤蔗糖酶活性較播種前降低了1.0 mg·g-1，水稻田B的土壤蔗糖酶活性較播種前降低了1.1 mg·g-1。綜上表明，羊肚菌大田栽培下土壤蔗糖酶活性的變化趨勢基本一致，不因栽培前土壤蔗糖酶活性的高低而發(fā)生變化。

2.1.2 土壤淀粉酶的動態(tài)變化

水稻田A、B內(nèi)土壤淀粉酶活性的變化見圖2。淀粉酶活性的變化趨勢大致相同，皆是先降低后升高再降低。播種前水稻田B的土壤淀粉酶活性高于水稻田A的土壤淀粉酶活性。

圖2 水稻田A、B內(nèi)土壤淀粉酶活性的變化Fig.2 Variation of amylase activity in soil of rice field A and B

從播種前到播種后20 d，水稻田A和B的土壤淀粉酶活性均顯著降低，且其活性降低到非常相近的程度，原因可能是隨著溫度的降低，土壤內(nèi)微生物數(shù)量（除羊肚菌）減少，從而導(dǎo)致淀粉酶活性降低。播種20 d后，土壤淀粉酶活性開始逐漸升高；到播種60 d左右，淀粉酶活性達到峰值，此時水稻田A的土壤淀粉酶活性較播種后20 d升高了0.95 mg·g-1，水稻田B的土壤淀粉酶活性較播種后20 d升高了1.1 mg·g-1，淀粉酶活性的升高量十分接近，說明播種20 d后，羊肚菌菌絲開始以淀粉為主要碳源來源之一；播種后60 d到播種后100 d，土壤淀粉酶活性逐漸降低，播種后100 d時，水稻田A的土壤淀粉酶活性為3.56 mg·g-1，水稻土B的土壤淀粉酶活性為3.48 mg·g-1，且均低于種植前土壤酶活性。同樣地，在兩塊相互獨立的大田栽培相同羊肚菌，其土壤淀粉酶活性的變化規(guī)律也趨于一致；尤其是淀粉酶活性在種植后20 d左右回到同樣的起點，此后開始基本一致的規(guī)律性變化；或許淀粉酶活性的規(guī)律性變化可以準(zhǔn)確反映羊肚菌在土壤中對碳源的吸收情況。

2.1.3 土壤纖維素酶的動態(tài)變化

纖維素酶活性的變化趨勢和蔗糖酶活性的變化趨勢相同，皆是先升高后降低，見圖3。水稻田B的土壤纖維素酶活性略高于水稻田A的土壤纖維素酶活性。

圖3 水稻田A、B內(nèi)土壤纖維素酶活性的變化Fig.3 Variation of cellulase activity in soil of rice field A and B

播種前到播種后60 d左右，土壤纖維素酶活性變化趨于直線，對播種前60 d水稻田A和B的土壤纖維素酶活性做線性回歸分析，得到水稻田A的纖維素酶活性變化趨于直線方程y=0.0136x+0.176，水稻田B的纖維素酶活性變化趨于直線方程y= 0.0127x+0.298，可以看出2個方程的斜率十分接近；播種60 d后，纖維素酶活性顯著下降；播種100 d后纖維素酶活性達到最低。土壤纖維素酶活性的動態(tài)變化同樣具有規(guī)律性。

2.1.4 土壤過氧化氫酶的動態(tài)變化

水稻田A、B內(nèi)土壤過氧化氫酶活性的變化見圖4。過氧化氫酶活性的變化趨勢與淀粉酶的變化趨勢恰恰相反。水稻田A的土壤過氧化氫酶活性高于水稻田B的土壤過氧化氫酶活性。

圖4 水稻田A、B內(nèi)土壤過氧化氫酶活性的變化Fig.4 Variation of catalase activity in soil of rice field A and B

播種前到播種后20 d左右，土壤過氧化氫酶活性顯著升高，此時羊肚菌菌絲在土壤中的生物量顯著增加；播種后20 d至播種后60 d左右，過氧化氫酶活性逐漸降低，原因一是羊肚菌菌絲的生物量逐漸達到飽和，二是部分菌絲出現(xiàn)老化現(xiàn)象，特別是土壤表層菌絲衰老明顯并發(fā)生自溶，致使菌絲活性降低，從而促使菌絲分泌的過氧化氫酶數(shù)量減少；播種后80 d至100 d，土壤過氧化氫酶活性逐漸增加，這一時期，菌絲活性復(fù)蘇，羊肚菌菌絲陸續(xù)扭結(jié)生成原基，原基繼續(xù)生長得到羊肚菌子實體，在此過程中，生物氧化還原反應(yīng)十分活躍。

2.2 土壤總碳的動態(tài)變化

使用元素分析儀定期測定水稻田A和B內(nèi)土壤總碳含量，發(fā)現(xiàn)其變化趨勢大致為先升高再降低后升高，見圖5。水稻田A內(nèi)土壤總碳高于水稻圖B內(nèi)土壤總碳含量。

播種前至播種后40 d，水稻田A和B土壤總碳均呈顯著升高，40 d左右，水稻田A內(nèi)土壤總碳含量達到峰值；播種40 d后，水稻田A內(nèi)土壤總碳含量呈直線下降，80 d左右降到低谷，隨后含量開始升高；而播種40 d后，水稻田B內(nèi)土壤總碳僅略微減少，至播種60 d后又開始升高。

2.3 土壤總碳與土壤酶活性的相關(guān)關(guān)系

利用SPSS軟件對不同土壤酶活性數(shù)據(jù)與土壤總碳進行相關(guān)性分析。發(fā)現(xiàn)水稻田A內(nèi)，土壤總碳與蔗糖酶之間呈顯著正相關(guān)（0.05水平顯著）；與淀粉酶之間存在某種負相關(guān)關(guān)系，與纖維素酶和過氧化氫酶之間存在一定的正相關(guān)關(guān)系，但不顯著。在水稻田B內(nèi)，發(fā)現(xiàn)土壤總碳與過氧化氫酶之間呈顯著正相關(guān)（0.05水平顯著）；同樣與淀粉酶之間存在某種負相關(guān)關(guān)系，與纖維素酶和蔗糖酶之間存在一定的正相關(guān)關(guān)系，但不顯著。

圖5 水稻田A、B內(nèi)土壤總碳的變化Fig.5 Variation of total carbon in soil of rice field A and B

2.4 播種前和播種后100 d土壤理化指標(biāo)變化

從表1可以看出，播種后100 d時水稻田A土壤有機質(zhì)含量、速效鉀含量低于種植前，而土壤有效磷含量則高于種植前。

3 討論

許多研究表明，土壤酶活性隨季節(jié)變化有明顯規(guī)律[13]，不同性質(zhì)的酶類有些許區(qū)別，但均是冬季活性最低，春季上升，夏秋季活性較高[14-16]。而羊肚菌的栽培時間是從秋末至初春，本研究結(jié)果表明出菇羊肚菌栽培大田內(nèi)土壤蔗糖酶、淀粉酶、纖維素酶、過氧化氫酶活性隨著種植時間的延長呈現(xiàn)出其獨有的規(guī)律性的變化，蔗糖酶和纖維素酶活性隨時間的延長先升高后降低，淀粉酶活性則是先降低再升高后降低，而過氧化氫酶活性的變化趨勢和淀粉酶活性變化趨勢恰恰相反。

種植前土壤酶活性水平的高低并不影響羊肚菌種植后土壤酶的變化趨勢，各個酶活性隨時間的延長，其變化程度也十分接近，且未出菇羊肚菌栽培大田內(nèi)土壤酶的變化可能與出菇羊肚菌栽培大田的土壤酶變化規(guī)律迥然不同，所以測定土壤酶活性可能作為檢驗羊肚菌生長過程中是否正常的1種手段。綜合分析這些土壤酶活性的規(guī)律性變化，土壤酶活性的動態(tài)變化也許可以反映羊肚菌的不同生長進程。蔗糖作為羊肚菌的最適碳源[17-18]之一。土壤蔗糖酶活性可以反映羊肚菌對碳源的吸收狀況，再結(jié)合淀粉酶、纖維素酶和過氧化氫酶活性的變化趨勢分析，羊肚菌從種植前至播種后20 d左右，羊肚菌菌絲生物量急劇升高；播種后20 d左右，羊肚菌開始將淀粉作為主要碳源之一；播種后60 d左右，各酶活達到峰值，且開始降低，可能是羊肚菌菌絲對碳源的需求開始降低，此時羊肚菌菌絲可能即將完成營養(yǎng)生長階段；種植后80 d后，土表陸續(xù)出現(xiàn)原基，并逐漸分化成子實體，同時對應(yīng)過氧化氫酶活性逐漸升高。選擇合適的時機人工加入養(yǎng)分也許可以縮短羊肚菌的栽培周期，甚至提高產(chǎn)量。

播種后100 d，土壤蔗糖酶活性低于種植前土壤蔗糖酶活性，且有機質(zhì)含量、速效鉀含量也低于種植前，說明羊肚人工栽培可能會降低部分土壤肥力，這與實際生產(chǎn)中連續(xù)兩年在同一塊土地栽培羊肚菌產(chǎn)量略有下降（尤其表現(xiàn)在子實體個頭較?。┫嗪魬?yīng)。而播種后100 d，土壤有效磷含量高于種植前，說明羊肚菌大田栽培同樣可能提升部分土壤肥力，實際農(nóng)作過程中，羊肚菌種植后的大田輪作其他作物，明顯發(fā)現(xiàn)作物長勢較于普通大田更好。羊肚菌人工栽培需要與農(nóng)作物栽培進行輪作，合理施肥，以保持土壤肥力均衡。

相關(guān)性分析表明，羊肚菌常規(guī)栽培模式下，土壤總碳與土壤蔗糖酶活性之間呈現(xiàn)很強的正相關(guān)性，這與前人的研究結(jié)論一致[19-20]；水稻田B內(nèi)雜草數(shù)量較多，可能是草本植物根系分泌物對過氧化氫酶活性有較大影響。

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Research on Variation of Soil Enzyme in Morchella Growth Process

ZHAO Miao,ZHANG Neng,XIE Jing-Yi,HE Xin-Sheng
(College of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,China)

s:The purpose of this study was to determine the soil enzyme activity and the total carbon in Morchella growth process, and analyzed its changing regulation,to provide theoretical support for the research of artificial cultivation of Morchella.3,5-dinitrosalicylic acid colorimetry was used to determine the soil invertase activity,soil amylase activity and soil cellulase activity, the potassium permanganate titrimetric method was used to determine the catalase activity,and the instrumental analysis methods was used to determine the soil total carbon.After sowing Morchella in the field,the results showed that the invertase activity and cellulase activity were reduced after the first increase in the trend,amylase activity showed first decreased and then increased then decreased trend,while,the change trend of catalase and amylase is on the contrary,and the degree of changes of enzyme activity(except catalase activity)were very close.The soil enzyme activity along with the increase of Morchella planting time showed regular changes,and the level of pre-plant soil enzyme activity did not affect the change rule of enzyme activity afte the cultivation of Morchella.

Morchella;soil enzyme;total carbon;change regulation

S646.9

A

1003-8310（2017）02-0041-06

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.02.012

趙苗（1991-），男，在讀碩士研究生，主要研究方向為食（藥）用菌栽培研究。E-mail:907790713@qq.com

*通信作者：賀新生（1965-），男，本科，教授，主要從事大型真菌分類及栽培研究。E-mail:hexinsheng@swust.edu.cn

2017-01-20