黑豆蛋白的分級(jí)提取及黑豆花色苷的成分鑒定

江 甜，何 毅，祝振洲，李書藝，何靜仁

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

黑豆蛋白的分級(jí)提取及黑豆花色苷的成分鑒定

江 甜，何 毅，祝振洲，李書藝，何靜仁*

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

以黑豆為原料，添加不同濃度（0、5、10、15、20、25 mmol/L）的不同二價(jià)陽離子（Ca2+、Mg2+和Zn2+）分級(jí)提取黑豆蛋白，經(jīng)冷凍干燥后用凱氏定氮法測(cè)得蛋白質(zhì)量濃度，并對(duì)所得蛋白級(jí)分（7S、11S）的純度和得率進(jìn)行分析。結(jié)果表明，黑豆提取過程中所加入二價(jià)陽離子的類型及濃度顯著影響7S和11S球蛋白的得率和純度。利用綜合平衡法，最終選定添加10 mmol/L的Mg2+分級(jí)提取黑豆球蛋白，得到7S蛋白純度和得率分別為（86.29±3.25）%和（2.90±0.14）%，11S蛋白純度和得率分別為（87.42±3.30）%和（9.11±0.28）%。用乙醇法提取黑豆花色苷，測(cè)得黑豆中總花色苷含量為（0.58±0.03）mg/g，總酚含量為（2.22±0.12）mg/g，對(duì)黑豆花色苷進(jìn)行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，其組成成分為飛燕草色素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊色素-3-O-葡萄糖苷、牽?；ㄉ?3-O-葡萄糖苷和錦葵花色素-3-O-葡萄糖苷。

黑豆；分級(jí)提取；7S球蛋白；11S球蛋白；花色苷

黑豆是豆科大豆屬植物大豆的黑色種子。又名烏豆、櫓豆、馬料豆[1]?！侗静菥V目拾遺》中記載，長(zhǎng)期食用黑豆可以強(qiáng)身健體、滋養(yǎng)肌膚、美容烏發(fā)，具有延緩衰老的功效[2]。黑豆含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、脂肪、微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分[3]，同時(shí)還含有黑豆多糖[4]、黑豆色素[5]和異黃酮[6]等多種生物活性物質(zhì)。

研究表明，黑豆中蛋白質(zhì)含量達(dá)到36%～40%，與普通大豆相比，其蛋白質(zhì)含量較高，一直是人類食譜的重要組成部分，主要分為2S、7S、11S和15S四個(gè)組成部分[7-9]。在制備過程中，由于2S球蛋白組分的分子質(zhì)量比較小，而且極易分散于水溶液中，在超速離心條件下也很難將其回收；而研究表明15S球蛋白是11S球蛋白的一種二聚體，它是一種大分子質(zhì)量的蛋白組分，在離心時(shí)又很難溶于溶液而殘留于豆渣中，不易被提取出來[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，黑豆蛋白具有較好的凝膠性和乳化性[12]，還有吸油、保水、成膜等許多功能特性[13]，其在肉制品、人造食品和調(diào)味制品等方面得到廣泛應(yīng)用[14-15]。除蛋白質(zhì)以外，黑豆皮富含的花青素也具有重要功效，它是很好的抗氧化劑來源，能清除體內(nèi)自由基[4,16]，尤其是在胃的酸性環(huán)境中，抗氧化效果好，有養(yǎng)顏美容、增加腸胃蠕動(dòng)的功效[17-18]，因近年來合成色素使用受到限制，黑豆作為一種新型天然色素源也得到了重視[18]。

我國(guó)黑豆資源豐富，且在日常食用中消耗量不斷增大，急需開發(fā)利用其價(jià)值。已有多位學(xué)者對(duì)黑豆的基本營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了比較分析[2-3,19]，但對(duì)于黑豆主成分蛋白的分級(jí)和花色苷成分的鑒定研究較少。本實(shí)驗(yàn)旨在研究黑豆蛋白的分級(jí)提取和利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法對(duì)黑豆花色苷的成分進(jìn)行鑒定分析，為黑豆蛋白的高效提取及其開發(fā)利用提供理論依據(jù)，并且為黑豆花色苷的分離鑒定提供文獻(xiàn)參考，使黑豆資源得到高效利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑小豆（江蘇省建湖縣） 江蘇幾百粒食品股份有限公司。

石油醚、NaOH、鹽酸、乙醇、ZnCl2、MgCl2、CaCl2國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MD44-3.5透析袋（截留分子質(zhì)量3 500 g/mol） 美國(guó)Viskase公司；沒食子酸 美國(guó)Sigma公司；Folin-酚 上海荔達(dá)生物科技有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW-100粉粹機(jī) 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；SB-5200DTN超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；STARTER 3100 pH計(jì) 奧豪斯儀器（上海）有限公司；AL204電子天平 梅特勒-拖利多儀器有限公司；Sorvall RC6 plus高速冷凍離心機(jī)、Evolution 220紫外-可見光分光光度計(jì)、Accela-LTQ XL HPLC-MS/MS聯(lián)用儀 美國(guó)Thermo Fisher公司；ALPHA 2-4 LD plus冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；UDK159全自動(dòng)凱氏定氮儀意大利Velp公司；R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司。

1.3 方法

1.3.1 黑豆蛋白的分析

1.3.1.1 黑豆球蛋白的提取及分級(jí)分離

黑豆粉碎后過80 目篩，用石油醚脫脂，得脫脂黑豆粉。豆粉以1∶15（g/mL）的比例加水后，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至7.0，并在25 ℃條件下超聲輔助提取1 h。所得分散相在4 000×g條件下離心20 min后棄去豆渣。所得上清液經(jīng)G4砂芯漏斗抽濾后得到黑豆蛋白提取液。在25 ℃條件下，向蛋白提取液中加入3 mmol/L的Na2SO3溶液，再分別加入0～25 mmol/L的MgCl2、CaCl2、ZnCl2，用1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值到5.8～6.0，攪拌10 min，在4 000×g條件下離心20 min，得到的沉淀為11S球蛋白。用1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)上清液pH值至4.2～4.5，再攪拌10 min。在4 000×g條件下離心20 min，棄去上清液，所得沉淀為7S球蛋白[20-21]。用截留分子質(zhì)量為3 500 g/mol的透析袋透析除去其中的小分子物質(zhì)。經(jīng)過冷凍干燥后得到11S球蛋白與7S球蛋白樣品。

1.3.1.2 黑豆球蛋白純度的測(cè)定

參考GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[22]，采用凱氏定氮法測(cè)定。蛋白質(zhì)含量即為蛋白純度。

1.3.1.3 黑豆球蛋白得率的測(cè)定

根據(jù)各級(jí)分蛋白的質(zhì)量、脫脂豆粉質(zhì)量，按公式（1）計(jì)算各蛋白組分的得率。

式中：m1為各級(jí)分蛋白質(zhì)量/g；m2為脫脂豆粉質(zhì)量/g。

1.3.2 花色苷的分析

1.3.2.1 花色苷的提取

取脫脂黑豆粉5.00 g按1∶20（g/mL）比例加入80%乙醇-鹽酸溶液（pH 3），在溫度為40 ℃、功率為240 W條件下超聲輔助提取30 min，4 000 r/min離心20 min，經(jīng)分離得到含有花色苷的上清液。重復(fù)1 次，合并上清液，于37 ℃條件下減壓濃縮除去乙醇，定容到50 mL，備用。

1.3.2.2 總花色苷含量測(cè)定

采用pH示差法測(cè)定黑豆花色苷含量[23]。1 mL樣品分別用pH 1.0緩沖液和pH 4.5緩沖液稀釋，在最大吸收波長(zhǎng)Amax和波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定吸光度?？偦ㄉ蘸堪词杠嚲账?3-O-葡萄糖苷計(jì)，按公式（2）計(jì)算總花色苷含量：

式中：C為總花色苷含量/（mg/g）；A=（Amax-A700nm）pH1.0-（Amax-A700nm）pH4.5；V為提取液體積/mL；DF為稀釋倍數(shù)；Mw為重均分子質(zhì)量/（g/mol），Mw=449.2 g/mol；L為光程/cm；ε為摩爾消光系數(shù)/（L/（mol·cm）），以矢車菊素葡萄糖苷計(jì)，ε=26 900 L/（mol·cm）；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.2.3 總酚含量測(cè)定

采用Folin-酚法測(cè)定黑豆花色苷總酚含量[24]。準(zhǔn)確吸取1 mL于10 mL棕色容量瓶中，加5.0 mL蒸餾水，再加0.5 mL Folin-酚試劑，搖勻1 min后再加入1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20% Na2CO3溶液，用蒸餾水稀釋至刻度，室溫避光反應(yīng)2 h后于波長(zhǎng)760 nm處測(cè)定吸光度。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，總酚含量以沒食子酸含量計(jì)，單位為mg/g。得出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=11.3X+0.019 2（R2=0.998 7）。

1.3.2.4 花色苷的純化

濃縮的上清液加入乙酸乙酯萃取3 次，去除黑豆的弱極性雜質(zhì)。選用已處理的AB-8大孔吸附樹脂對(duì)黑豆花色苷進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附-解吸[25]，上樣液質(zhì)量濃度為0.058 mg/mL，上柱流速為3～4 BV/h，吸附飽和后，用蒸餾水洗滌，去除花色苷中的蛋白質(zhì)、糖類、有機(jī)酸等雜質(zhì)，再用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液1～2 BV/h流速進(jìn)行解吸，洗脫得到的溶液于37 ℃條件下減壓濃縮除去乙醇，得到純化的花色苷，備用。

1.3.2.5 HPLC條件

色譜柱：T h e r m o F i s h e r反相C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相：A相為0.3%甲酸溶液，B相為甲酸-乙腈-水（0.3∶30∶69.7，V/V）溶液；線性梯度洗脫：0～30 min，A相從70%降至10%；保持2 min；32～35 min A相從10%升至70%；保持3 min；流速1 mL/min；柱溫25 ℃：進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)526 nm；二極管陣列檢測(cè)器。

1.3.2.6 MS條件

電噴霧離子源；正離子掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z 100～2 000；N2流速20 L/min；毛細(xì)管電壓26 V；毛細(xì)管溫度270 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白純度及蛋白得率的分析

在pH值為7條件下，添加不同濃度（0、5、10、15、20、25 mmol/L）的不同二價(jià)陽離子（Ca2+、Mg2+、Zn2+），其對(duì)所得組分的7S與11S球蛋白純度的影響如圖1所示。

圖1 Zn2＋、Mg2＋、Ca2＋濃度對(duì)7S球蛋白（A）和11S球蛋白（B）純度的影響Fig.1 Inf l uence of Zn2+, Mg2+and Ca2+concentrations on the purity of 7S globulin (A) and 11S globulin (B)

根據(jù)雙因素試驗(yàn)的方差分析可知，在pH值為7條件下，所加入的二價(jià)陽離子的類型及濃度顯著影響黑豆中7S與11S球蛋白級(jí)分純度。在本實(shí)驗(yàn)添加的3 種二價(jià)陽離子（Zn2+、Mg2+和Ca2+）中，添加Zn2+得到的7S與11S球蛋白級(jí)分的純度最低，而添加Mg2+得到的7S與11S球蛋白級(jí)分的純度明顯高于添加Zn2+和Ca2+的情況，尤其是在較高的離子濃度條件下（大于10 mmol/L），說明Mg2+與7S或11S球蛋白結(jié)合的特異性遠(yuǎn)高于Zn2+和Ca2+。在0～25 mmol/L的離子濃度內(nèi)，隨著Mg2+濃度的升高，提取的7S球蛋白級(jí)分的純度逐漸增加至87.5%，而在添加Zn2+和Ca2+的條件下，隨著濃度的升高，7S球蛋白級(jí)分的純度先增加后降低且在10 mmol/L時(shí)純度最大；而11S球蛋白級(jí)分的純度則隨Zn2+、Mg2+和Ca2+濃度的增加均逐漸下降。

在pH值為7條件下，添加不同濃度（0、5、10、15、20、25 mmol/L）的不同二價(jià)陽離子（Ca2+、Mg2+、Zn2+），其對(duì)所得組分的7S與11S球蛋白得率的影響見圖2。

圖2 Zn2＋、Mg2＋、Ca2＋濃度對(duì)7S球蛋白（A）和11S球蛋白（B）得率的影響Fig.2 Inf l uence of Zn2+, Mg2+and Ca2+concentrations on the yield of 7S globulin (A) and 11S globulin (B)

根據(jù)雙因素試驗(yàn)的方差分析可知，在pH值為7條件下，所加入的二價(jià)陽離子的類型及濃度顯著影響黑豆中7S與11S球蛋白級(jí)分的得率。在本實(shí)驗(yàn)添加的3 種二價(jià)陽離子（Zn2+、Mg2+和Ca2+）中，添加Mg2+得到的7S球蛋白得率明顯高于添加Ca2+和Zn2+的情況，而對(duì)于11S球蛋白，添加Zn2+所得的得率最高，說明Mg2+對(duì)7S球蛋白的結(jié)合能力高于其他2 種離子，而Zn2+對(duì)11S球蛋白的結(jié)合能力高于其他2 種離子。在0～25 mmol/L的離子濃度范圍內(nèi)，隨Zn2+、Mg2+和Ca2+濃度的升高，7S球蛋白級(jí)分的得率逐漸降低，而11S球蛋白級(jí)分的得率則逐漸增加。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度（0、5、10、15、20、25 mmol/L）的不同二價(jià)陽離子（Ca2+、Mg2+和Zn2+）對(duì)黑豆蛋白中7S球蛋白與11S球蛋白得率和純度的影響各不相同，可能是由于不同二價(jià)陽離子與蛋白的結(jié)合方式和結(jié)合強(qiáng)度存在差異。最終，利用綜合平衡法，選定添加10 mmol/L的Mg2+提取黑豆球蛋白，所得的7S與11S球蛋白的得率和純度均較高。此條件下得到的7S球蛋白純度和得率分別為（86.29±3.25）%和（2.90±0.14）%，11S球蛋白純度和得率分別為（87.42±3.30）%和（9.11±0.28）%。Wu Shaowen等[26]研究表明，2 組分的純度均達(dá)到（90±0.9）%，然而兩組分的得率分別只達(dá)到（1.7±0.05）%與（3.6±0.03）%[21]。Deak等[27]研究表明，制得7S與11S組分的純度分別為（67±0.4）%及（94±0.2）%，得率分別為（4.5±0.09）%與（4.7±0.2）%[21]。與之相比，本研究的提取方法得到的7S的純度略低于文獻(xiàn)[26]卻顯著高于文獻(xiàn)[27]的方法所得結(jié)果，7S球蛋白的得率高于文獻(xiàn)[26]而低于文獻(xiàn)[27]的研究結(jié)果，11S球蛋白的純度略低于文獻(xiàn)[26]和文獻(xiàn)[27]而得率顯著高于文獻(xiàn)[26-27]的研究結(jié)果。

2.2 花色苷的分析

2.2.1 總花色苷和總酚成分含量測(cè)定

經(jīng)測(cè)定，黑豆中總花色苷含量為（0.58±0.03）mg/g，總酚含量為（2.22±0.12）mg/g。

2.2.2 花色苷結(jié)構(gòu)分析

圖3 黑豆花色苷提取物的HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of black soybean anthocyanin extract

圖4 黑豆花色苷各峰的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.4 ESI+-mass spectra of black soybean anthocyanins

由圖3和圖4A可知，其分子離子[M+H]+為m/z 465.10，碎片離子為m/z 303.02，是由分子離子丟失了一個(gè)質(zhì)量數(shù)為162葡萄糖的中性碎片而得。因此，峰1可能為飛燕草色素-3-O-葡萄糖苷。由圖4B可知，其分子離子[M+H]+為m/z 448.98，碎片離子為m/z 286.93，是由分子離子丟失了一個(gè)質(zhì)量數(shù)為162葡萄糖的中性碎片而得。因此，峰2可能為矢車菊色素-3-O-葡萄糖苷。由圖4C可知，其分子離子[M+H]+為m/z 479.05，碎片離子為m/z 317.01，是由分子離子丟失了一個(gè)質(zhì)量數(shù)為162葡萄糖的中性碎片而得。因此，峰3可能為牽?；ㄉ?3-O-葡萄糖苷[28-30]。由圖4D可知，其分子離子[M+H]+為m/z 493.09，碎片離子為m/z 331.02，是由分子離子丟失了一個(gè)質(zhì)量數(shù)為162葡萄糖的中性碎片而得。因此，峰4可能為錦葵花色素-3-O-葡萄糖苷。該結(jié)論和Kim等[30]的研究結(jié)果大致相同，均發(fā)現(xiàn)飛燕草色素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊色素-3-O-葡萄糖苷和牽牛花色素-3-O-葡萄糖苷，而其研究未發(fā)現(xiàn)錦葵花色素-3-O-葡萄糖苷。

3 結(jié) 論

黑豆提取過程中所加入的二價(jià)陽離子的類型及濃度顯著影響7S和11S球蛋白的得率和純度，而且影響結(jié)果各不相同。在0～25 mmol/L的離子濃度內(nèi)，隨著Mg2+濃度的升高，提取的7S球蛋白級(jí)分的純度逐漸增加至87.5%，而隨著Zn2+和Ca2+濃度的升高，7S球蛋白級(jí)分的純度先增加后降低且在10 mmol/L時(shí)純度最大；隨Zn2+、Mg2+和Ca2+濃度的增加，11S球蛋白級(jí)分的純度逐漸下降，7S球蛋白級(jí)分的得率逐漸降低，而11S球蛋白級(jí)分的得率則逐漸增加。添加10 mmol/L的Mg2+提取黑豆球蛋白最優(yōu)，得到7S球蛋白純度和得率分別為（86.29±3.25）%和（2.90±0.14）%，11S球蛋白純度和得率分別為（87.42±3.30）%和（9.11±0.28）%。

黑豆中總花色苷含量為（0.58±0.03）mg/g，總酚含量為（2.22±0.12）mg/g。HPLC-MS/MS分析得出黑豆花色苷主要包括4 種成分，分別為飛燕草色素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊色素-3-O-葡萄糖苷和牽?；ㄉ?3-O-葡萄糖苷和錦葵花色素-3-O-葡萄糖苷。

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Fractional Extraction of Protein and Characterization of Anthocyanins from Black Soybean Seeds

JIANG Tian, HE Yi, ZHU Zhenzhou, LI Shuyi, HE Jingren*
(College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

Crude protein extract from black soybean seeds was fractionated by addition of different concentrations (0, 5, 10, 15, 20 and 25 mmol/L) of divalent cations (Ca2+, Mg2+and Zn2+). After the precipitated protein fractions (7S globulin and 11S globulin) were freeze dried, total nitrogen was determined by the Kjeldahl method and the yield and purity of the two fractions were measured. The results revealed that the type and concentration of divalent cations significantly affected the yield and purity of 7S and 11S globulin. Based on comprehensive consideration of yield and purity, 10 mmol/L of Mg2+was selected to extract black soybean globulin. The purity and yield of the obtained 7S protein were (86.29 ± 3.25)% and (2.90 ± 0.14)%, respectively, while the purity and yield of the obtained 11S protein were (87.42 ± 3.30)% and (9.11 ± 0.28)%, respectively. Anthocyanins from black soybean seeds were extracted with ethanol. It turned out that the content of anthocyanins was (0.58 ± 0.03) mg/g and total phenol was (2.22 ± 0.12) mg/g. By high performance liquid chromatography tandem-mass spectrometry (HPLC-MS/MS) analysis, the isolated anthocyanins were characterized as delphinidin-3-O-glucoside, cyanidin 3-O-glucoside, petunidin 3-O-glucoside and mallow-3-O-glucoside, respectively.

black soybean; fractional extraction; 7S globulin; 11S globulin; anthocyanin

10.7506/spkx1002-6630-201704035

TS201.1

A

1002-6630（2017）04-0217-06

江甜, 何毅, 祝振洲, 等. 黑豆蛋白的分級(jí)提取及黑豆花色苷的成分鑒定[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 217-222.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704035. http://www.spkx.net.cn

JIANG Tian, HE Yi, ZHU Zhenzhou, et al. Fractional extraction of protein and characterization of anthocyanins from black soybean seeds[J]. Food Science, 2017, 38(4): 217-222. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704035. http://www.spkx.net.cn

2016-06-01

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371727）；國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)（2014DFG32310）；湖北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BHE015）；湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014CFB891）

江甜（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工化學(xué)與食品營(yíng)養(yǎng)。E-mail：13476183768@163.com

*通信作者：何靜仁（1974—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯攀彻π镔|(zhì)基礎(chǔ)與分子營(yíng)養(yǎng)。E-mail：jingren.he@whpu.edu.cn