鹽酸青藤堿對(duì)家兔脊柱壓縮性骨折愈合的影響＊

李 莉，胡熙耀，萬(wàn) 超，郭俐宏，吳勝英＊＊

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 十堰 442000；2.十堰市太和醫(yī)院針灸治療科,湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院 十堰 442000）

青藤堿（Sinomenine，SIN）是從青風(fēng)藤的干燥根莖中提取的生物堿，具有鎮(zhèn)痛、免疫抑制、抗炎、抗風(fēng)濕及抗腫瘤等作用[1,2]。常用制劑有青藤堿緩釋膠囊、鹽酸青藤堿注射液等，因其對(duì)炎性因子IL-1β、IL-6β、IL-17β具有明顯的抑制作用，故臨床常用于治療風(fēng)濕、類(lèi)風(fēng)濕、骨性關(guān)節(jié)炎等[3]。在脊柱壓縮性骨折愈合過(guò)程中，IL-1β、IL-6β、IL-17β等炎性因子影響骨折局部病理微環(huán)境，而骨生長(zhǎng)分化因子2（growth differentiation factor2，GDF2）和骨保護(hù)素（Osteoprotegerin，OPG）則在骨折愈合過(guò)程中扮演重要角色，GDF2具有誘導(dǎo)成骨分化和骨形成能力，對(duì)促進(jìn)骨痂形成具有重要意義[4]。作為破骨細(xì)胞生成抑制因子，OPG與骨吸收和重建密切相關(guān)，可抑制破骨細(xì)胞的分化，促進(jìn)骨折部位破骨細(xì)胞凋亡，抑制骨吸收[5]。而VEGF及VEGF-mRNA高表達(dá)均可促進(jìn)骨折愈合[6]。目前就鹽酸青藤堿是否對(duì)OPG、GDF2和VEGF等促進(jìn)骨折愈合的諸多因子產(chǎn)生影響尚無(wú)實(shí)驗(yàn)報(bào)導(dǎo)，本實(shí)驗(yàn)建立去勢(shì)后家兔L1-L5骨質(zhì)疏松脊柱壓縮性骨折模型，觀察鹽酸青藤堿是否對(duì)以上所述諸多因子起到調(diào)節(jié)作用，為臨床治療此類(lèi)疾病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)家兔48只，雌性，兔齡6-7個(gè)月，體重2.9-3.1 kg，采用隨機(jī)數(shù)字表編號(hào)，然后隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、SIN組，每組16只（n=16）。

1.2 試劑及藥品

鹽酸青藤堿（寶雞浩翔生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：0170128）；OPG和GDF2檢測(cè)ELISA試劑盒（上海藍(lán)基生物科技有限公司，批號(hào)：10090913）；IL-1β、IL-6β、IL-17β檢測(cè)ELISA試劑盒（上海信則生物科技有限公司，批號(hào)：017011105、017011107、017022129），兔VEGF、NO和SOD ELISA試劑盒（江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司，批號(hào)：MB-2469A，MB-2470A，MB-2470A）。

1.3 造模及治療

用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，俯臥位固定家兔，然后采用去勢(shì)手術(shù)切除家兔雙側(cè)卵巢，2個(gè)月后再手術(shù)制備L1-L5節(jié)段脊柱壓縮性骨折模型。造模方法：動(dòng)物麻醉后用8%硫化鈉涂于L1-L5節(jié)段脊柱位置的皮膚，退去手術(shù)區(qū)兔毛，碘伏消毒，75%乙醇脫碘，模型組和SIN組做以下手術(shù)造模：鋪無(wú)菌巾，縱行切開(kāi)皮膚、鈍性分離家兔L1-L5背闊肌、棘間肌及韌帶，暴露L1-L5椎間盤(pán)，從脊柱側(cè)前方剪斷L1-L5節(jié)段椎體前緣，脊柱不做內(nèi)固定；空白對(duì)照組不麻醉、不造模作為正常對(duì)照。術(shù)后在2周內(nèi)每日強(qiáng)迫活動(dòng)6小時(shí)，動(dòng)物會(huì)因運(yùn)動(dòng)和重身重量壓縮造成脊柱壓縮性骨折[7]。因家兔前肢欠發(fā)達(dá)，但有發(fā)達(dá)的脊柱背側(cè)肌群和腹側(cè)肌群，其負(fù)重集中在后肢，生活體位多以半直立屈曲位為主，且造模手術(shù)是沿脊柱前緣L1-L5節(jié)段橫斷損傷的，兔的脊柱穩(wěn)定性仍存在，動(dòng)物清醒后生活及人為強(qiáng)迫活動(dòng)會(huì)因脊柱在此負(fù)重狀態(tài)下，脊柱受壓，最終表現(xiàn)成壓縮狀態(tài)，形成L1-L5節(jié)段脊柱壓縮性骨折模型[8]。在術(shù)后2周時(shí)，三組動(dòng)物均存活，經(jīng)拍攝CR分析，動(dòng)物L(fēng)1-L5節(jié)段脊柱均有明顯壓縮變短病理改變，說(shuō)明建模成功。在術(shù)后2周成模時(shí)，用10%鹽酸青藤堿在L1-L5脊柱兩側(cè)夾脊穴注射，青藤堿總用量為2 mL·kg-1·d-1，治療 4 周。模型組和空白對(duì)照組注射等體積生理鹽對(duì)照。

表1 3組OPG、GDF2表達(dá)比較(n=8,±s)

表1 3組OPG、GDF2表達(dá)比較(n=8,±s)

注：骨保護(hù)素（OPG）；骨生長(zhǎng)分化因子（GDF2）；注：與空白對(duì)照組比較，△P ＜0.05；模型組比較，▲P ＜0.05，與同組治療前比較，#P ＜0.05

1.4 觀察指標(biāo)

在治療前和治療后各取8只家兔的L1-L5脊柱及椎間盤(pán)，采用免疫組化染色法測(cè)定骨折脊柱骨GDF2、VEGF及VEGF-mRNA表達(dá)；ELISA法檢測(cè)靜脈血OPG、NO和SOD；免疫熒光法測(cè)定椎間盤(pán)二聚糖、圖像分析法測(cè)L1-L5脊柱骨密度；ELISA法檢測(cè)椎間盤(pán)炎性因子IL-1β、IL-6β和IL-17β水平，操作按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)分析軟件 ，本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，以±s表示，多組間先進(jìn)行方差分析，對(duì)于組間的均數(shù)檢驗(yàn)和組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05，為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鹽酸青藤堿對(duì)家兔OPG、GDF2的影響

見(jiàn)表1。空白對(duì)照組兔OPG、GDF2治療前后無(wú)明顯變化（P＞0.05）。模型組治療前后均低于空白對(duì)照組（P＜0.05）。SIN組治療治療前低于空白對(duì)照組（P＜0.05），治療后明顯升高，與同組治療前及模型組比較（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 鹽酸青藤堿對(duì)家兔IL-1β、IL-6β和IL-17β的影響

見(jiàn)表2?？瞻讓?duì)照組IL-1β、IL-6β和IL-17β治療前后無(wú)明顯變化（P＞0.05）。模型組治療前后均高于空白對(duì)照組比較（P＜0.05）。SIN組治療治療前低于空白對(duì)照組（P＜0.05），治療后明顯降低，與同組治療前及模型組比較（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 3組IL-1β、IL-6β和IL-17β比較(n=8,±s)

表2 3組IL-1β、IL-6β和IL-17β比較(n=8,±s)

注：白介素-1β：IL-1β；注：與空白對(duì)照組比較，△P＜0.05；模型組比較，▲P＜0.05，與同組治療前比較，#P＜0.05

組別空白對(duì)照組模型組SIN組IL-1β（Pg·ml-1）治療前0.97±0.11 17.31±2.04△16.84±2.71△治療后1.07±0.15 15.60±1.95△1.23±0.06▲#IL-6β（Pg·ml-1）治療前0.49±0.07 5.52±0.56△5.03±0.77△治療后0.47±0.05 5.18±0.71△0.54±0.11▲#IL-17β（Pg·ml-1）治療前0.71±0.19 7.03±0.91△7.25±0.83△治療后0.77±0.12 6.74±0.82△0.80±0.21▲#

表3 3組二聚糖光密度及骨密度比較(n=8,±s)

表3 3組二聚糖光密度及骨密度比較(n=8,±s)

注：與空白對(duì)照組比較，△P＜0.05；模型組比較，▲P＜0.05，與同組治療前比較，#P＜0.05

表4 3組VEGF、VEGFmRNA表達(dá)比較(n=8,±s)

表4 3組VEGF、VEGFmRNA表達(dá)比較(n=8,±s)

注：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因表達(dá)（VEGFm?RNA）；注：與空白對(duì)照組比較，△P＜0.05；模型組比較，▲P＜0.05，與同組治療前比較，#P＜0.05

表5 3組NO和SOD比較(n=8,±s)

表5 3組NO和SOD比較(n=8,±s)

注：一氧化氮（NO)；超氧化物歧化酶（SOD）；注：與空白對(duì)照組比較，△P＜0.05；模型組比較，▲P＜0.05，與同組治療前比較，#P＜0.05

2.3 鹽酸青藤堿對(duì)家兔骨密度和二聚糖光密度的影響

見(jiàn)表3。模型組二聚糖光密度及骨密度在療前后均明顯降低，與空白對(duì)照組比較（P＜0.05）。SIN組治療后顯著升高，與同組治療前及模型組比較（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 鹽酸青藤堿對(duì)家兔骨折脊柱VEGF和VEGFm-RNA的表達(dá)的影響

見(jiàn)表4，空白對(duì)照組和模型組療前后VEGF、VEG?FmRNA均有一定表達(dá)，但與同組治療前比較（P＞0.05），模型組與空白對(duì)照組比較（P＞0.05）。SIN組治療后高表達(dá)，與同組治療前及模型組比較（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 鹽酸青藤堿對(duì)NO和SOD的表達(dá)的影響

見(jiàn)表5，模型組療前后SOD均正常，與空白對(duì)照組比較（P＞0.05），NO治療前和治療后均升高，與空白對(duì)照組比較（P＜0.05）。SIN組治療前SOD均正常，與空白對(duì)照組比較（P＞0.05），NO治療前升高，與空白對(duì)照組比較（P＜0.05）。治療后SOD顯著升高，NO降低，與同組治療前及模型組比較（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

脊柱壓縮性骨折以老年患者較多，特別是50歲以上的絕經(jīng)婦女，此類(lèi)患者多存在骨質(zhì)疏松，在外力的作用下較易發(fā)生壓縮性骨折。以往對(duì)青藤堿的研究主要局限在風(fēng)濕、類(lèi)風(fēng)濕、骨關(guān)節(jié)炎、腫瘤等方面[9]，而沒(méi)有針對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折方面的研究，本研究填補(bǔ)了青藤堿對(duì)骨質(zhì)疏松脊柱壓縮性骨折的影響，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)鹽酸青藤堿治療后，SIN組椎間盤(pán)二聚糖增多，IL-1β、IL-6β、IL-17β含量降低、靜脈血NO含量降低。二聚糖具有抑制IL-1β、IL-6β和IL-17β合成，調(diào)節(jié)椎間盤(pán)新陳代謝而達(dá)到抑制椎間盤(pán)退行性等的作用[10]。IL-1β可激活一氧化氮合酶而產(chǎn)生NO，在誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的同時(shí)，誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6β和IL-17β，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡發(fā)生，降解軟骨細(xì)胞基質(zhì)，降低成骨細(xì)胞活性，減緩骨痂形成[11]。而因子IL-17β由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生，可增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性并最終導(dǎo)致骨侵蝕[12]。鹽酸青藤堿可能通過(guò)增強(qiáng)椎間盤(pán)二聚糖的合成，調(diào)節(jié)椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞增殖和合成蛋白多糖的新陳代謝來(lái)影響IL-1β、IL-6β和IL-17β合成[13]。特別是抑制IL-1β后，可減少其刺激軟骨細(xì)胞分泌PGE2，降低椎間盤(pán)基質(zhì)金屬蛋白酶的形成，從而抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)，降低NO的產(chǎn)生，降低軟骨細(xì)胞凋亡發(fā)生，增加軟骨細(xì)胞基質(zhì)，增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性，從而加速骨痂形成[14]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，SIN組L1-L5節(jié)段脊柱VEGF和VEGFmRNA高表達(dá)。VEGF可促骨折區(qū)域血管內(nèi)皮再生、對(duì)建立動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)，提高骨折區(qū)域營(yíng)養(yǎng)及代謝中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[15]。鹽酸青藤堿夾脊穴注射吸收后，通過(guò)刺激骨折區(qū)域VEGF分秘，促進(jìn)骨折區(qū)域血管內(nèi)皮再生、建立新的動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)，這有利于增加損傷局部的血供，間接促進(jìn)骨折愈合。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，Kimelman-Bleich N等[16]發(fā)現(xiàn)GDF2具有誘導(dǎo)成骨活性的作用，但在大鼠腰椎脊柱融合均動(dòng)物模型中有明顯促成骨作用。而OPG是機(jī)體成骨與破骨的重要偶聯(lián)因子，主要功能是維持骨的正常礦化抑制破骨細(xì)胞的分化，抑制成熟破骨細(xì)胞的骨吸收活性并誘導(dǎo)其凋亡，從而減少骨吸收[17]。青風(fēng)藤藥性苦燥辛散，歸脾經(jīng)、肝經(jīng)，善走經(jīng)絡(luò)，夾脊穴注射可直達(dá)病所，達(dá)到祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)的目的[18]。本實(shí)驗(yàn)夾脊穴注射符合中醫(yī)經(jīng)穴治療體系的理論，夾脊穴位于腰椎棘突旁，深層有棘突韌帶和肌肉等，針刺可改善微環(huán)境，促進(jìn)局部炎性因子IL-1β、IL-6β等代謝，緩解肌肉痙攣，這不僅利于骨折愈合，還可提高SOD活性以清除機(jī)體自由基，而且減少炎癥性病理改變，加速骨折愈合。

本實(shí)驗(yàn)以骨質(zhì)疏松脊柱壓縮性骨折模型為研究對(duì)象，系統(tǒng)觀察了鹽酸青藤堿對(duì)OPG、GDF2和VEGF等促進(jìn)骨折愈合的諸多因子的影響，發(fā)現(xiàn)鹽酸青藤堿“夾脊穴”注射可促進(jìn)去勢(shì)家兔L1-L5節(jié)段VCF愈合，這一結(jié)果對(duì)其可能應(yīng)用于臨床治療骨質(zhì)疏松脊柱壓縮性骨折具有一定的參考價(jià)值。

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