白木香種子脂溶性成分及其抗肝癌活性研究＊

鄭 威，崔正嵬，馮 劍，陳德力，劉洋洋

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所海南分所，海南省南藥資源保護(hù)與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局沉香可持續(xù)利用重點(diǎn)研究室 海口 570311）

白木香Aquilaria sinensis(Lour.)Spreng.為瑞香科沉香屬的植物，是國產(chǎn)沉香的唯一正品植物資源，由于自身繁殖率低下，受自然災(zāi)害和人為破壞的影響，野生白木香資源已遭受嚴(yán)重的破壞，被列為國家二級瀕危保護(hù)植物[1,2]。在現(xiàn)有的白木香種子與沉香藥材藥理研究中發(fā)現(xiàn)，二者的部分藥理活性表現(xiàn)出一定的相似性，這使得從白木香種子中篩選出具相同藥理活性的成分的設(shè)想成為了可能，為白木香資源的充分利用提供了理論基礎(chǔ)[3-6]。

當(dāng)前，白木香種子脂溶性成分提取方式的研究主要集中在石油醚浸提法、超臨界CO2萃取法、索氏提取法上，而其活性的研究則主要體現(xiàn)在抗氧化和抗菌兩個方面[5-9]，水蒸氣蒸餾法、快速溶劑萃取法和物理壓榨法等方面的研究少見報道。為了系統(tǒng)地比較水蒸氣蒸餾法、快速溶劑萃取法、石油醚萃取法、索氏提取法及物理壓榨法對白木香種子脂溶性提取物中化學(xué)成分及其抗肝癌活性作用的影響，本研究采用GC-MS對5種脂溶性提取物進(jìn)行成分分析鑒定，同時考察了5種脂溶性提取物對H22小鼠肝癌細(xì)胞的抑制作用。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

白木香種子采自海南省?？谑醒葚S鎮(zhèn)，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所鄭希龍博士鑒定為沉香屬白木香Aquilaira sinensis(Lour.)Spreng.的種子，烘干、粉碎、備用。

H22小鼠肝癌細(xì)胞（上海歌凡生物科技有限公司）；RPMI Medium 1640（干粉，gibco USA 1786044）；雙抗（gibco USA 1832567）；0.25%胰蛋白酶-EDTA（gibco USA 1798320）。

石油醚（分析級，西隴化工），正己烷（分析級，西隴化工），無水Na2SO4（分析級，上海國藥），氯化鈉（分析級，上海國藥），氯化鉀（分析級，上海國藥），無水磷酸二氫鈉（分析級，上海國藥），無水磷酸氫二鈉（分析級，上海國藥），碳酸氫鈉（分析級，上海國藥），超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

快速溶劑萃取儀（ASE350，美國Thermo Fisher）；氣相色譜質(zhì)譜儀聯(lián)用儀（7890A 5975C，美國Agilent）；倒置熒光顯微鏡（CKX53，日本-OLYMPUS）；血球計數(shù)板（北玻）；酶標(biāo)儀（Thermo 1510，美國Thermo Fish?er）；超純水系統(tǒng)（CR-Easy15，Heal Force）；臺式高速冷凍離心機(jī)（TGL-16M，上海盧湘儀）；CO2培養(yǎng)箱（Gal?axy 170 s，New Brunswick）。

2 方法

2.1 白木香種子脂溶性提取物的制備

2.1.1 水蒸氣蒸餾法（Steam Distillation,SD）

白木香種子粉和超純水按質(zhì)量體積比1∶5加入水蒸氣蒸餾裝置，微沸冷凝回流6 h，吸取上層油層，經(jīng)無水Na2SO4干燥后，得白木香種子水蒸氣蒸餾法所得脂溶性提取物，記作SD-E。

2.1.2 快速溶劑萃取法（Accelerated Solvent Extraction,ASE）

將白木香種子粉和硅藻土以質(zhì)量比2∶1比例混合均勻后加入樣品池中，設(shè)定萃取溫度120℃，靜態(tài)萃取時間5 min，靜態(tài)萃取次數(shù)3次，以60%樣品池體積正己烷沖洗，氮?dú)獯祾邥r間2 min，萃取，收集萃取液揮干溶劑并干燥，得白木香種子快速溶劑萃取法所得脂溶性提取物，記作ASE-E。

2.1.3 石油醚萃取法（Petroleum ether Extraction,PE）

取白木香種子粉和95%乙醇按質(zhì)量體積比1∶5冷浸提取3次，過濾、合并濾液，濃縮至浸膏再經(jīng)石油醚萃取，收集萃取液，濃縮，得白木香種子石油醚萃取法所得脂溶性提取物，記作PE-E。

2.1.4 索氏提取法（Soxhlet Extraction,SE）

取1/2提取筒體積的白木香種子粉，用濾紙筒裝好，封住開口端，置于提取筒內(nèi)，加入100 mL正己烷，85℃水浴加熱提取6 h，收集回流液濃縮至干，得白木香種子索氏提取法所得脂溶性提取物，記作SE-E。

2.1.5 物理壓榨法（Physical Squeeze,PS）

將白木香種子粉加入壓榨機(jī)中壓榨取油，收集壓榨出來的油分，得白木香種子物理壓榨法所得脂溶性提取物，記作PS-E。

2.2 GC-MS分析條件

2.2.1 氣相條件

石英毛細(xì)管柱HP-5MS（5%Phenyl Methyl Si?lox,30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）。

程序升溫：50℃保持1 min，15℃·min-1至140℃，保持1 min，1℃·min-1至160℃，保持2 min，5℃·min-1至250℃，保持 5 min，最后 18℃·min-1至 285℃，保持2 min。氣化室溫度250℃，載氣為氦氣，流速1 mL·min-1，不 分流。

2.2.2 質(zhì)譜條件

EI源，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，電離電壓70 eV，全掃描模式，溶劑延遲時間6 min，進(jìn)樣量1 μL。

2.2.3 GC-MS數(shù)據(jù)處理方法

采用Chemstation軟件解卷積后，由NIST譜庫自動檢索并結(jié)合人工檢索確定各成分，再通過面積歸一法計算獲取各成分的相對百分含量。

2.3 H22小鼠肝癌細(xì)胞生長抑制率測定[10]

分別取白木香種子的5種脂溶性提取物10 mg，加10 μL的DMSO超聲溶解，用完全培養(yǎng)基稀釋配制成10 mg·mL-1的儲備溶液，用時再稀釋成1 mg·mL-1的樣品溶液。

挑選對數(shù)生長期的H22小鼠肝癌細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后，1 000 r·min-1離心吸取上清，用完全培養(yǎng)基重懸并稀釋細(xì)胞濃度至5×104個/mL，按照每孔100 μL接種到96孔板，周圍孔用PBS填充，防止邊緣效應(yīng)，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對照組（正常生長的細(xì)胞不加藥物）、調(diào)零組（只加培養(yǎng)液）及樣品組3組，每組設(shè)置5個復(fù)孔，樣品組每孔加100 μL的樣品液，對照組和調(diào)零組加100 μL的培養(yǎng)液。37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加10 μL的MTT溶液繼續(xù)孵育4 h，吸去上清加150 μL的DMSO溶液，酶標(biāo)儀振蕩10 min后在570 nm下測量吸光度，并取吸光度的平均值計算抑制率。

表1 不同提取方法所得的白木香種子脂溶性提取物得率表

3 結(jié)果

3.1 不同提取方法所得的白木香種子脂溶性提取物得率（%，w/w）比較

3.2 不同提取方法所得的白木香種子脂溶性提取物成分分析

采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對白木香種子的5種脂溶性提取物進(jìn)行成分檢測，獲取相應(yīng)的脂溶性成分的總離子流圖（圖1-5）。

圖1-5不同提取方法所得白木香種子脂溶性提取物成分?jǐn)?shù)據(jù)經(jīng)面積歸一法計算，SD-E、ASE-E、PE-E、SE-E和PS-E中化學(xué)成分相對百分含量大于1%的成分個數(shù)依次為19、9、19、13和3個；其相對百分含量占總含量分別為78.25%、94.38%、90.93%、88.38%、91.46%，具體數(shù)據(jù)如表2所示。

由表2可知，白木香種子的5種脂溶性提取物中均含有較多的不飽和脂肪酸和烯烴類物質(zhì)，SD-E中不飽和脂肪酸為油酸（3.43%）、反油酸（7.26%），烯烴類成分為8-十七碳烯（1.09%）、β-瑟林烯（2.85%）、2-異丙基-5-甲基-9-亞甲基-雙環(huán)[4.4.0]癸-1-癸烯（4.53%）；ASE-E中不飽和脂肪酸為油酸（2.93%）、反油酸（54.79%）、6-十八碳烯酸（1.69%），烯烴類物質(zhì)為角鯊烯（9.21%）；PE-E中不飽和脂肪酸為油酸（14.88%）、反油酸（6.17%）、6-十八碳烯酸（1.59%）、順-6-十八碳烯酸（2.00%）、十八碳-9-烯酸（1.09%）、順式-十八碳烯酸（1.44%），烯烴類物質(zhì)為4,11,11-三甲基-8-亞甲基-二環(huán)[7.2.0]4-十一烯（2.94%）、葎草烯（2.97%）、1,9-十四碳二烯（4.36%）、10-二十一（碳）烯（c,t）（1.50%）、9-十九碳烯（2.67%）；SE-E中不飽和脂肪酸為油酸（1.62%）、反油酸（18.01%），烯烴類物質(zhì)為（E）-5-十八烯（2.14%）、角鯊烯（43.96%）；PS-E中不飽和脂肪酸為反油酸（48.45%），烯烴類物質(zhì)為角鯊烯（6.01%）。其他占各提取物相對含量較高的有：SD-E中的5,5-二甲基-4-[3-甲基-1,3-丁二烯基]-1-氧雜[2.5]辛烷（12.11%）和棕櫚酸甲酯（17.56%），ASE-E中的棕櫚酸（13.12%），PE-E中的9-十六碳烯酸乙酯（11.24%）和油酸甲酯（13.76%）以及PS-E中的棕櫚酸（37.00%）相對百分含量都超過了10%，5種提取物中反油酸均有較高含量。

圖1 SD-E氣相色譜總離子流圖

圖2 ASE-E氣相色譜總離子流圖

圖3 PE-E氣相色譜總離子流圖

圖4 SE-E氣相色譜總離子流圖

圖5 PS-E氣相色譜總離子流圖

表2 不同提取方法所得的白木香種子脂溶性提取物化學(xué)成分表

表3 不同提取方法所得的白木香種子脂溶性提取物癌細(xì)胞增殖抑制率表

3.2 抗肝癌活性測定結(jié)果

采用MTT法，白木香種子提取物在1 mg·mL-1的濃度下對H22小鼠肝癌細(xì)胞增殖的抑制率如表3所示：

4 討論

本研究采用GC-MS分析比較了白木香種子脂溶性提取物的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)了具安定作用的沉香螺醇[11]，具抗氧化、抗腫瘤、抗輻射及抗菌多重效果的角鯊烯[12]，具抗腫瘤活性的棕櫚酸[13]，具誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的反油酸[14]、以及被廣泛應(yīng)用的油酸等成分。5種提取方法所得的脂溶性提取物的得率和成分都存在較為顯著的差異。石油醚萃取法較物理壓榨法所得成分更具有多樣性，含有5類共計19種成分，占總量的90.93%，物理壓榨法所提成分較少，相對百分含量在1%以上僅棕櫚酸（37.00%）、反油酸（48.45%）、角鯊烯（6.01%）3種，二者得率分別為36.31%和40.12%，水蒸氣蒸餾法和索氏提取法都含有飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、酯類、烷烴、烯烴、醛類以及醇類7類成分，二者得率分別為0.009 6%和48.88%，前者作為常用的揮發(fā)性物質(zhì)提取方法，所提取的組分最多，成分分布更為全面，索式提取法則以反油酸和角鯊烯為主要成分，根據(jù)這4種提取方法的原理可知，造成它們兩兩之間差異的影響因素可能為提取溶劑；快速溶劑萃取法萃取過程較之索氏提取法等其它四種提取方法，其所需溫度和壓力更高，提取成分主要包括飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、酯類、烯烴4類，以棕櫚酸、反油酸、反油酸甲酯和角鯊烯為主要成分，占總量的82.17%，提取物得率為37.36%，說明不同提取方法之間成分的溶出與提取的溫度和壓力有一定的依存關(guān)系。結(jié)合現(xiàn)有的研究[15-17]可以發(fā)現(xiàn)，植物成分的提取與溫度、提取溶劑及壓力等因素呈一定的相關(guān)性，不同的提取溶劑、溫度及壓力對提取物的得率和成分有較為顯著的影響，因此，今后對白木香種子脂溶性成分提取方法的選擇應(yīng)多因素考慮，參考各提取方式的提取效果，根據(jù)自身所需選擇最佳提取方法。

H22小鼠肝癌細(xì)胞的體外生長抑制實(shí)驗(yàn)表明，白木香種子脂溶性提取物對H22小鼠肝癌細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用，不同提取方式所得的白木香種子脂溶性提取物對H22小鼠肝癌細(xì)胞的抑制能力依次為ASE-E＞SE-E＞PS-E＞SD-E＞PE-E。對5種脂溶性提取物成分的分析結(jié)果進(jìn)行整合時發(fā)現(xiàn)，各提取物中反油酸和角鯊烯的相對百分含量之和與相應(yīng)的細(xì)胞抑制作用呈線性相關(guān)，結(jié)合已有研究[12,14]推測，角鯊烯和反油酸可能是白木香種子脂溶性提取物對H22小鼠肝癌細(xì)胞生長起抑制作用的主要成分，前者對羥基—甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶活性的抑制和自由基清除或活性氧的作用，后者對細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的活性可能是對H22小鼠肝癌細(xì)胞生長起抑制作用的關(guān)鍵性因素。白木香種子脂溶性提取物成分復(fù)雜，其藥理活性的具體作用機(jī)制尚不明確，有待于進(jìn)一步深入研究。本研究明確了白木香種子脂溶性提取物的物質(zhì)基礎(chǔ)，也為白木香種子的利用和抗肝癌藥物開發(fā)提供了新提示。

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