黃芪—莪術(shù)不同提取物抗腫瘤作用研究

姚遠(yuǎn)+仝立國(guó)+馮瑪莉+范惠霞

[摘要] 目的 研究不同方法提取的黃芪-莪術(shù)提取物的抗腫瘤作用。 方法 建立人肝癌細(xì)胞株HepG2模型，分別以95%乙醇、50%乙醇、水提醇沉、傳統(tǒng)水煎四種方法為提取工藝，用CCK-8法檢測(cè)不同提取物對(duì)HepG2細(xì)胞抑制生長(zhǎng)作用，并用流式細(xì)胞法檢測(cè)其體外誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的情況。用小鼠肝癌H22細(xì)胞建立移植性肝癌模型，檢測(cè)上述提取物體內(nèi)抗腫瘤活性，用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)H22肝癌組織中NF-κB p65的表達(dá)情況。 結(jié)果 CCK-8結(jié)果顯示，與陰性組相比，黃芪-莪術(shù)95%乙醇和50%乙醇提取物組最高抑制率分別為89.13%、78.36%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），醇沉和水煎提取物組最高抑瘤率分別為20.38%、18.78%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，95%乙醇提取組和50%乙醇提取物組能明顯誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，水提醇沉組和傳統(tǒng)水煎組效果不明顯。95%乙醇、50%乙醇、水提醇沉、傳統(tǒng)水煎四種提取物對(duì)小鼠H22荷瘤均有一定的抑瘤效果，抑瘤率分別為47.55%、36.12%、29.96%、34.68%。與模型組相比，95%乙醇和50%乙醇提取物組能明顯降低H22荷瘤組織中NF-κB p65水平的表達(dá) （P<0.05）。 結(jié)論 黃芪-莪術(shù)95%乙醇、50%乙醇、水提醇沉、傳統(tǒng)水煎四種提取物均有抑制小鼠H22荷瘤生長(zhǎng)作用，但是只有95%乙醇和50%乙醇提取物能抑制NF-κB p65蛋白的表達(dá)，并有抑制人肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)及誘導(dǎo)其發(fā)生細(xì)胞凋亡的作用。

[關(guān)鍵詞] 黃芪；莪術(shù)；HepG2細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；NF-κB p65

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）07-0033-04

[Abstract] Objective To study the anti-tumor effect of the extract of Astragalus and Curcuma zedoaria Rosc by different methods. Methods Liver cancer cell line HepG2 model was established by four kinds of methods including 95% ethanol， 50% ethanol， water extraction and ethanol precipitation and the traditional decoction for the extraction process.The inhibitory effect of different extracts on the growth of HepG2 cells was detected by CCK-8 method.And the apoptosis of HepG2 cells was detected by flow cytometry.The model of transplanted hepatocellular carcinoma（HCC） was established by mouse liver cancer H22 cells.The antitumor activity in the above-mentioned extract was examined. The expression of NF-κB p65 in H22 hepatocellular carcinoma tissues was detected by immunohistochemistry. Results The CCK-8 results showed that the highest inhibitory rates were 89.13% and 78.36% in Astragalus-Curcuma 95% ethanol and 50% ethanol extraction groups respectively compared with that in the negative group， and the difference was significant （P<0.05） .The highest inhibitory rates were 20.38% and 18.78% respectively in ethanol precipitation and decoction extraction groups， and the difference was not significant（P>0.05）.The results of flow cytometry showed that 95% ethanol extraction group and 50% ethanol extraction group could obviously induce HepG2 cell apoptosis， while the roles of the water extraction and alcohol precipitation group and the traditional decoction group were not obvious.Four extracts including 95% ethanol， 50% ethanol， water extraction and ethanol precipitation and traditional decoction all had inhibitory effect on H22 tumor in mice. The tumor inhibition rates were 47.55%， 36.12%， 29.96% and 34.68% .Compared with the model group， 95% ethanol and 50% ethanol extraction groups could significantly decrease the expression level of NF-κB p65 in H22 tumor tissue（P<0.05）. Conclusion Astragalus and Curcuma zedoaria Rosc 95% ethanol， 50% ethanol， water extraction ethanol precipitation and traditional decoction could inhibit the growth of H22 tumor in mice.But only 95% ethanol and 50% ethanol extracts could inhibit the expression of NF-κB p65 protein， and have the effect of inhibiting the growth of human liver cancer HepG2 cells and inducing the apoptosis of HepG2 cells.

[Key words] Astragalus； Curcuma zedoaria Rosc； HepG2 cells； Apoptosis； NF-κB p65

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球是第五個(gè)最常見(jiàn)的癌癥，由于乙型肝炎和丙型肝炎病毒感染的傳播其發(fā)病率正在世界范圍內(nèi)不斷增加，特別是肝硬化患者最易發(fā)生[1]。我國(guó)是肝細(xì)胞肝癌高發(fā)區(qū)，且死亡率均高于世界其他國(guó)家的平均水平，每年全球新發(fā)的肝癌病例中，我國(guó)就占到一半以上[2]。目前肝癌的治療手段仍以化療和早期手術(shù)切除為主，但能手術(shù)切除者僅占10%～15%[3]。因此肝癌的內(nèi)科治療對(duì)于中晚期患者來(lái)說(shuō)顯得非常重要。中藥可作用于腫瘤發(fā)生和發(fā)展的多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)，防止復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，副作用輕，價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)而倍受關(guān)注。所以近年來(lái)中醫(yī)藥治療腫瘤的研究的得到廣泛關(guān)注，在抗腫瘤方面取得了可喜的成就。細(xì)胞凋亡普遍存在于生物界。在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中，NF-κB的過(guò)度表達(dá)，會(huì)減少細(xì)胞凋亡發(fā)生，抑制其在腫瘤細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)，在腫瘤的治療中意義重大[4]。本文主要闡述黃芪-莪術(shù)不同提取物抑制人HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)及誘導(dǎo)其凋亡的作用和對(duì)小鼠H22荷瘤組織中NF-κB p65蛋白調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

氟尿嘧啶注射液（上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號(hào)：FA150205）；注射用環(huán)磷酰胺 （CTX，山西普德藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：04141102）；黃芪 （產(chǎn)自甘肅，生產(chǎn)批號(hào)：150502），莪術(shù)（產(chǎn)自廣西，批號(hào)：150403），均購(gòu)買于毫州成源中藥飲片有限公司。

1.2 試劑

CCK-8 （日本同仁，批號(hào)：FJ692）；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（凱基生物，批號(hào)：20150528）；NF-κB p65（北京博奧森生物，批號(hào)：AE063028）。

1.3 動(dòng)物與瘤株

昆明種小鼠[（購(gòu)自北京海淀興旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)，雌雄各半，許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0013）]；HepG2 細(xì)胞由山西醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物教研室惠贈(zèng)；H22細(xì)胞由山西省腫瘤醫(yī)院惠贈(zèng)。

1.4 儀器

BioTeK酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTeK）；Cytomics流式細(xì)胞儀（美國(guó)BECKMAN，F(xiàn)C 500型）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠，RE-6000A型）；離心沉淀機(jī)（上海醫(yī)用分析儀器廠，LXJ-Ⅱ型）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，101-2-S型）。

1.5 方法

1.5.1 藥物提取 稱取黃芪-莪術(shù)（1∶1）各200 g，粉碎成粗粉。（1）采用95%乙醇對(duì)黃芪-莪術(shù)中的揮發(fā)油以及極性較小的脂溶性成分進(jìn)行提取。將粗粉加6倍量95% 乙醇，回流提取3次，每次1 h，合并提取液，濃縮干燥，即得95% 乙醇提取物。（2）采用50%乙醇對(duì)黃芪-莪術(shù)中的三萜類、皂苷類以及黃酮類等中等極性成分進(jìn)行提取。方法同（1）。（3）采用水提醇沉法對(duì)黃芪-莪術(shù)中的粗總多糖進(jìn)行提取。將兩藥材加8倍量水，提取3次，合并提取液，濃縮至一定體積后加三倍體積80%乙醇沉，放置過(guò)夜，離心，收集沉淀物，干燥，即得水提醇沉提取物。（4）采用水煎煮法對(duì)黃芪-莪術(shù)混合進(jìn)行提取。將兩藥材加8倍量水，提取3次，每次1.0 h，合并提取液，濃縮干燥，即得水煎提取物。

1.5.2 黃芪-莪術(shù)不同提取物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響 （1）細(xì)胞增殖抑制率：收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，離心，去上清，加入37℃預(yù)熱培養(yǎng)基混勻，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞接種濃度為：1.5×105個(gè)/mL，接種于96孔板，每孔100 μL，放入37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，各組給藥終濃度分別為：95%乙醇提取物組（800、400、200、100、50 μg/mL）；50%乙醇提取物、水提醇沉物組和傳統(tǒng)水煎物組（2000、1000、500、250、125 μg/mL），陽(yáng)性對(duì)照組為順鉑 2 μg/mL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在加藥后24 h，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)每個(gè)組的OD450值，分別計(jì)算細(xì)胞抑制率，每組結(jié)果用三個(gè)復(fù)孔平均值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖抑制率=（陰性組OD450-實(shí)驗(yàn)組OD450）/（陰性組OD450-空白組OD450）×100%。（2）細(xì)胞凋亡率：根據(jù)CCK-8的結(jié)果選取黃芪-莪術(shù)95%乙醇提取物組 （400 μg/mL）；50%乙醇提取物、水提醇沉物組和傳統(tǒng)水煎物組（2000 μg/mL）進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL，接種于6孔板，給藥24 h后，1000轉(zhuǎn)/min離心5 min，收集細(xì)胞，用1×PBS洗兩遍，根據(jù)試劑及流式細(xì)胞儀器說(shuō)明檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞凋亡情況。

1.5.3 黃芪-莪術(shù)不同提取物對(duì)小鼠H22荷瘤生長(zhǎng)抑制作用 在無(wú)菌條件下，將H22小鼠乳白色腹水，按1∶10加入生理鹽水，沖打混勻。醫(yī)用酒精消毒小鼠右上腋窩部位，皮下接種0.2 mL細(xì)胞懸液。分為模型組、陽(yáng)性組、95% 醇提組、50%醇提組、水提醇沉組、傳統(tǒng)水煎組共6組，每組10只，雌雄各半。接種24 h后給藥，灌胃給藥，模型組每天灌等劑量的生理鹽水，陽(yáng)性組給予環(huán)磷酰胺（30 mg/kg），隔天腹腔注射。連續(xù)灌胃11 d后，稱重，在無(wú)菌條件下剝離瘤塊并稱重。腫瘤抑制率=（模型組平均瘤重-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%。

1.5.4 免疫組化法檢測(cè)H22小鼠荷瘤組織中NF-κB p65分子表達(dá)情況 將H22荷瘤組織放入4% 的多聚甲醛固定，常規(guī)脫水后用石蠟包埋，厚度4 μL連續(xù)切片，按照試劑盒的說(shuō)明完成免疫組織化學(xué)染色。用Image Pro-Plus 6.0軟件400倍拍攝照片，選擇陽(yáng)性目標(biāo)染色區(qū)域，測(cè)量其累積分光密度（IOD Sum）和面積累加值（area Sum），結(jié)果用平均積分光密度（mean density）=（IOD Sum）/（area Sum）表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05代表具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 黃芪-莪術(shù)四種不同的提取物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用

用CCK-8法檢測(cè)黃芪-莪術(shù)四種不同提取物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響，95%乙醇、50%乙醇、醇沉和水煎提取物最高抑制率分別為89.13%、78.36%、20.38%、18.78%，見(jiàn)表1。

2.2 黃芪-莪術(shù)不同提取物對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

經(jīng)黃芪-莪術(shù)不同提取物處理24 h后的HepG2肝癌細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，95%醇提物、50%醇提物、醇沉物和水煎物組早期凋亡率分別為49.6%、46.2%、10.1%、12.3%。與陰性對(duì)照組比，95%醇提物和50%醇提物組能明顯誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，見(jiàn)封三圖3。

2.3 黃芪-莪術(shù)不同提取物體內(nèi)對(duì)H22實(shí)體瘤的抑制作用

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，黃芪-莪術(shù)四個(gè)提取物組的平均瘤重低于模型組，與模型組相比均有顯著性差異，95%醇提取物組、50%乙醇提取物組、醇沉提取物組、水煎提取物組抑瘤率分別為47.55%、36.12%、29.96%、34.68%，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 各組H22荷瘤組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與模型組相比，95%醇提取物組和50%醇提取物組中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平降低，差異有顯著性（P<0.01），醇沉物和水煎物組有降低趨勢(shì)，但是與模型組相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3、封三圖4。

3 討論

黃芪為補(bǔ)氣類代表藥物，具有補(bǔ)氣固表，利尿脫毒、排膿、斂瘡生肌等功效?，F(xiàn)代研究表明其主要成分為多糖類、黃酮類、皂苷類以及微量元素和氨基酸等成分[5]。莪術(shù)為行氣活血類代表藥物，具有行氣破血，消積止痛的功效，用于癥瘕痞塊，瘀血閉經(jīng)，食積脹痛等癥?，F(xiàn)代研究表明其主要成分是莪術(shù)油[6]。二者的有效成分對(duì)某些腫瘤細(xì)胞有直接的抑制作用，且在機(jī)體整體水平有抑瘤作用，如治療胃癌、肝癌、婦科腫瘤等方面已發(fā)揮初步成效[7-9]。本實(shí)驗(yàn)用不同種屬來(lái)源肝癌細(xì)胞人HepG2肝癌細(xì)胞和小鼠H22肝癌細(xì)胞為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)黃芪-莪術(shù)95%乙醇提取物、50%乙醇提取物、水提醇沉物和水煎提取物雖然對(duì)小鼠肝癌H22荷瘤都有一定抑制作用，但是只有95%乙醇提取物和50%乙醇提取物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞有明顯抑制作用。

細(xì)胞凋亡（apoptosis）是機(jī)體細(xì)胞一種自發(fā)的、有條理的生理代謝過(guò)程。細(xì)胞凋亡與生物的發(fā)育、機(jī)體免疫功能穩(wěn)定以及腫瘤的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。腫瘤的發(fā)生最主要的原因就是一系列可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡啟動(dòng)的因子（ced基因家族、Caspase基因家族、P53基因等）受到抑制，使細(xì)胞凋亡程序不能正常啟動(dòng)從而不能清除癌基因及其產(chǎn)物。所以細(xì)胞凋亡激活細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡的程序，特異的殺傷腫瘤細(xì)胞，是腫瘤治療的重要手段。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，四個(gè)黃芪-莪術(shù)提取中，只有95%乙醇提取物和50%乙醇提取物可以明顯誘導(dǎo)人HepG2肝癌細(xì)胞凋亡，所以黃芪-莪術(shù)95%乙醇提取物和50%乙醇提取物誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡是二者抗腫瘤作用機(jī)制之一。

NF-κB（nuclear factor-κB）是一種細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)而備受關(guān)注。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中常以NF-κB p65與NF-κB p50 結(jié)合形成二聚體。NF-κB的激活受廣泛的信號(hào)調(diào)節(jié)，其中大多數(shù)信號(hào)與細(xì)胞應(yīng)激有關(guān)[10，11]。靜息狀態(tài)下，NF-κB主要與其抑制因子（I-κBα）結(jié)合形成復(fù)合體定位于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)被淋巴因子、細(xì)胞因子、藥物等激活后，I-κBα被水解釋放出NF-κB，最后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核[12]。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路都處于持續(xù)激活狀態(tài)。激活的NF-κB可以抑制TNF-α、促進(jìn)VEGF等的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移[13]。研究表明[14，15]，黃芪、莪術(shù)有抑制胃癌和乳腺癌細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)作用。本文研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，NF-κB p65蛋白的表達(dá)量只在95%乙醇提取物和50%乙醇提取物組明顯降低 （P<0.01）。提示黃芪-莪術(shù)95%乙醇提取物和50%乙醇提取物抗腫瘤作用與有降低NF-κB p65蛋白降低有關(guān)。

綜上所述，黃芪-莪術(shù)95%乙醇、50%乙醇、水提醇沉和水煎四種提取物均有抑制小鼠H22荷瘤生長(zhǎng)的作用，其中只有95%乙醇和50%乙醇提取物有抑制H22荷瘤組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)和抑制人肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)及誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡的作用。

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（收稿日期：2016-12-09）