山奈酚延緩db/db小鼠腎損傷研究

吳巧敏　倪海祥　盧笑　袁曉　駱陽陽　金雅美

【摘 要】：目的 觀察山奈酚（KPF）干預(yù)自發(fā)肥胖2型糖尿病小鼠（db/db鼠）早期糖尿病腎病，并探討相關(guān)機制。方法 24只健康雄性10周齡db/db鼠隨機分為4組：不同劑量KPF給藥組（50、200 mg/kg）、db/db對照組和二甲雙胍（0.2 g/kg）陽性對照組，并設(shè)db/m對照組。連續(xù)灌胃給藥10 周，檢測小鼠血清肌酐（SCr）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），24小時尿白蛋白排泄率（UAER）；留取腎組織，作病理形態(tài)學(xué)檢查、實時定量PCR檢測腎組織TNF-α、IL-6的mRNA表達、Western blot檢測磷酸化核因子κB p65（ p-NF-κBp65）、磷酸化核因子κB抑制蛋白α（p-IκBα）、核因子κB抑制蛋白α激酶（IKKα）蛋白的表達水平。結(jié)果 不同劑量KPF干預(yù)10周，都能使db/db小鼠24小時UAER、SCr、IL-6、TNF-α水平下降，腎組織IL-6、TNF-α基因表達水平明顯降低（P<0.01、0.05），p-NF-κBp65、IKKα和p-IκBα蛋白表達水平下降（P<0.01）。結(jié)論 KPF可通過抑制核因子κB（NF-κB）介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，對自發(fā)2型糖尿病小鼠早期的腎臟損害起到保護作用。

關(guān)鍵詞：山奈酚；糖尿病腎??；抗炎作用

中圖分類號：R34 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1009_816x（2017）0？_？_0？

[Abstract] Objective To explore the effects of kaempferol（KPF）on renal tissues and to elucidate its underlying inflammatory molecular mechanism in db/db mice.Methods Twenty-four male db/db mice were randomly divided into four groups：Two groups were orally administered a low or high dose of KPF （50 or 200 mg/kg， respectively）， one control group and one positive control （metformin hydrochloride 0.2 g/kg） group. Six male db/m mice were set as normal control group. After 10 weeks treatment， 24 hour urinary albumin excretion （UAER）、SCr were detected； the gene expression of tumor necrosis factor-α（TNF-α），and interleukin-6（IL-6） were measured by real time PCR； the protein expression of IKKα、phospho-IκBα、phospho-NF-κBp65 were evaluated by Western blotting.Results After 10 weeks of KPF treatment，the urinary albumin excretion and the SCr were reduced，the gene expressions of TNF-α and IL-6 were inhibited.Importantly， the protein expression level of IKKα、phospho-IκBα、phospho-NF-κBp65 in renal tissue was significantly decreased（P<0.01、0.05）. Conclusion ： Kaempferol has protective effects on renal tissues through inhibiting NF-κB pathway and related inflammation in db/db mice.

Key words： kaempferol； diabetic kidney disease ； anti-inflammation

糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，其進展為終末期腎?。╡nd-stage renal disease， ESRD）的速度較一般腎臟疾病更為迅速[1]，已成為血液透析治療的最主要的原因。山奈酚（Kaempferol，KPF），是廣泛存在于食物、中草藥中的一種類黃酮化合物，已經(jīng)有多項研究發(fā)現(xiàn)它具有防癌、抗癌、抗氧化、抗病毒及調(diào)節(jié)免疫等功效[2]。近年來多項體外試驗及動物研究還表明它有抑制β細胞凋亡、改善胰島素敏感性、抑制醛糖還原酶的活性、降低炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激等作用，在糖尿病及并發(fā)癥的防治中有很大的應(yīng)用前景[3～5]。然而，有關(guān)KPF防治DKD的動物研究報道很少。先天自發(fā)性肥胖2型糖尿病模型小鼠db/db鼠的糖尿病及DKD進程與人類2型糖尿病及腎病的早期表現(xiàn)極為相似，因此本研究選用該小鼠模型作為研究對象，觀察KPF對2型糖尿病早期DKD的作用，并初步探討可能的分子學(xué)機制，為篩選治療DKD的藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：無特定病原體級健康雄性10周齡C57BL/KsJ db/db小鼠24只，對照db/m小鼠6只 （南京大學(xué)動物模式所），分別為39～44 g及19～22 g。飼養(yǎng)環(huán)境溫度21～23℃，分籠標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由攝水，12 h交替照明。動物實驗符合國家《實驗動物管理條例》和《浙江省實驗動物管理實施辦法》要求。

1.1.2 主要試劑：KPF（HPLC測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%，批號96353，美國Sigma）；二甲雙胍（Metformin，上海信宜制藥）；血生化測定試劑盒（德賽診斷系統(tǒng)上海有限公司）；尿蛋白測定試劑盒、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）測定ELISA試劑盒購自武漢貝茵萊；Trizol、PCR試劑盒、引物（美國，Thermo）；核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB），IKKα（美國，abcam），p-IκBα、p-NF-κB p65、GAPDH兔多抗（美國Cell Signal Technology），二抗羊抗兔等標(biāo)記二抗（碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組：：24只10周齡db/db小鼠，經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，應(yīng)用葡萄糖氧化酶法檢測小鼠血糖（BG），超過11.1 mmol/L的按照數(shù)字表法隨機分為4組：實驗對照組、兩個不同劑量（50mg/kg、200 mg/kg）KPF實驗組及二甲雙胍（200mg/kg）陽性對照組，6只10周齡db/m小鼠作為空白對照組；KPF以植物油將其配成20mg/ml，二甲雙胍用生理鹽水配成20mg/ml；實驗組小鼠每日17：00以相應(yīng)藥物及劑量灌胃1次，空白對照組和實驗對照組則以相同的方式給予等量的植物油。持續(xù)用藥10周。

1.2.2 標(biāo)本的收集及檢測：10周后，用代謝籠收集大鼠24 h尿液采用酶聯(lián)免疫法測定尿白蛋白排泄率（UAER）；經(jīng)心臟穿刺采血，采用日立全自動生化分析儀測定BG、SCr、甘油三酯（TG） 、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C），應(yīng)用ELISA法測定血清IL-6和TNF-α水平，由小鼠體重及右腎臟重量得出腎臟指數(shù)（KI，KI=右腎臟重量/小鼠體重）（mg/g）。用10%水合氯醛按0.04 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，取腎組織用4%甲醛固定，用于病理學(xué)檢測。

1.2.3 采用HPIAS-2000高清晰度彩色圖文病理分析系統(tǒng)軟件進行病理圖像分析：在PAS染色中，每組選8個樣本，每份樣本均在40倍顯微鏡下，視野上、下、左、右、中各取2個腎小球（共10個）， 數(shù)碼攝像頭采集腎小球圖像，在高倍鏡下進行病理分析，每個切片隨機選擇10個正切的腎小球，測定腎小球平均截面積（MGA），取其平均值作為每個標(biāo)本的MGA，采用Raij L[6]的半定量評分系統(tǒng)評價腎小球的損傷程度，計算腎小球硬化指數(shù)（GSI）。

1.2.4 實時定量PCR檢測TNF-α、IL-6的mRNA表達：Trizol提取腎組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。熒光定量PCR技術(shù)檢測TNF-α、IL-6基因轉(zhuǎn)錄水平，GAPDH作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析：ABI Prism 7300 SDS Software進行各組間基因轉(zhuǎn)錄水平的比較。1.2.5 Western blot檢測IKKα、p-IκBα及p-NF-κB p65蛋白的表達水平：以GAPDH作為內(nèi)對照，進行各組間蛋白表達的比較，應(yīng)用Image J分析目的蛋白及內(nèi)參蛋白灰度值，計算相對灰度值，進行組間比較。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計軟件用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件。計量數(shù)據(jù)采用 （？X±S）表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠生化及炎癥指標(biāo)比較： 與db/m組比較，db/db對照組小鼠BG與血脂、KI、SCr、UAER、血清IL-6和TNF-α水平都明顯升高（P<0.01）；與db/db對照組相比，不同劑量KPF及二甲雙胍的處理使小鼠BG及SCr、UAER、IL-6、TNF-α水平都有明顯下降（P<0.01），但TG僅在二甲雙胍組及大劑量KPF組有下降（P<0.05）， KI僅在二甲雙胍組有下降（P<0.05），TC、LDL-C、HDL-C水平都沒有下降（P>0.05），見表1和表2。

2.2 腎臟組織學(xué)觀察 光鏡下PAS染色結(jié)果顯示，db/m組腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)正常，毛細血管清晰；db/db對照組腎小球肥大變形，內(nèi)皮細胞數(shù)量明顯增多，可見部分腎小管上皮細胞空泡變性、排列不整齊；與db/db對照組相比，不同劑量KPF治療組、及二甲雙胍陽性對照組腎小管和腎小球損害明顯減輕，腎組織細胞數(shù)量減少，

2.3 腎小球截面積（GMA）和硬化指數(shù)（GSI）比較： 與db/m組比較，db/db對照組小鼠GMA和GSI都明顯升高（P<0.01）；與db/db對照組小鼠比較，不同劑量KPF或二甲雙胍處理都未能使GMA和GSI發(fā)生明顯變化（P>0.05），見表2

3 討論

DKD發(fā)病機制復(fù)雜，近年來，越來越多的證據(jù)顯示炎癥機制與DKD的發(fā)展密切相關(guān)，且認(rèn)為DKD是一種炎癥性疾病，阻斷炎癥反應(yīng)的治療方案，有可能成為治療糖尿病腎病的新方法[7]。

本研究小組的前期研究發(fā)現(xiàn)[5]，SD鼠經(jīng)高脂高糖飼料及鏈脲佐菌素（STZ）多次腹腔注射誘導(dǎo)制備2型糖尿病大鼠模型， 較正常對照組大鼠血清IL-6及TNF-a的水平都明顯上升；在本研究中也發(fā)現(xiàn)db/db小鼠較db/m小鼠血清IL-6及TNF-a水平的明顯上升。這些結(jié)果表明炎癥因素在糖尿病及并發(fā)癥發(fā)生和進展方面都有作用。經(jīng)KPF處理10周后可明顯降低高脂及STZ誘導(dǎo)的SD大鼠血糖水平，改善胰島素抵抗，恢復(fù)血脂至正常水平，且伴有血清IL-6及TNF-a水平的明顯下降[5]。在本實驗中，以db/db小鼠為研究對象，同樣的方法KPF或二甲雙胍處理10周，血糖有明顯下降，雖不能使小鼠血脂水平有改善，但小鼠尿蛋白排泄率及血肌酐有明顯下降，也能明顯降低小鼠血清IL-6及TNF-a水平，腎組織的IL-6 mRNA及TNF-a mRNA的表達水平也明顯下降，且腎組織病理表現(xiàn)為腎小管和腎小球損害明顯減輕，腎組織細胞數(shù)量減少。這些都表明KPF可通過抑制炎癥因子的表達減輕db/db小鼠的腎臟損傷。另外，雖然同為嚙齒類動物，高脂食物和藥物誘導(dǎo)的2型糖尿病SD鼠和先天性瘦素受體基因突變的自發(fā)2型糖尿病小鼠db/db鼠對于KPF及二甲雙胍這兩種藥物血脂的反應(yīng)不同，可能同兩種動物血脂升高的機理不完全相同有關(guān)，也可能與用藥時間較短，以及實驗動物數(shù)量較少導(dǎo)致的統(tǒng)計誤差。

對于KPF抑制炎癥因子表達的分子學(xué)機制，本實驗進行了初步的探討。已知有多種信號通路參與或介導(dǎo)DKD的炎癥反應(yīng)過程。核因子κB（Nuclear Factor-kappa B，NF-κB）是廣泛存在于細胞質(zhì)中的快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，可調(diào)控多種基因的表達，包括IL-6、TNF-a基因等，在DKD發(fā)病中起著重要作用[8]。越來越多的證據(jù)表明，NF-κB信號通路是許多DKD致病因素連接的細胞信號通路的核心[9]，是腎小球系膜細胞表達多種免疫炎癥相關(guān)基因的調(diào)控樞紐。NF-κB的活化是一個非常復(fù)雜的過程，IkBa的磷酸化是NF-κB活化的關(guān)鍵。未活化的NF-κB存在于細胞質(zhì)中，以P65亞基與IkB-a結(jié)合，覆蓋在P50核定位信號上，在細胞中以P50-P65-IkB-IX多聚體的形式處于無活性狀態(tài)。當(dāng)細胞受到細胞因子、LPS、氧自由基等刺激時，激活I(lǐng)KKa使IkB-a磷酸化為p-IKBα從NF-κB復(fù)合物上解離，導(dǎo)致NF-κB活化進入細胞核中，與相應(yīng)的靶基因相結(jié)合，從而產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)，引發(fā)炎癥反應(yīng)[10]。腎組織p-NF-κBp65、IKKα和p-IKBα升高，都提示NF-κB信號通路的激活。本研究發(fā)現(xiàn)，20周齡的db/db小鼠腎組織p-NF-KBp65、IKKα和p-IKBα蛋白表達水平較同齡的db/m小鼠顯著上升；而經(jīng)過50mg/kg或200mg/kg KPF每日灌胃10周處理的db/db小鼠，出現(xiàn)血糖下降，雖血脂未明顯變化，但p-NF-KBp65、IKKα和p-IKBα蛋白的表達水平明顯下降，伴隨著腎組織IL-6及TNF-a mRNA的表達水平、血清IL-6及TNF-a水平明顯下降，提示KPF可通過抑制NF-κB信號通路的激活，進而下調(diào)TNF-α、 IL-6等炎癥因子表達起到抗炎、保護腎臟的作用。

本研究充分說明了KPF在治療2型糖尿病早期腎臟并發(fā)癥中的療效，提示其可能成為DKD綜合治療中的一個極具潛能的藥物，也將為DKD的防治開辟一個新的途徑。

參考文獻

[1] Rossing P. Diabetic nephropathy： Worldwide epidemic and effects of current treatment on natural history [J].？Curr Diabetes Rep， 2006， 6（6）： 479-483.

[2] 陳育華，周克元，袁漢堯，等. 山奈酚藥效的研究進展 [J] . 廣東醫(yī)學(xué)，2010， 31 （8）： 1604-1606.

[3] Li H， Ji HS， Kang JH， et al. Soy Leaf Extract Containing Kaempferol Glycosides and Pheophorbides Improves Glucose Homeostasis by Enhancing Pancreatic β-Cell Function and Suppressing Hepatic Lipid Accumulation in db/db Mice [J] . Agric Food Chem， 2015， 63 （32） ： 7198-7210.

[4] Al-Numair KS， Chandramohan G， Veeramani C， et al. Ameliorative effect of kaempferol， a flavonoid， on oxidative stress in streptozotocin-induced diabetic rats [J] . Redox Rep. 2015， 20 （5） ： 198-209.

[5] 吳巧敏，金雅美，倪海祥. 山柰酚對2型糖尿病大鼠慢性并發(fā)癥相關(guān)因子的影響 [J] . 中草藥，2015， 46 （12） ： 1806-1809.

[6]. Raij L， Azar S， Keane W. Mesang ial immune injur y， hypertension and progressive glomerular damag e in Dahl rats[J].Kidney Int， 1984， 26（ 2） ： 137-143.

[7] Barutta F ，Bruno G ，Grimaldi S ，et al. Inflammation in diabetic nephropathy ：moving toward clinical biomarkers and targets for treatment[J]. Endocrine， 2014， 26 （1） ： 65-69.

[8]Wada J，Makino H.Inflammation and the pathogenesis of diabetic nephropathy[J].Clin Sci（Lond），2013， 124（3）： 139—152.

[9] Navarro JF， Milena FJ， Mora C， León C， et al. Tumor necrosis factor-alpha gene expression in diabetic nephropathy： relationship with urinary albumin excretion and effect of angiotensin -converting enzyme inhibition[J]. Kidney Int Suppl， 2005， （99）：S98-102.

[10]Yamazaki S，Muta T，Takeshige K.A novel IkB protein，IkB—zeta，induced by proinflammatory stimuli，negatively regulates nuclear fatcor-kB in the nuclei[J].J Biol Chem， 2001， 276（29）：27657-27662.

（收稿日期：2016-11-21）