山楂葉黃酮類成分的測定方法研究進展*

王領(lǐng)弟，臧亞茹，邢 婧，劉振華，徐寶欣，潘海峰△

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所/河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室)

山楂葉黃酮類成分的測定方法研究進展*

王領(lǐng)弟1，臧亞茹1，邢 婧1，劉振華1，徐寶欣2，潘海峰2△

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所/河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室)

山楂葉；黃酮類成分；測定方法；質(zhì)量控制

山楂葉作為常用中藥材被收載于《中國藥典》2010版一部，具有活血化瘀、理氣通脈、化濁降脂的作用，用于氣滯血瘀、胸痹心痛、胸悶憋氣、心悸健忘、眩暈耳鳴和高脂血癥[1]。研究表明，山楂葉生理活性的主要成分為黃酮類成分，包括牡荊素、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、蘆丁、槲皮素等[2-6]。本文就近年來對山楂葉黃酮類成分的測定方法研究進展進行綜述，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 黃酮類成分的定性檢測

1.1 顯色反應(yīng)

1.1.1 紫外光下呈色反應(yīng)：取山楂葉樣品溶液點在濾紙上，在可見光下呈灰黃色，在紫外光下呈棕色并有熒光斑點。

1.1.2 三氯化鋁反應(yīng)：取山楂葉樣品溶液點在濾紙上，滴加1%三氯化鋁乙醇溶液，吹干呈灰黃色，在紫外光下呈黃綠色熒光斑點。

1.1.3 氨水反應(yīng)：取山楂葉樣品溶液點在濾紙上，將濾紙在氨水上方熏半分鐘，立即在紫外光下觀察，呈黃綠色熒光斑點。

1.1.4 鹽酸-鎂粉反應(yīng)：取山楂葉樣品溶液1ml于試管中，加適量鎂粉，滴加濃鹽酸數(shù)滴，呈桃紅色泡沫反應(yīng)。

1.1.5 鋯-枸櫞酸反應(yīng)：取山楂葉樣品溶液1ml于試管中，滴加2%氫氧化鋯，此時溶液呈黃色；再滴加2%枸櫞酸甲醇溶液，并加水稀釋，此時黃色減退，再加水則為無色。

1.1.6 乙酸鎂反應(yīng)：取山楂葉樣品溶液點在濾紙上，滴加1%乙酸鎂甲醇溶液，吹干，紫外光下呈黃色斑點。

1.2 紙層析 取山楂葉樣品溶液點在濾紙上，用正丁醇-醋酸-水=4：1：5為展開劑，上行展開4小時，取出晾干。噴1%氯化鋁乙醇溶液，吹干后于紫外燈下檢視，可見相應(yīng)熒光斑點。

1.3 聚酰胺薄膜色譜法 取山楂葉樣品溶液點在聚酰胺薄膜上，以醋酸為展開劑，展開后晾干。噴1%三氯化鋁醇溶液，吹干后于紫外燈下檢視，可見相應(yīng)熒光斑點[7]。

1.4 液質(zhì)聯(lián)用法 液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS）是以液相色譜作為分離系統(tǒng)、質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)，樣品在質(zhì)譜部分和流動相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖。喬曉莉等[8]以0.1%甲酸水溶液-乙腈為流動相，采用UPLC/ESI-TOF/MS獲得山楂化學(xué)成分的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，高效、準確地鑒別了牡荊素葡萄糖苷、金絲桃苷、槲皮素等黃酮類成分。許紅蕾等[9]以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相，通過液相色譜-二極管陣列光譜檢測-電噴霧離子化質(zhì)譜（HPLC-DAD/ESI-MS）聯(lián)用技術(shù)，定性分析出山楂葉中牡荊素、牡荊素-2"-O-鼠李糖苷、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素-3-鼠李糖-半乳糖苷、牡荊素-4"-O-乙酰-2"-O-鼠李糖苷等黃酮類成分， 該方法靈敏度高、專屬性強。

2 黃酮類成分的定量測定

2.1 分光光度法 分光光度法是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸光度或發(fā)光強度，對該物質(zhì)進行定性和定量分析的方法。張文莉等[10]采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH和AlCl3兩種顯色系統(tǒng)，以蘆丁為對照品，采用紫外-可見分光光度法測定山楂葉提取物中總黃酮的含量。結(jié)果：NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法（510nm）測定含量為86.15%，AlCl3顯色法（272nm）測定含量為35.19%，兩種方法所得測定結(jié)果相差較大，但對于何種方法更適合用于山楂葉提取物中總黃酮的測定還有待進一步研究。楊少冉等[11]用紫外-可見分光光度法測定了不同采收期承德產(chǎn)山楂葉中總黃酮的含量，進行動態(tài)分析，結(jié)果以6月份所含總黃酮含量最高。

2.2 三波長分光光度法 在雙波長測定方式中，一般是尋找干擾成分的等吸光點，從而使整個吸收光譜上下平移來消除干擾成分的影響，但往往會碰到干擾成分的吸收光譜沒有吸收峰，因而找不到合適的等吸光點的情況，此時用雙波長法必然會影響測定的準確度。三波長分光光度法除了能將吸收光譜上下平移，也能校正它的傾斜度，因而當(dāng)在干擾成分的吸收光譜上找不到等吸光點時，應(yīng)用三波長測定法更加準確[12-13]。張?zhí)m杰等[14]以λ1=463nm、λ2=417nm、λ3=382nm的三波長分光光度法測定山楂葉、果總黃酮的含量，有效地消除了吸收峰不對稱給黃酮定量分析造成的影響，并校正了干擾組分的吸收光譜產(chǎn)生的基線傾斜，提高了定量分析的準確度。

2.3 高效液相色譜法 高效液相色譜（HPLC）是以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。因具有操作簡便、快速、準確可靠、重現(xiàn)性好和專屬性強等特點，HPLC法已廣泛應(yīng)用于山楂葉黃酮類成分的含量測定。王肖等[15]以0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）-四氫呋喃（C）為流動相，用HPLC法對山楂葉樣品溶液進行梯度洗脫，對不同月份的承德產(chǎn)山楂葉中牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷進行了含量測定，結(jié)果：牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷和金絲桃苷的含量均以6月份最高，牡荊素和蘆丁的含量均以7月份最高。張文潔等[16]以甲醇-乙腈-四氫呋喃-0.4%醋酸水（6：：1.5：18.5：74）為流動相，首次采用HPLC法梯度洗脫對山楂葉總黃酮中多酚類成分的藥代動力學(xué)進行研究，確定了牡荊素-4"-O-葡萄糖苷（VG）、牡荊素-2"-O-鼠李糖苷(VR)和牡荊素(VIT)在血漿樣品中含量的測定方法，該方法專屬性強，分離度較好。張雪瑩等[17]采用多波長RP-HPLC法，以乙腈（A）-0.025mol/ml磷酸水（B）為流動相進行梯度洗脫，結(jié)果：在檢測波長為363nm（0-18min）和371nm（18-30min）的條件下，同時測定出了山楂葉中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的含量，該方法快速、準確、重現(xiàn)性好。

2.4 微乳液相色譜法 微乳液相色譜（MEIC）應(yīng)用較多的是水包油型反相MEIC，其分離機制是溶質(zhì)在固定相、偽固定相（表面活性劑在固定相的吸附層）、多相分散相（微乳液滴）、水相進行的動態(tài)吸附解析過程。由于分離過程的復(fù)雜性，可控參數(shù)較多，使得具有不同極性的組分在等度洗脫下，在短時間內(nèi)達到有效分離。李寧等[18]以SDS-正辛醇-正丁醇和Brij35-正辛醇-正丁醇微乳體系為流動相，選擇Venusil ASB C18色譜柱對山楂葉提取物進行分離，穩(wěn)定、快速地測定出了山楂葉提取物中牡荊素鼠李糖苷、蘆丁、牡荊素、金絲桃苷4種黃酮類成分的含量。

2.5 超高效液相色譜法 超高效液相色譜（UPLC）借助于HPLC的理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積及快速檢測手段等全新技術(shù)，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量。劉亭亭等[19]以乙腈（A）-0.3%甲酸水（B）為流動相，梯度洗脫方式，用UPLC法對含山楂葉成分的三葉片中蘆丁和金絲桃苷的溶出度進行了測定，結(jié)果準確，可重復(fù)性好。

2.6 一測多評法 一測多評是指利用中藥有效成分內(nèi)在的函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，只測定一個成分（對照品可得到者）實現(xiàn)多個成分（對照品難以得到或難供應(yīng)）的同步測定。一測多評法經(jīng)濟、方便、高效，既能解決中藥對照品匱乏的問題，又能實現(xiàn)中藥及其制劑的多組分定量。楊明宇等[20]以流動相0.1%甲酸（A）-乙腈（B）-四氫呋喃（C） 進行梯度洗脫，以牡荊素葡萄糖苷為內(nèi)參物，計算山楂葉中牡荊素葡萄糖苷對牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷的RCF值，進而進行含量測定，相對誤差均小于5%，符合考量尺度。

3 小結(jié)

山楂葉含有的黃酮類成分在心腦血管系統(tǒng)[21-22]和抗腫瘤方面[23-24]的臨床應(yīng)用具有廣闊的發(fā)展前景。目前，對黃酮類成分的研究越來越深入，對其結(jié)構(gòu)分析要求也越來越高。通過對山楂葉黃酮類成分的測定方法研究進展進行總結(jié)，以期為研究人員提供更全面的參考依據(jù)。

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R284

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1004-6879（2017）05-0424-04

2016-12-15）

* 河北省中醫(yī)藥管理局項目（2016190），承德市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目（201601A043），河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究重點項目（ZD2015097）

△ 通訊作者