三萜皂苷提取分離技術的研究進展

聶 佳，劉克明，劉永平，佟繼銘，楊明明

（承德醫(yī)學院中藥研究所/河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北承德 067000）

綜述講座

三萜皂苷提取分離技術的研究進展

聶 佳，劉克明，劉永平△，佟繼銘，楊明明

（承德醫(yī)學院中藥研究所/河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北承德 067000）

三萜皂苷；提取；分離

三萜皂苷(triterpenoid saponin)是一類具有顯著生物活性的物質，在自然界中分布較為廣泛，在雙子葉植物中分布最多，尤其在五加科、豆科、七葉樹科、報春花科、無患子科、桔?？啤⑦h志科、茶科等植物中含量較為豐富。三萜皂苷主要由糖和三萜皂苷元組成，具有較廣泛的藥理作用，尤其在抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗過敏、降血糖、防治心腦血管疾病等方面具有顯著效果。本文總結了近年來三萜皂苷分離精制的常用方法，為三萜皂苷的分離精制提供參考依據(jù)。

1 三萜皂苷類化合物的提取方法

目前，三萜皂苷類化合物的提取主要是醇法和水醇法。醇法：甲醇或乙醇提取，然后回收溶劑，再用乙醚脫脂后用水飽和的正丁醇萃取。水醇法：首先水回流提取，然后提取液濃縮,加乙醇沉淀多糖、多肽等大分子雜質，再用水飽和的正丁醇萃取[1]。

2 三萜皂苷類化合物分離精制的方法

三萜皂苷類化合物分離精制主要是應用色譜法，色譜技術由于分離效率高、操作簡單等已成為高純天然產(chǎn)物制備的主要方法。目前，實驗室常用的色譜技術按形式可分為薄層色譜、柱色譜和逆流色譜。

2.1 薄層色譜 薄層色譜根據(jù)各組分的吸附性能和分配系數(shù)的差異達到分離的目的，是一種簡單、快速、微量的分離方法，可直接使用樣品的粗提物，且顯色方法多樣，圖像易于保存，能同時分離多個樣品，通常用作柱色譜分離條件的探索，摸索柱色譜的洗脫條件。有研究顯示，以齊墩果酸作為對照品，對野生大豆皂苷進行薄層層析測定皂苷含量，結果顯示野生大豆皂苷至少還有9個部分在1-5μg范圍內呈良好的線性關系，平均回收率達98.98%，RSD值為0.41%，薄層層析斑點清晰，且分離良好，該方法簡單準確，結果可靠穩(wěn)定[2]。對于一些在薄層色譜板上分離度比較好的化合物,可以通過適當增加薄層色譜板吸附劑的厚度，采用制備型薄層色譜(PTLC)分離單體，通過增加上樣量，可用來分離毫克級的樣品，該方法不僅所需資金少，設備簡單，且能制備純度較高的皂苷。劉飛等[3]采用制備型薄層色譜技術對人參皂苷Rg2(組)混合皂苷進行分離，從50mg Rg2(組)皂苷中獲得20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg6及Rg4等4種皂苷，含量分別為2.6mg、2.8mg、1.5mg及3.9mg，純度分別為95.3%、96.4%、96.3%及98.3%。

2.2 柱色譜 柱色譜因操作簡單、成本低廉得到了普遍應用，目前實驗室應用較多的是硅膠柱色譜法和壓力液相色譜法。

2.2.1 硅膠柱色譜：硅膠柱色譜的分離原理是根據(jù)物質在硅膠上的吸附力不同而得到分離，一般情況下極性較大的物質易被硅膠吸附，極性較弱的物質不易被硅膠吸附，整個層析過程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸過程。由于硅膠色譜柱填充劑的量遠遠大于薄層板，因而硅膠柱色譜可用于分離量比較大（克數(shù)量級）的物質。目前一般選用CHCl3-CH3OH-H2O混合液作為硅膠柱層析的洗脫劑，多用于分離一些差別比較大的化合物。有研究顯示，采用氨基封尾的單分散聚合硅膠柱層析法對三七總皂苷進行分離，得到三七皂苷R1、人參皂苷Rb1組合物的純度為95.3%，此法提純皂苷單體簡單、高效、實用[4]。有研究用體積比為9.5:0.5和9:1的氯仿-甲醇洗脫液對5g絞股藍總皂苷使用硅膠柱色譜法進行分離，得到3種絞股藍皂苷單體組分，得率分別為2.6%、3.0%和5.2%，純度分別為88.73%、93.11%和78.54%[5]。還有研究以體積比為8.5:1.5的氯仿-甲醇溶液為流動相對25g三七總皂苷采用硅膠柱色譜法進行分離，得到人參皂苷Rh1單體0.36g，得率為1.44%，純度為66.08%[6]。

2.2.2 壓力液相色譜：壓力液相色譜中，目前使用最多的是高效液相色譜法，高效液相色譜法使用硅膠、反相硅膠或其它碳水化物作為色譜柱填料，可快速分離皂苷，而且只需要幾十微克純品就可以對某些簡單的皂苷進行結構鑒定。相對于薄層色譜可同時分離多個樣品，高效液相色譜每次只能分析一個樣品，且對樣品制備要求較高，然而與常規(guī)柱色譜相比，高效液相色譜填料更加精細、柱效高、分析速度快、自動化程度高，在實際操作中主要通過改變流動相的組成來調節(jié)樣品在色譜柱的保留值和選擇性，從而使不同樣品得到分離。有研究者使用高效液相色譜采用梯度法，以乙腈水溶液為流動相，分離了人參中6種主要的人參皂苷，并采用紫外檢測器進行檢測，檢測波長203mm，該方法在25mg/L-30mg/L的范圍內有良好的線性關系，回收率高于80%[7]。譚洪根等[8]使用Kromasil ODS柱，以乙腈-水(30:70)作為高效液相色譜的流動相，檢測波長為212nm，分離檢測了續(xù)斷皂苷VI的提取物，本方法具有很好的分離效果，線性范圍為0.5825-9.32μg，R=0.9999，平均回收率和重復性RSD分別是100.3%和2.3%。在分離制備比較復雜樣品、微量樣品或極性較小的樣品時，可采用反相高效液相色譜法，能達到較好的分離效果。陸娟等[9]采用RP-HPLC法檢測生脈注射液中7個人參皂苷類成分的含量，使用Zorbax SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱，以乙腈-水為流動相梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)7個人參皂苷類成分之間有良好的分離度，各組分的濃度和相應峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關系，精密度、重復性及加樣回收率的RSD均小于3%。有研究顯示，采用親水/反相二維色譜可制備出桔梗中的兩個三萜皂苷單體，經(jīng)鑒定為deapi-platycoside E和platycoside E，純度均達到90%以上[10]。

2.3 逆流色譜 逆流色譜的原理是基于樣品在旋轉螺旋管內互不混溶的兩相溶劑間因分配系數(shù)的不同而分離，無需任何載體或支撐體，能在短時間內實現(xiàn)高效分離和制備，并可以達到幾千個理論塔板數(shù)，且分離量較大，一次進樣可達幾十毫升，一次可分離近10g的樣品?；谶@一優(yōu)點，與柱色譜相比，它能有效克服固定相帶來的樣品吸附、損失、污染和峰拖尾等缺點。逆流色譜分離萜類物質時，一般選用氯仿-甲醇-水或正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水為流動相。吳永慧[11]發(fā)現(xiàn)，高速逆流色譜不僅能高效、完全分離大豆皂苷粗提物，并且能分離得到大豆皂苷單體。有研究顯示，采用醋酸乙酯-正丁醇-水-醋酸(4:1:3:0.02，V:V:V:V)作為高速逆流色譜的溶劑系統(tǒng)去離人參中的人參皂苷，流速為1.5ml/min，儀器轉速為950r/min，檢測波長254nm，分離得到3個單體皂苷和一個混合物組分，單體皂苷的純度經(jīng)高效液相色譜檢測均高于95%[12]。分離制備人參皂苷Rg1、Rf及Rd時，可采用洗脫-推擠逆流色譜技術，以乙酸乙酯-正丁醇-0.1%甲酸水(2:1:3，v/v)為溶劑系統(tǒng)，上相為固定相、下相為流動相，操作體積流量為40ml/min，切換體積為2400ml，以此為條件，從300mg樣品中分離純化得到71mg人參皂苷Rg1、21mg人參皂苷Rf和53mg人參皂苷Rd，純度分別達到96.2%、94.3%和95.1%[13]。但高速逆流色譜一次分離所需要的時間較長(以小時計)，對樣品進行分離的兩相溶劑的分配系數(shù)一般是根據(jù)實驗積累的經(jīng)驗，沒有充分的理論依據(jù)，因此，在這方面高速逆流色譜還需要進一步完善。

2.4 其它方法 隨著提取分離技術的不斷進步，不斷涌現(xiàn)出三萜皂苷類化合物分離的新方法。利用活性炭可以選擇性地吸附除人參皂苷Re(G-Re)以外的其它種類的皂苷，可分離和純化人參花芽中的人參皂苷Re[14]。目前，為提高皂苷分離的純度，大多采用幾種分離方法相結合的方法，以便充分發(fā)揮各方法的優(yōu)勢。有研究顯示，使用薄層色譜和高效液相色譜技術相結合的方法，對苜蓿皂苷進行分離檢測，首先使用甲醇溶液萃取苜?？傇碥眨月确?甲醇-水(65:35:10，下層)做薄層色譜的展開劑，將甲醇萃取液經(jīng)薄層色譜分離，然后收集不同比移值的分離組分，再將分離后的組分用高效液相進行檢測，色譜柱為Venusil Mp C18柱(2)(4.6mm×250mm)，流動相為甲醇-水(15:85)，檢測波長為200nm，結果顯示，苜蓿總皂苷經(jīng)薄層層析后分離得到5種皂苷化合物，再經(jīng)高效液相色譜法進一步分離，可得到單體苜蓿皂苷13種[15]。有研究使用高速逆流色譜結合凝膠柱層析分離一200mg的人參皂苷濃縮樣品，以溶劑配比為醋酸乙酯-正丁醇-水(4:1:6，V:V:V)作為高速逆流色譜的溶劑系統(tǒng)，得到單體52.6mg的Rg1、37.2mg的Re，純度分別為99.3%、98.2%，總回收率分別為82.4%、84.4%[16]。

對于人參莖葉總皂苷進行分離純化，可采用硅膠柱色譜及高效液相色譜等相結合的方法，使用NMR、MS等方法進行單體的化學結構鑒定，結果分離鑒定了39個化合物，其中有一個是新化合物[17]。

對于從西洋參總皂苷中分離制備人參皂苷單體，可采用正相硅膠柱層析結和反相SG-64制備色譜柱，以三氯甲烷-甲醇為流動相對硅膠柱色譜進行梯度洗脫，以甲醇-水為流動相對反相SG-64制備色譜進行梯度洗脫，分離得到6個純度超過95%的人參皂苷單體，鑒定為人參皂苷Rg1、人參皂苷La、人參皂苷Rg2、人參皂苷Re、擬人參皂苷P-F11、人參皂苷Rd[18]。

有研究表明，采用硅膠柱色譜、凝膠柱色譜結合反相色譜的方法研究金鐵鎖根皂苷的化學成分，分離鑒定了三個化合物，發(fā)現(xiàn)化合物1為新的三萜皂苷類化合物，并且化合物2、3為首次從該屬植物中分離得到[19]。

3 展望

三萜皂苷作為一類具有顯著生物活性的物質，在自然界中分布較為廣泛，其提取分離技術的發(fā)展對其藥理作用的研究至關重要。三萜皂苷常用的提取分離方法不少，但無論采用哪種方法，都存在自身的局限性，純度都不能達到最高。從目前的研究看，采用相適宜的多種分離方法相結合的方式，能充分發(fā)揮各自的優(yōu)勢和長處，彌補不足，從而使三萜皂苷單體的分離純度更高。但三萜皂苷類化合物的結構復雜，單體種類更是繁多，如何選擇合適的分離方法以使分離效率達到最高，分離方法更加簡化，提取時間更短，有機試劑的使用更少，對環(huán)境的污染更小，還需要研究人員進一步的分析探討。

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1004-6879（2017）03-0235-03

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