地喹氯銨對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響

張芳芳 李 鑫 郭偉英

(錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 錦州 121000)

地喹氯銨對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響

張芳芳 李 鑫1郭偉英

(錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 錦州 121000)

目的 探討地喹氯銨對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的影響。方法 用50、100、200 μmol/L的地喹氯銨作用于腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、U87、C6，作用時(shí)間分別為12、24、48、72、96 h，MTT檢測細(xì)胞增殖情況。流式細(xì)胞儀檢測76 μmol/L的地喹氯銨作用48 h后的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的細(xì)胞凋亡情況。Transwell小室檢測地喹氯銨對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的影響。Western印跡檢測細(xì)胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 50、100、200 μmol/L的地喹氯銨對U251、U87、C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖均具有抑制作用。地喹氯銨對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制作用隨著作用時(shí)間的增加而增加，隨著藥物作用濃度的增加而增加。地喹氯銨作用膠質(zhì)瘤U251、U87、C6細(xì)胞48 h的半數(shù)抑制濃度由大到小依次為：C6>U87>U251。76 μmol/L的地喹氯銨作用后的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.01)。腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)地喹氯銨作用后的侵襲細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組(P<0.01)。地喹氯銨作用后的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PI3K、Akt的表達(dá)水平與對照組相比無明顯差異，而p-PI3K、p-Akt的表達(dá)水平明顯下降。結(jié)論 地喹氯銨對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力具有抑制作用，對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用，作用機(jī)制與PI3K/Akt信號通路有關(guān)。

地喹氯銨；腦膠質(zhì)瘤；增殖；凋亡；侵襲

目前常用的治療腦膠質(zhì)瘤的方法是手術(shù)治療和放療〔1〕，但由于腦膠質(zhì)瘤具有發(fā)病隱匿、生長速度快、易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，手術(shù)治療和放療效果仍然不理想。地喹氯銨(DECA)是一種廣譜抗菌藥，對分枝桿菌、革蘭陰性菌、革蘭陽性菌等具有抑制作用〔2〕，對口腔潰瘍、扁桃體炎、咽炎、白血病等都具有治療作用〔3〕。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，DECA對膀胱癌、結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用〔4〕。本研究擬探討DECA對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、U87、C6購自上海慧穎生物科技公司。

1.1.2 主要儀器及試劑 酶標(biāo)儀，CO2培養(yǎng)箱，流式細(xì)胞儀，美國Thermo；水浴鍋，常州華冠儀器設(shè)備有限公司；超凈工作臺，蘇州施威克環(huán)?？萍加邢薰?；倒置顯微鏡，日本尼康；DMEM培養(yǎng)基、PI、Annexin-V、PVDF膜、MTT、青鏈霉素、胰蛋白酶，美國Sigma；胎牛血清(FBS)杭州四季青有限公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒，上海索萊寶生物科技有限公司；PI3K單克隆抗體，p-PI3K單克隆抗體，p-Akt單克隆抗體，Akt單克隆抗體，GAPDH單克隆抗體，美國Fitzgerald；辣根過氧化物標(biāo)記的二抗，杭州聯(lián)科生物股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取出放置于-80℃冰箱中的凍存細(xì)胞，迅速放置于37℃水浴鍋中融化細(xì)胞。1 min后觀察細(xì)胞完全融化后，在細(xì)胞中加入5 ml含有10%FBS的DMEM細(xì)胞生長液，充分混合后，1 000 r/min離心10 min，在細(xì)胞中加入磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，加入5 ml細(xì)胞生長液，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞長滿后，棄去細(xì)胞生長液，在細(xì)胞中加入PBS洗滌細(xì)胞2次。加入1 ml的0.25%的胰蛋白酶，放在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中消化2 min。顯微鏡下觀察細(xì)胞完全呈單個(gè)存在時(shí)，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至離心管中。1 000 r/min離心10 min，棄去上清液，在細(xì)胞沉淀中加入適量的細(xì)胞生長液，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT檢測細(xì)胞增殖情況 取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、U87、C6，小心棄掉細(xì)胞生長液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞后，1 000 r/min離心10 min，在細(xì)胞中加入適量的細(xì)胞生長液，使得每毫升細(xì)胞懸浮液中含有細(xì)胞個(gè)數(shù)為2×104個(gè)。種植于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，在細(xì)胞中加入DECA終濃度為50、100、200 μmol/L的含藥培養(yǎng)基。放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間分別為12、24、48、72、96 h。同時(shí)設(shè)置對照組和空白組，對照組中不加入DECA，加入等量的二甲基亞砜(DMSO)溶液。空白組中不加細(xì)胞，加入等量的藥物。在細(xì)胞中加入MTT溶液150 μl，充分混勻后，放置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。加入DMSO溶液孵育10 min后，酶標(biāo)儀檢測每孔的吸光度。分析細(xì)胞增殖情況。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果 取處于對數(shù)生長期的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞后，1 000 r/min離心10 min，在細(xì)胞沉淀中加入細(xì)胞生長液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，調(diào)整細(xì)胞濃度使每孔中有2×105個(gè)細(xì)胞，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。小心倒掉細(xì)胞生長液，在細(xì)胞中加入含有DECA終濃度為76 μmol/L的含藥培養(yǎng)基，放在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。同時(shí)設(shè)置對照組，對照組中用DMSO溶液代替DECA。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去細(xì)胞生長液，在細(xì)胞中加入胰蛋白酶消化細(xì)胞后，用PBS洗滌細(xì)胞2次。加入PBS重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml。收集1 ml細(xì)胞懸液中的細(xì)胞，加入500 μl的結(jié)合緩沖液，吹打混勻后，在細(xì)胞中加入Annexin V和PI各5 μl，放在室溫下反應(yīng)10 min后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.4 Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲能力 取出保存于-20℃的Transwell小室，在室溫下放置30 min。在Transwell小室的下室加入不含F(xiàn)BS的細(xì)胞生長液，放置于37℃孵育2 h。取對數(shù)生長期的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251，加入胰蛋白酶融化細(xì)胞后，1 000 r/min離心10 min，棄去酶消化液。在細(xì)胞沉淀中加入含有DECA 76 μmol/L不含胎牛血清的細(xì)胞生長液，使每毫升細(xì)胞懸液中含有4×104個(gè)細(xì)胞。在小室的下室加入500 μl的細(xì)胞生長液，在小室的上室加入細(xì)胞懸液600 μl，放在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。用棉簽擦掉Transwell小室內(nèi)側(cè)的多余細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色小室外側(cè)部分，顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況。

1.2.5 Western印跡檢測細(xì)胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt的表達(dá)情況 取經(jīng)76 μmol/L DECA作用48 h后的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251，棄去細(xì)胞生長液，在細(xì)胞中加入PBS洗滌細(xì)胞2次。加入細(xì)胞裂解液，充分混勻后，放置于冰上裂解40 min。4℃，12 000 r/min離心10 min后，轉(zhuǎn)移蛋白上清至新的EP管中。根據(jù)蛋白濃度檢測試劑盒說明書檢測提取的蛋白濃度。將提取的蛋白樣品與Loading buffer充分混合后，放在100℃的孵育器中煮沸5 min，使蛋白充分變性。取適量的變性蛋白樣品加入到上樣孔中，每孔加入50 μl，電泳初始電壓為80 V，電泳30 min后調(diào)整電壓至120 V至電泳結(jié)束。取出蛋白凝膠按照常規(guī)方法4℃電轉(zhuǎn)過夜。取出聚偏氟乙烯(PVDF)膜，以5%脫脂奶粉為封閉液在37℃封閉90 min。Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜3次，依次與一抗、二抗孵育反應(yīng)后，在暗室中曝光，分析蛋白表達(dá)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 MTT檢測細(xì)胞增殖結(jié)果 50、100、200 μmol/L的DECA對U251、U87、C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖均具有抑制作用。DECA對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制作用隨著作用時(shí)間增加而增加，隨著藥物作用濃度增加而增加。計(jì)算DECA作用U251、U87、C6細(xì)胞48 h的半數(shù)抑制濃度依次為(76.32±6.38)μmol/L、(89.65±9.47)μmol/L、(106.89±10.24)μmol/L。DECA作用于膠質(zhì)瘤U251、U87、C6細(xì)胞48 h的半數(shù)抑制濃度由大到小依次為：C6>U87>U251。見圖1。

與0 μmol/L比較:1)P<0.05，2)P<0.01；下圖同圖1 DECA對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖影響結(jié)果

2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 76 μmol/L的DECA作用后的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率〔(39.87±4.29)%〕明顯高于對照組〔(11.24±1.32)%〕(P<0.01)。

2.3 Transwell 小室檢測細(xì)胞侵襲結(jié)果 膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)DECA作用后的侵襲細(xì)胞數(shù)(139±15)明顯少于對照組(342±21)(P<0.01)。

2.4 Western印跡檢測細(xì)胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt的表達(dá)結(jié)果 DECA作用后的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PI3K、Akt的表達(dá)水平與對照組相比無明顯差異，而p-PI3K、p-Akt的表達(dá)水平明顯下降。見圖2。

圖2 DECA對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

由于腦膠質(zhì)瘤具有易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，手術(shù)治療和化療后患者的平均生存期僅有10個(gè)月〔5〕。

DECA屬于季銨類表面活性劑，是人工合成的含有兩個(gè)喹啉芳雜環(huán)的喹啉衍生物，具有廣泛的抑菌作用，早期主要用來治療口腔炎癥。DECA通過作用于微生物體內(nèi)的相關(guān)蛋白酶調(diào)控其糖酵解的過程，發(fā)揮殺菌抑菌的作用〔6〕。DECA對肺癌細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，通過調(diào)控凋亡相關(guān)因子促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡〔7〕。

細(xì)胞以分裂的方式進(jìn)行增殖。正常情況下，細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程〔8〕。細(xì)胞凋亡是一種自然狀態(tài)下的細(xì)胞死亡。這種死亡受多種基因嚴(yán)格調(diào)控，由多種因子共同作用經(jīng)過一系列復(fù)雜的過程而產(chǎn)生的。細(xì)胞凋亡是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種方式，是多細(xì)胞生命體消除多余或者異常細(xì)胞的一種重要途徑〔9〕。在癌癥的發(fā)生過程中，癌細(xì)胞的侵襲能力是癌癥發(fā)展的重要前提，是腫瘤向周圍組織侵犯的過程〔10〕。本研究中，MTT檢測結(jié)果顯示，DECA對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖具有抑制作用，且對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制作用隨著作用時(shí)間和作用濃度的增加而增加。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，DECA對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用。Transwell小室檢測結(jié)果說明，DECA對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力具有明顯的抑制作用。

在細(xì)胞增殖凋亡侵襲過程中，多種蛋白參與了這一系列復(fù)雜的過程，其中磷酸肌醇激酶(PI3K)/Akt信號通路在癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲過程中發(fā)揮重要作用〔11〕。PI3K是一種原癌基因，可以激活磷脂酰肌醇和肌醇〔12〕。Akt是蛋白激酶B的另一種叫法〔13〕。這兩種激酶組成的PI3K/Akt信號通路參與癌細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲過程〔14〕。Western印跡結(jié)果說明，DECA對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用機(jī)制是通過抑制PI3K/Akt信號通路作用的。

綜上所述，DECA對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲具有抑制作用，對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用，作用機(jī)制與PI3K/Akt信號通路有關(guān)。

1 Han G，Zhao W，Wang L，etal.Leptin enhances the invasive ability of glioma stem-like cells depending on leptin receptor expression〔J〕.Brain Res，2014；1543(2)：1-8.

2 Barrallo-Gimeno A，Gradogna A，Zanardi I，etal.Regulatory-auxiliary subunits of CLC chloride channel/transport proteins〔J〕.J Physiol，2015；593(18)：4111-27.

3 宋彥峰.腫瘤細(xì)胞線粒體靶向遞藥系統(tǒng)的構(gòu)建及其抗腫瘤活性研究〔D〕.西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2015.

4 Ortega R，Bresson C，Darolles C，etal.Low-solubility particles and a Trojan-horse type mechanism of toxicity：the case of cobalt oxide on human lung cells〔J〕.Part Fibre Toxicol，2014；11(1)：95-105.

5 王睿君，王育民，劉雁飛，等.Neuropilins-1和Neuropilins-2在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2014；34(7)：1790-1.

6 Moreno-Martínez D，Nomdedeu M，Lara-Castillo MC，etal.XIAP inhibitors induce differentiation and impair clonogenic capacity of acute myeloid leukemia stem cells〔J〕.Oncotarget，2014；5(12)：4337-46.

7 Wongrakpanich A，Geary SM，Joiner ML，etal.Mitochondria-targeting particles〔J〕.Nanomedicine，2014；9(16)：2531-43.

8 Slattum GM，Rosenblatt J.Tumour cell invasion：an emerging role for basal epithelial cell extrusion〔J〕.Nat Rev Cancer，2014；14(7)：495-501.

9 Wang CZ，Yuan P，Li Y.MiR-126 regulated breast cancer cell invasion by targeting ADAM9〔J〕.Int J Clin Exp Pathol，2015；8(6)：6547-53.

10 Lin C，Lin W，Yeh S，etal.Infiltrating neutrophils increase bladder cancer cell invasion via modulation of androgen receptor (AR)/MMP13 signals〔J〕.Oncotarget，2015；6(40)：89-91.

11 Tsubaki M，Takeda T，Sakamoto K，etal.Bisphosphonates and statins inhibit expression and secretion of MIP-1α via suppression of Ras/MEK/ERK/AML-1A and Ras/PI3K/Akt/AML-1A pathways〔J〕.Am J Cancer Res，2015；5(1)：168-79.

12 Chen H，Shi B，F(xiàn)eng X，etal.Leptin and NAP2 promote mesenchymal stem cell senescence through activation of PI3K/Akt pathway in patients with systemic lupus erythematosus〔J〕.Arthrit Rheumatol，2015；67(9)：2383-93.

13 陳振華，任春美，萬仁圣，等.PI3K/Akt信號與吳茱萸堿抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的關(guān)系研究〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016；38(5)：492-5.

14 Yang Y，Cong H，Han C，etal.12-Deoxyphorbol 13-palmitate inhibits the expression of VEGF and HIF-1α in MCF-7 cells by blocking the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway〔J〕.Oncol Rep，2015；34(4)：1755-60.

〔2016-06-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

遼寧省自然科學(xué)基金(No.2014022044)

郭偉英(1958-)，男，教授，碩士，主要從事藥物分析研究。

張芳芳(1985-)，女，在讀碩士，主要從事藥學(xué)研究。

R739.4

A

1005-9202(2017)04-0822-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.016

1 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥品管理科