地氟烷預處理對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的影響及作用機制

梁 寧 劉 玲 陳 萍

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院麻醉科，重慶 400016)

地氟烷預處理對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的影響及作用機制

梁 寧 劉 玲 陳 萍

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院麻醉科，重慶 400016)

目的 探討地氟烷預處理在大鼠離體心臟缺血再灌注(IR)中的保護作用是否與單磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)有關。方法 清潔級健康雄性大鼠50只，2～3月齡，體重250～280 g，切取離體心臟并隨機分為正常對照(C)組、IR組、地氟烷預處理+IR(DR)組、地氟烷預處理+AMPK抑制劑+IR(DC)組和IR+AMPK抑制劑(CR)組各10只。DR組和DC組在給予大鼠吸入1 MAC的地氟烷30 min后立即切取心臟。采用Langendorff灌注裝置并以95%O2～5%CO2飽和的K-H液作為灌注液，在平衡灌注15 min后，停止灌注30 min后再灌注60 min建立IR模型。分別在停止灌注前和再灌注60 min時記錄心率(HR)、左室發(fā)展壓(LVDP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dt)和左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dt)。采用caspase-3活性檢測試劑盒測定心肌組織內(nèi)caspase-3活性，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測冠脈流出液中心肌肌鈣蛋白(cTn)I濃度。采用免疫組織化學法和Western印跡法檢測心肌組織內(nèi)AMPK(Thr-172)的磷酸化水平。結果 與C組比較，IR組離體心臟再灌注60 min時HR、LVDP、+dp/dt和-dp/dt顯著降低(P<0.05)，心肌組織caspase-3活性和冠脈流出液中cTnI濃度顯著升高(P<0.05)，而AMPK(Thr-172)的磷酸化水平無顯著差異(P>0.05)。與IR組比較，DR組HR、LVDP、+dp/dt和-dp/dt顯著升高(P<0.05)，caspase-3活性和cTnI濃度顯著降低(P<0.05)，AMPK(Thr-172)的磷酸化水平顯著升高(P<0.05)。而與DR組比較，DC組HR、LVDP、+dp/dt和-dp/dt顯著降低(P<0.05)，caspase-3活性和cTnI濃度顯著升高(P<0.05)，AMPK(Thr-172)的磷酸化水平顯著降低(P<0.05)。結論 地氟烷預處理使IR后心肌組織內(nèi)AMPK(Thr-172)磷酸化水平升高而被激活，是其緩解心肌IR損傷的機制之一。

地氟烷；單磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)；心肌缺血再灌注損傷

心肌細胞能量代謝障礙是缺血再灌注(IR)時心肌受損的重要因素。單磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)能量代謝的關鍵酶〔1〕。大量研究表明，AMPK參與減輕IR后的心肌損傷〔2～5〕。地氟烷是臨床上應用日益廣泛的吸入麻醉藥。研究指出，缺血心肌在采用含地氟烷的灌注液進行再灌注時可減輕心肌IR損傷〔6〕，然而其保護機制尚不明確。目前，地氟烷的心肌保護作用是否與AMPK有關鮮有報道。本研究擬以離體大鼠心臟IR損傷作為模型，探討地氟烷預處理能否激活AMPK及AMPK是否參與地氟烷的心肌保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及離體心臟灌注模型的建立 實驗操作均嚴格遵守美國國立衛(wèi)生院《實驗動物使用和處理指南》(No.80～23,Rev.1996)的要求，通過重慶醫(yī)科大學動物倫理委員會的審查。清潔級健康雄性SD大鼠50只，2～3月齡，體重250～280 g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供。腹腔注射肝素2 U/g抗凝，10 min后腹腔注射烏拉坦1.5 g/kg的麻醉條件下將大鼠仰臥固定于手術臺上，開胸并暴露心臟，從主動脈弓處離斷主動脈后取出心臟。將離體心臟置于4℃K-H液〔成分：118 mmol/L NaCl、1.2 mmol/L MgSO4·7H2O、4.7 mmol/L KCl、1.2 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3、11 mmol/L 葡萄糖和10 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)，pH7.35〕中，剪去多余組織，并立即掛于Langendorff灌注裝置(Radnoti公司，美國)上，經(jīng)主動脈灌注95%O2～5%CO2飽和的K-H液15 min(平衡灌注)，灌注液溫36.5℃～37.5℃，灌注壓75 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)。

1.2 分組處理 采用隨機數(shù)字表法，將離體心臟隨機分為5組(n=10):正常對照(C)組、IR組、地氟烷預處理+IR(DR)組、地氟烷預處理+AMPK抑制劑Compound C+IR(DC)組和IR+Compound C(CR)組。試驗中均采用95%O2～5%CO2飽和的K-H液作為灌注液。平衡灌注完成后，C組持續(xù)灌注90 min，其余各組先停止灌注30 min，隨即再灌注60 min。DR組和DC組在給予大鼠吸入1 MAC的地氟烷30 min后再立即切取心臟。DC組和CR組在再灌注時采用含有10 μmol/L Compound C(Millipore公司，美國)的灌注液。采用地氟烷揮發(fā)罐(Dr?ger公司，德國)對地氟烷進行濃度調(diào)節(jié)。

1.3 心功能指標測定 在離體心臟左心耳做一小口，將帶乳膠球囊的導管插入左心房，并沿二尖瓣進入左心室，導管經(jīng)壓力傳感器與信號采集系統(tǒng)(型號：RM6240，成都儀器廠)連接。分別在停止灌注前(T1)和再灌注60 min時(T2)測定心率(HR)、左室發(fā)展壓(LVDP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dt)和左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dt)。

1.4 心肌組織內(nèi)caspase-3活性檢測 在心功能指標檢測完成并且冠脈流出液收集完成后，將心臟置于4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)液中清洗3次，在冰浴條件下剪碎心臟，研磨勻漿并加入裂解液裂解心肌細胞。低溫12 000 r/min離心10 min(離心半徑10 cm)，提取上清液。采用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒檢測樣本中蛋白濃度。將蛋白樣本存于-70℃?zhèn)溆谩２捎胏aspase-3活性檢測試劑盒測定蛋白樣本中caspase-3活性。按照說明書的操作進行。

1.5 冠脈流出液中心肌肌鈣蛋白(cTn)I含量測定 再灌注結束時，分別收集各組離體心臟冠脈流出液。采用大鼠cTnI酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(R&D公司，美國)并按照說明書操作。

1.6 免疫組化法檢測心肌組織內(nèi)AMPK(Thr-172)的磷酸化水平 在心功能指標檢測完成并且冠脈流出液收集完成后，將心臟石蠟包埋并切片(厚度4 μm)。經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度酒精浸泡并PBS沖洗后，在95℃條件下枸櫞酸鈉緩沖液(10 μmol/L，pH6.0)抗原修復20 min。5%山羊血清封閉1 h，孵育兔抗大鼠p-AMPK(Thr-172)抗體(1∶50，Cell Signaling公司，美國)，4℃過夜。采用免疫組化二抗試劑盒(博士德生物工程有限公司，武漢)并按照試劑盒說明書進行以下實驗。圖片結果由BX51 Olympus顯微鏡獲得。每張切片隨機獲取5個視野，并采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(Media Cybernetics公司，美國)分析視野光密度值(OD)。

1.7 Western印跡法心肌組織內(nèi)AMPK(Thr-172)的磷酸化水平 蛋白樣本的制備同測定caspase-3活性時的制備方法。蛋白樣本50 μg在80 V電壓下于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中電泳，之后將凝膠中的目標蛋白電轉(zhuǎn)于聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore公司，美國)上。含5%脫脂奶粉的Tris-鹽酸氯化鈉和Tween 20混合液(TBST)液中封閉膜2 h，之后孵以兔抗大鼠p-AMPK(Thr-172)抗體(稀釋度1∶1 000)，并在4℃環(huán)境中過夜。PBS洗滌3次(每次10 min)，將辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(博士德生物工程有限公司，武漢)孵于膜上，并在37℃環(huán)境中孵育2 h。再次PBS洗滌3次，使用電化學發(fā)光(ECL)-plus顯色劑在Bio-Rad顯色儀中顯色。采用Quentity One軟件測定條帶灰度值。以蛋白樣本中GAPDH表達量作為內(nèi)參。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0 統(tǒng)計學軟件進行單因素方差分析，兩兩比較行Tukey法。

2 結 果

2.1 各組離體心臟心功能指標的比較 各組離體心臟T1各心功能指標的值均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。T2時，與C組比較，IR組離體心臟的HR、LVDP、+dp/dt和-dp/dt顯著降低(P<0.05)；與IR組比較，DR組離體心臟的HR、LVDP、+dp/dt和-dp/dt顯著升高(P<0.05)；而與DR組比較，DC組離體心臟的HR、LVDP、+dp/dt和-dp/dt再次降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組離體心臟心功能指標的比較±s)

與C組比較:1)P<0.05；與IR組比較:2)P<0.05；與DR組比較:3)P<0.05，下表同

2.2 各組冠脈流出液cTnI濃度和心肌組織內(nèi)caspase-3活性的比較 與C組比較，IR組離體心臟在再灌注結束時的冠脈流出液中cTnI濃度、心肌組織內(nèi)caspase-3活性顯著升高(P<0.05)。與IR組比較，DR組冠脈流出液中cTnI濃度、心肌組織內(nèi)caspase-3活性顯著降低(P<0.05)。而與DR組比較，DC組冠脈流出液中cTnI濃度、心肌組織內(nèi)caspase-3活性再次升高(P<0.05)。見表2。

2.3 各組心肌組織內(nèi)AMPK(Thr-172)磷酸化水平的比較 與C組比較，IR組離體心臟心肌組織內(nèi)AMPK(Thr-172)磷酸化水平無明顯改變(P>0.05)。與IR組比較，DR組離體心臟心肌組織內(nèi)AMPK(Thr-172)磷酸化水平顯著升高(P<0.05)。而與DR組比較，DC組AMPK(Thr-172)磷酸化水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組冠脈流出液cTnI濃度和心肌組織內(nèi)caspase-3、 AMPK(Thr-172)磷酸化水平的比較

3 討 論

本研究采用參考文獻〔7〕的方法制備離體心臟IR模型，該模型排除了體液和神經(jīng)因素的影響。本研究說明IR損傷模型建立成功。本研究參考文獻〔8〕的方法在切取大鼠心臟前給予30 min 1 MAC的地氟烷吸入，使用了地氟烷的心臟進行再灌注后，心功能改善，caspase-3活性降低，冠脈流出液中cTnI濃度降低，說明地氟烷預處理的心肌保護作用。同時，地氟烷預處理提高心肌組織內(nèi)AMPK的磷酸化水平，提示其改善缺血再灌注心肌組織內(nèi)的AMPK活性。本研究參考文獻〔9〕選擇AMPK抑制劑Compound C濃度(10 μmol/L)，結果提示，地氟烷改善心肌IR損傷的作用與提高心肌組織內(nèi)AMPK的活性有關。

地氟烷預處理和后處理均能減輕心肌IR損傷，其心肌保護機制尚不明確。地氟烷的心肌保護作用可能包括抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)移孔(mPTP)開放、促進ATP敏感性線粒體鉀通道(mitoKATP)開放和促進一氧化氮的合成等〔10,11〕。本實驗揭示地氟烷的心肌保護作用可能與能量代謝調(diào)節(jié)有關。

能量代謝障礙和細胞凋亡是IR后心肌受損和心功能障礙的重要因素。心肌組織遭受IR損傷后心肌細胞內(nèi)線粒體功能障礙，使細胞產(chǎn)能受損。細胞內(nèi)能量缺乏可致胞內(nèi)生物反應無法正常完成及生物膜完整性無法正常保持，導致促凋亡因子的產(chǎn)生或從細胞器內(nèi)漏出，進而激活心肌細胞內(nèi)凋亡發(fā)生途徑，導致凋亡關鍵蛋白caspase-3的激活，這是IR時心肌細胞凋亡的途徑之一〔12〕。AMPK是調(diào)節(jié)能量代謝的關鍵酶，其第172位蘇氨酸(Thr-172)位點的磷酸化是其發(fā)揮酶活性的關鍵〔1〕。在應激條件下，AMPK能增強細胞內(nèi)的產(chǎn)能過程而抑制耗能反應，進而維持受損情況下的細胞功能。研究指出，在心肌缺血時，心肌組織內(nèi)AMPK(Thr-172)的磷酸化水平提高〔2〕，激活的AMPK能增加心肌細胞的葡萄糖攝取和糖酵解，進而減輕缺血后心肌凋亡〔3〕，這可能是心肌組織在應激條件下的自我保護反應。另外，AMPK亦能抑制胞內(nèi)促凋亡蛋白Bad的活化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激等促凋亡途徑及激活心肌細胞內(nèi)自噬相關通路進而減少心肌細胞死亡〔12,13〕。然而，缺血心肌再灌注后，AMPK的磷酸化程度較缺血時顯著降低，導致AMPK在心肌再灌注時無法繼續(xù)發(fā)揮保護作用〔2〕。本實驗提示AMPK在IR后未發(fā)揮作用。在心肌遭受IR時，地氟烷預處理通過提高心肌組織內(nèi)AMPK活性，進而可能通過調(diào)節(jié)能量代謝和抑制凋亡通路有效減少了心肌損傷。

然而，地氟烷預處理激活AMPK的機制尚不清楚。同時，采用離體心臟IR損傷模型進行實驗缺乏藥物、心臟和其他系統(tǒng)之間的相互影響。因此，需要在在體動物上進一步證實。地氟烷預處理使IR后心肌組織內(nèi)AMPK(Thr-172)磷酸化水平升高而被激活，是其緩解心肌IR損傷的機制之一。

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〔2016-03-27修回〕

(編輯 杜 娟)

Involvement of adenosine monophosphate-activated protein kinase in desflurane preconditioning-induced protection against myocardial ischemia/reperfusion injury in isolated rat hearts

LIANG Ning,LIU Ling,CHEN Ping.

Department of Anesthesiology,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

Objective To investigate the role of AMPK in desflurane preconditioning-induced myocardial ischemia/reperfusion injury attenuation in isolated rat hearts. Methods Healthy male SD rats,aged 2～3 months old,weighed 250～280 g were heparinized(2 U/g) and anesthetized. The hearts were excised and randomly divided into 5 groups(n=10):control (C) group,ischemia/reperfusion (IR) group,desflurane preconditioning + IR (DR)group,desflurane preconditioning + IR +AMPK inhibitor(Compound C) (DC) group and IR+ Compound C group(CR). The hearts were perfused in a langendorff apparatus with oxygenated(95% O2+5% CO2) K-H solution at 37℃. After 15 min of stabilization,the IR model was established with 30 min of no flow followed by 60 min of reflow. desflurane preconditioning was carried out when the rats were inhaled with 1 MAC desflurane for 30 min before the excision of the heart. Heart rate(HR),left ventricular developing pressure(LVDP),+dp/dt and -dp/dt were recorded before perfusion suspension and 60 min after reperfusion. The activity of caspase-3 in myocardial tissue was determined with a commercial caspase-3 activity assay kit,and the level of cTnI in coronary outflow was detected with ELISA assay. The phosphated level of AMPK(Thr-172) was determined with immunohistochemistry and Western blot. Results Compared with group C,HR,LVDP,+dp/dt and -dp/dt were substantially depressed and caspase-3 activity,cTnI level were markedly increased at 60 min after reperfusion in IR group. Compared with group IR,HR,LVDP,+dp/dt and -dp/dt were significantly improved and caspase-3 activity,cTnI level were decreased in group DR,accompanied by significant elevation of the phosphate level of AMPK(Thr-172). Co-adminstration of Compound C(10 μmol/L) in DC group significantly suppressed the improvement of HR,LVDP,+dp/dt and -dp/dt,elevated caspase-3 activity and cTnI level,as well as suppressed the elevation of phosphate level of AMPK(Thr-172). Conclusions Desflurane preconditioning effectively elevates the phosphate level of AMPK(Thr-172) and activates it,which is one of the mechanisms underlying desflurane preconditioning-induced cardioprotection.

Desflurane;Adenosine monophosphate-activated protein kinase;Myocardial ischemia/reperfusion injury

陳 萍(1961-)，女，碩士，教授，主任醫(yī)師，主要從事圍術期腦和心肌保護研究。

梁 寧(1984-)，男，碩士，住院醫(yī)師，主要從事圍術期腦和心肌保護研究。

R541

A

1005-9202(2017)04-0791-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.005