紅陽(yáng)獼猴桃中葡萄座腔菌的生物學(xué)特性及致病性研究

何靖柳 - 秦 文 劉曉燕 - 李洪怡 - 沈丹丹SN -

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2. 雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 雅安 625000)

紅陽(yáng)獼猴桃由四川蒼溪縣龍崗山選育而成，屬世界首個(gè)紅肉型獼猴桃特優(yōu)新品種[1]。課題組[2]前期研究發(fā)現(xiàn)，紅陽(yáng)獼猴桃易出現(xiàn)熟(軟)腐病，并從腐爛的獼猴桃中分離出主要致病菌——葡萄座腔菌(Botryosphaeriaparva，B.parva)。Botryosphaeriaspp.是一類(lèi)球狀、雙囊壁的子囊菌，不僅危害果實(shí)，對(duì)樹(shù)木的致病性也是全球性的[3-5]。中國(guó)因葡萄座腔菌科引起的樹(shù)木潰瘍類(lèi)病害較多，會(huì)造成各種林木(楊樹(shù)、松樹(shù)、桉樹(shù)等)材質(zhì)下降和果樹(shù)(蘋(píng)果、梨、桃等)減產(chǎn)[6]。據(jù)研究[7]報(bào)道山核桃的干腐病致病菌為Botryosphaeriadothidea，簡(jiǎn)稱(chēng)B.dothidea，屬子囊菌門(mén)(Ascomycota)、葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)、葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)。李誠(chéng)等[8-9]從江西奉新縣獼猴桃果實(shí)中分離出6種致病菌，其中包括B.dothidea，但僅對(duì)葡萄座腔菌進(jìn)行了鑒定，并未對(duì)葡萄座腔菌的相關(guān)生物學(xué)特性進(jìn)行深入的研究。韓青梅等[10]將B.dothidea接種至蘋(píng)果果肉，研究了葡萄座腔菌侵染蘋(píng)果組織的細(xì)胞學(xué)特征，也未對(duì)致病菌的生物學(xué)特性進(jìn)行全面研究；課題組[2]前期研究顯示分離出的葡萄座腔菌不產(chǎn)孢子，而韓青梅等[10]研究表明該菌可通過(guò)孢子進(jìn)行繁殖，研究結(jié)果出現(xiàn)差異，因此，需進(jìn)一步對(duì)其探索。Slippers等[11-12]發(fā)現(xiàn)逆境可誘導(dǎo)Botryosphaeriaspp.產(chǎn)孢，可通過(guò)菌落劃傷、紫外線照射、營(yíng)養(yǎng)缺乏(碳源、氮源)等作用方式。Cunnington等[13]對(duì)維多利亞和新南威爾士園藝作物中Botryosphaeria物種多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該致病菌主要來(lái)自病變的葡萄，少量來(lái)自核果和仁果類(lèi)水果，其中最常見(jiàn)的致病菌是B.parva。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于B.parva的研究較少，主要集中于Botryosphaeriaceae的分子學(xué)鑒定及Botryosphaeria中其他亞種引起病害的防治等方面。為了更全面地呈現(xiàn)B.parva的相關(guān)生物學(xué)特性，課題組將對(duì)紅陽(yáng)獼猴桃中的B.parva生長(zhǎng)特性、是否產(chǎn)孢子、最適生長(zhǎng)環(huán)境、致死條件、致病性等進(jìn)行研究，為明確病害的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律提供試驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)為相關(guān)病害的防治提供科學(xué)有效的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

Botryosphaeriaparva：由本實(shí)驗(yàn)室貯藏的紅陽(yáng)獼猴桃分離而得，分離方法依據(jù)柯赫氏法則[14]，鑒定，純化，保存；

寄主范圍試驗(yàn)水果：購(gòu)自雅安市吉選超市；

無(wú)水乙醇、乳酸、苯酚、苯胺藍(lán)、甘油、氯化鈉、戊二醛、丙酮、葡萄糖、麥芽糖、淀粉、乳糖、果糖、蔗糖、牛肉膏、蛋白胨、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀、尿素：分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子顯微鏡：Olympus CX31RTSF型，日本Olympus公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DNP. 9162型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

手提式壓力蒸汽滅菌鍋：YXQ. SG41. 280型，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：BR4i型，美國(guó)Thermo公司；

恒溫振蕩培養(yǎng)箱：HZQ. X100型，金壇市杰瑞爾電器有限公司；

冰箱：海爾BCD-190TMPK型，海爾電器集團(tuán)；

潔凈工作臺(tái)：SW-CJ-1F型，蘇凈集團(tuán)安泰公司；

透射電顯微鏡：H-600型，日本Hitachi公司。

1.2 方法

1.2.1 致病菌菌絲結(jié)構(gòu)的觀察

(1) 光學(xué)顯微鏡菌絲結(jié)構(gòu)的觀察：用乳酸石炭酸棉藍(lán)作為染液染色后觀察B.parva菌落形態(tài)[15]。

(2) 透射電鏡菌絲超微結(jié)構(gòu)的觀察：將無(wú)菌水加入長(zhǎng)勢(shì)良好的B.parva斜面，菌絲與無(wú)菌水混合均勻制成菌懸液，于4 ℃、10 000 r/min離心15 min，棄去上清液，離心后菌絲切分成1 cm3的組織塊，用2.5%戊二醛固定2 h后，用0.1 mol/L 磷酸緩沖液漂洗15 min，重復(fù)3次。用100%丙酮室溫脫水15～20 min，重復(fù)3次。用純包埋液37 ℃處理2～3 h，45 ℃烘箱內(nèi)固化12 h，用超薄切片機(jī)切片，厚度為50～60 nm，3%醋酸鈾—枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察并拍照[16]。

1.2.2 致病菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 干重法測(cè)定生長(zhǎng)曲線。將等量的致病菌菌絲分別接種至50 mL已滅菌的馬鈴薯營(yíng)養(yǎng)液(PDB)中，于25 ℃，150 r/min培養(yǎng)24，36，48，60，72，84，96，108，120，144，168 h。分別搜集不同培養(yǎng)期的B.parva菌絲細(xì)胞，80 ℃烘至恒重后稱(chēng)重，各處理重復(fù)3次，取平均值。以致病菌培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌絲干重為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 致病菌分生孢子的研究

(1) 菌落劃傷：將活化后長(zhǎng)勢(shì)良好的B.parva菌株接種至馬鈴薯營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，25 ℃暗培養(yǎng)7 d后，用無(wú)菌刀片將菌落劃傷，再培養(yǎng)7～28 d。每7 d對(duì)菌絲進(jìn)行鏡檢觀察是否產(chǎn)孢，若產(chǎn)孢用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板測(cè)量其產(chǎn)孢數(shù)量。

(2) 紫外線照射：將B.parva菌株接種至PDA平板上，于25 ℃條件下分別紫外照射6，12，24 h后全黑暗培養(yǎng)7～28 d。

(3) 營(yíng)養(yǎng)缺乏：以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，測(cè)定蔗糖、麥芽糖、淀粉、乳糖、果糖、葡萄糖6種碳源對(duì)菌絲產(chǎn)孢量的影響，以不加碳源的查氏培養(yǎng)基為對(duì)照組；測(cè)定牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、尿素6種氮源對(duì)致病菌菌絲產(chǎn)孢量的影響，以不加氮源的查氏培養(yǎng)基為對(duì)照組，于25 ℃暗培養(yǎng)7～28 d。

(4) 致病菌孢子數(shù)的測(cè)定：用血細(xì)胞培養(yǎng)法計(jì)數(shù)，測(cè)定致病菌的產(chǎn)孢數(shù)量。

1.2.4 致病菌最適生長(zhǎng)條件 采用平板測(cè)定法[17]。將B.parva菌株接種于培養(yǎng)基中央，培養(yǎng)3～7 d后，用十字交叉法測(cè)定菌落直徑。選取可能影響菌株生長(zhǎng)的不同溫度、pH值及光照情況和不同碳、氮源進(jìn)行單因素試驗(yàn)。除碳、氮源所用培養(yǎng)基不同外，其余各組均采用PDA培養(yǎng)基；除溫度和光照2組外，其他各組處理均采用25 ℃暗培養(yǎng)。每處理重復(fù)3次，取平均值。

(1) 溫度的影響：將B.parva菌株接種于PDA中央，分別置于5，10，15，20，25，30，35，40 ℃暗培養(yǎng)，定期測(cè)定菌落直徑。

(2) pH的影響：將B.parva菌株接種于pH分別為4.0～10.0，以1為梯度，共7個(gè)pH的PDA中央，置于25 ℃暗培養(yǎng)，定期測(cè)定菌落直徑[18]。

(3) 光照的影響：將B.parva菌株接種于PDA中央，分別置于全光照、全黑暗、12 h光暗交替培養(yǎng)3種處理，試驗(yàn)用光源為普通熒光燈(60 W)，于25 ℃培養(yǎng)，定期測(cè)定菌落直徑。

(4) 碳源的影響：將B.parva菌株分別接種于不加蔗糖的查氏培養(yǎng)基(對(duì)照組)及分別添加蔗糖、麥芽糖、淀粉、乳糖、果糖、葡萄糖6種碳源的培養(yǎng)基，于25 ℃暗培養(yǎng)，定期測(cè)定菌落直徑。

(5) 氮源的影響：將B.parva菌株分別接種于不加硝酸鈉的查氏培養(yǎng)基(對(duì)照組)及分別添加牛肉膏、蛋白胨、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀、尿素6種氮源的培養(yǎng)基，于25 ℃暗培養(yǎng)，定期測(cè)定菌落直徑。

1.2.5 致病菌菌絲致死溫度的確定B.parva菌絲接種于PDB培養(yǎng)液，分別將錐形瓶于40，45，50，55 ℃的恒溫水浴鍋中加熱20 min，對(duì)照組不進(jìn)行水浴處理[19]。水浴處理后將錐形瓶置于振動(dòng)培養(yǎng)箱中，25 ℃恒溫黑暗振蕩(100 r/min)培養(yǎng)，3 d后觀察各組菌絲生長(zhǎng)狀況。再以菌絲能夠生長(zhǎng)的可耐受最高溫度為基礎(chǔ)，以每增加1 ℃為1個(gè)溫度梯度進(jìn)行處理，共設(shè)5個(gè)溫度梯度，在每個(gè)處理中又設(shè)置水浴時(shí)間為5，10，15，20 min，最終確定致病菌的致死溫度及其與處理時(shí)間的關(guān)系。

1.2.6 致病菌的致病性 將B.parva菌塊(5 mm)通過(guò)有傷和無(wú)傷分別接種至健康的愛(ài)媛柑、贛南橙、檸檬、火龍果、香蕉、新疆哈密瓜、梨、蘋(píng)果、蜜棗、葡萄10種水果，設(shè)置空白對(duì)照組。觀察B.parva在不同水果上的發(fā)病情況，分離回接確認(rèn)致病性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Origin 8.0制圖；采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件利用鄧肯式多重比較(Duncan’s multiple range test)對(duì)差異顯著性進(jìn)行分析，P<0.05為顯著水平，P<0.01為極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病菌菌絲結(jié)構(gòu)

由圖1可知，經(jīng)乳酸石炭酸棉藍(lán)染液染色后的B.parva菌絲，在光學(xué)顯微鏡下菌絲呈明暗2種狀態(tài)，菌絲相互纏繞。高倍鏡下，菌絲呈明顯分節(jié)生長(zhǎng)，菌絲內(nèi)含橫隔膜，其將菌絲分隔成多個(gè)細(xì)胞，同時(shí)，菌絲呈分枝狀態(tài)。由圖2可知，B.parva具有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞壁光滑、清晰可見(jiàn)，細(xì)胞膜和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，屬真核生物。

圖1 葡萄座腔菌菌絲圖Figure 1 Morphological characteristics of B. parva

圖2 葡萄座腔菌的透射電鏡圖Figure 2 Transmission electron microscope of B. parva (Bar=1 μm)

2.2 致病菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

由圖3可知，B.parva的生長(zhǎng)分為3個(gè)時(shí)期，分別為延滯期(0～36 h)、對(duì)數(shù)期(36～96 h)、穩(wěn)定期(96～168 h)。B.parva處于延滯期時(shí)，是把致病菌接種到新鮮培養(yǎng)基中，表現(xiàn)出細(xì)胞數(shù)目不增加，其在生長(zhǎng)曲線上表現(xiàn)的特點(diǎn)為菌絲生長(zhǎng)的速率常數(shù)為0；B.parva處于對(duì)數(shù)期時(shí)，細(xì)胞分裂周期短，其在生長(zhǎng)曲線上表現(xiàn)的特點(diǎn)為生長(zhǎng)速率常數(shù)R最大；B.parva處于穩(wěn)定期時(shí)，此時(shí)的細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有凈增加或凈減少，即正生長(zhǎng)和負(fù)生長(zhǎng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，特點(diǎn)為菌絲生長(zhǎng)的速率常數(shù)趨于0。

圖3 葡萄座腔菌的生長(zhǎng)曲線Figure 3 Growth curve of B. parva

2.3 不同條件誘導(dǎo)致病菌產(chǎn)孢

本試驗(yàn)通過(guò)菌落劃傷、紫外線照射、碳源、氮源這幾種方式誘導(dǎo)，從菌絲生長(zhǎng)第7天開(kāi)始連續(xù)觀察至第28天，發(fā)現(xiàn)菌絲均不產(chǎn)生分生孢子。經(jīng)以上誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果表明：B.parva與韓青梅等[10]研究的B.dothidea繁殖方式不相同，推測(cè)該種菌主要是通過(guò)菌絲進(jìn)行繁殖。

2.4 致病菌最適生長(zhǎng)條件的測(cè)定

2.4.1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 由表1可知，B.parva在溫度15～35 ℃時(shí)均能生長(zhǎng)，在溫度低于10 ℃和高于40 ℃時(shí)菌絲不能生長(zhǎng)。由試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，最適宜B.parva菌絲生長(zhǎng)溫度為30 ℃；在溫度15～30 ℃時(shí)，隨著環(huán)境溫度升高，菌落直徑不斷增大，說(shuō)明菌絲在此溫度范圍內(nèi)，生長(zhǎng)速率與溫度呈正相關(guān)；但當(dāng)溫度高于30 ℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速率呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，生長(zhǎng)速率與溫度呈負(fù)相關(guān)。綜上可知，B.parva屬中溫型微生物，所產(chǎn)生的酶在此溫度下活性最佳，在過(guò)低或過(guò)高溫度時(shí)，相關(guān)酶可能會(huì)失活或變性。

表1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響?

? 同列上標(biāo)字母相同表示在0.05水平上無(wú)顯著性差異。

2.4.2 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 由表2可知，B.parva在pH 4.0～10.0時(shí)均能較好生長(zhǎng)，在pH 4.0～6.0時(shí)，菌落直徑隨著pH值的升高逐漸增大，B.parva生長(zhǎng)速率不斷加快；當(dāng)pH 6.0時(shí)菌落直徑最大，菌絲生長(zhǎng)速率相對(duì)最高，可見(jiàn)pH 6.0 是菌絲生長(zhǎng)的最適pH值；當(dāng)pH 7.0～10.0時(shí)，菌落直徑差異不明顯，但均低于pH 6.0時(shí)的菌絲長(zhǎng)度，說(shuō)明高pH值不利于菌落生長(zhǎng)。綜上所述，B.parva較適于偏酸性環(huán)境中生長(zhǎng)。

2.4.3 碳源、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 由表3可知，致病菌在以上6種碳源上均能生長(zhǎng)，但在不同碳源上菌絲的生長(zhǎng)存在顯著差異。B.parva在以葡萄糖為碳源時(shí)生長(zhǎng)最快，在蔗糖、果糖、麥芽糖為碳源時(shí)生長(zhǎng)情況次之，以乳糖為碳源時(shí)生長(zhǎng)最慢，但都顯著高于無(wú)碳源對(duì)照組的菌絲生長(zhǎng)速度。綜上可知，碳源是致病菌正常生長(zhǎng)的重要條件，但致病菌對(duì)每種碳源的吸收利用能力存在一定的差異。這取決于細(xì)胞呼吸消耗的能量直接來(lái)源物質(zhì)，葡萄糖是呼吸作用中的直接供能物質(zhì)，因此，葡萄糖更利于致病菌的吸收利用，而其他的碳源要被病原菌利用還必須在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行分解轉(zhuǎn)化后才行，病原菌最佳碳源為葡萄糖。

表2 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響?

? 同列上標(biāo)字母相同表示在0.05水平上無(wú)顯著性差異。

病原菌在6種氮源上均能生長(zhǎng)，但不同氮源間存在顯著差異。B.parva在牛肉膏上菌絲生長(zhǎng)最好，其次為硝酸銨、蛋白胨、硝酸鉀、硫酸銨，在尿素上生長(zhǎng)最慢，生長(zhǎng)速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他各組，且菌落形態(tài)畸形。綜上可知，合適的氮源是病源菌正常生長(zhǎng)的重要條件，病原菌對(duì)氮源的吸收利用能力主要取決于氮源的存在形式。有機(jī)氮化合物最易被微生物吸收利用，尤其是氨基氮；其次是無(wú)機(jī)氮化合物，如銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和簡(jiǎn)單的有機(jī)氮化物(尿素)；最后是空氣中分子態(tài)氮。在上述6種氮源中，牛肉膏主要以氨基酸和多肽組成，較蛋白質(zhì)分子量小，更易于為病原菌提供氮源，更利于被吸收；尿素提供氮源的能力最差，推測(cè)可能由于尿素需先經(jīng)微生物分解才能被利用。

表3 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響?

? 同列上標(biāo)字母相同表示在0.05水平上無(wú)顯著性差異。

2.4.4 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 由表4可知，在不同的光照條件下，B.parva菌絲生長(zhǎng)速率無(wú)顯著差異，說(shuō)明菌絲對(duì)光不敏感。

表4 光照對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.5 病原菌菌絲致死溫度的測(cè)定

由表5可知，B.parva菌絲致死溫度為42 ℃處理10 min 或43 ℃處理5 min。先在40，45，50，55 ℃的恒溫水浴鍋中處理20 min，確定B.parva的最高生長(zhǎng)溫度為40 ℃，45 ℃及以上溫度B.parva均無(wú)法生長(zhǎng)；再以40 ℃基礎(chǔ)，每增加1 ℃為一個(gè)處理，共設(shè)5個(gè)溫度處理。在每個(gè)處理中又設(shè)置5，10，15，20 min 4種時(shí)間處理，最終確定B.parva在42 ℃處理10 min或43 ℃處理5 min不能生長(zhǎng)，即為其致死溫度。

表5 葡萄座腔菌菌絲致死溫度的測(cè)定?

? “+”表示有菌絲生長(zhǎng)，“-”表示無(wú)菌絲生長(zhǎng)。

2.6 病原菌的致病性

由表6、圖4和5可知，接種后第3天 10種水果均通過(guò)傷口被B.parva感染，香蕉還可通過(guò)無(wú)傷被感染，其他水果在無(wú)傷條件下均未出現(xiàn)發(fā)病癥狀。在供試的10種水果中，柑橘類(lèi)發(fā)病癥狀相似，均表現(xiàn)為接種部位果皮干枯、褐變且凹陷；火龍果接種部位出現(xiàn)干枯與凹陷；香蕉接種部位變黑，病斑呈圓形；哈密瓜病斑呈圓形，無(wú)明顯擴(kuò)散狀態(tài)；梨和蘋(píng)果接種部位出現(xiàn)淡褐色水漬狀斑紋；蜜棗接種部位表面凹陷，果肉呈水漬狀；葡萄接種部位明顯軟爛塌陷。將各寄主上引起病變的微生物，重新接種到PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)觀察其菌落形態(tài)后，確定引起各寄主病變的微生物其菌落形態(tài)與B.parva菌落形態(tài)一致，結(jié)果表明，B.parva對(duì)各寄主具有致病性。

表6 葡萄座腔菌的寄主范圍檢測(cè)?

? “+”表示感染，“-”表示未感染。

圖4 葡萄座腔菌致病性(空白組)Figure 4 Pathogenicity of B. parva (control)

圖5 葡萄座腔菌致病性(處理組)Figure 5 Pathogenicity of B. parva (treatments)

3 結(jié)論

研究顯示，葡萄座腔菌的菌絲呈分枝狀、內(nèi)含隔膜，具有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)；生長(zhǎng)曲線分為3個(gè)時(shí)期，延滯期(0～36 h)、對(duì)數(shù)期(36～96 h)、穩(wěn)定期(96～168 h)；經(jīng)多種方式誘導(dǎo)該病原菌不產(chǎn)分生孢子，與韓青梅等[10]研究相反，是對(duì)葡萄座腔菌生物學(xué)特性研究的補(bǔ)充；最適生長(zhǎng)條件為：生長(zhǎng)溫度30 ℃，pH 6，以葡萄糖為碳源，牛肉膏為氮源，對(duì)光照條件不敏感；菌絲致死條件為42 ℃處理10 min或43 ℃處理5 min；葡萄座腔菌均可通過(guò)傷口對(duì)10種供試水果感染而發(fā)病，表明該病原菌具有廣譜致病性，在貯藏發(fā)病的果實(shí)時(shí)，需避免交互式感染。但葡萄座腔菌在紅陽(yáng)果實(shí)上的發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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