桉葉精油氣相擴(kuò)散抑菌活性及抑菌成分研究

任小玲 - 岳淑麗 - 向 紅 劉薈雅 -

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642)

桉樹(shù)是桃金娘科(Myrtaceae)桉屬(Eucalyptus)植物的總稱(chēng)，原產(chǎn)于澳大利亞，在全世界上百個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有種植[1]。桉樹(shù)自1890年引入中國(guó)，目前在中國(guó)的種植面積已超過(guò)3.60×106hm2[2]。從桉樹(shù)葉中提取的桉葉精油具有廣譜抑菌、抗氧化、消炎、抗病毒及殺蟲(chóng)驅(qū)蚊等作用，其主要有效成分為酚類(lèi)、黃酮類(lèi)、皂甙、萜類(lèi)等[3-5]。桉葉精油因其廣譜抑菌性而廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)，但桉葉精油易揮發(fā)，難以長(zhǎng)時(shí)間發(fā)揮抑菌作用[6-8]。微膠囊技術(shù)可使桉葉精油微膠囊化，利用微膠囊壁材的控釋性，可實(shí)現(xiàn)桉葉精油長(zhǎng)效抑菌[9]。將精油微膠囊應(yīng)用到氣調(diào)保鮮中，在保鮮的同時(shí)還可抑制有害微生物的生長(zhǎng)，但微膠囊化后的桉葉精油只能以氣態(tài)分子形式揮發(fā)到空間中。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)桉葉精油抑菌方式的研究主要集中在液相擴(kuò)散和固相擴(kuò)散[3-5,10-13]，對(duì)氣相擴(kuò)散抑菌方式的研究尚不多見(jiàn)。在桉葉精油添加量相同的情況下，氣相、液相和固相擴(kuò)散3種抑菌方式何種方式抑菌效果更好，尚無(wú)研究。

本試驗(yàn)擬以抑菌圈直徑和最低抑菌濃度(MIC)為指標(biāo)，將氣相擴(kuò)散抑菌效果與液相和固相進(jìn)行對(duì)比，探究桉葉精油的氣相擴(kuò)散抑菌活性，并結(jié)合SPME/GC-MS測(cè)試結(jié)果，分析氣態(tài)桉葉精油主要成分及主要抑菌成分，以期為桉葉精油在氣調(diào)保鮮中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

桉葉精油：廣州市帕塞佳香精香料有限公司；

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；

牛肉浸膏、蛋白胨：生化試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)：SW-CJ-1F型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

生化培養(yǎng)箱：LRH-250-Ⅱ型，廣東省醫(yī)療器械廠；

手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋：SYQ-DSX-280B型，上海申安醫(yī)療器械廠；

搖床培養(yǎng)箱：ZWY-100H型，廣州市綠向生物科技有限公司；

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：GC-MS 7890B-5977A型，安捷倫科技有限公司；

手動(dòng)SPME進(jìn)樣器：57324-U型，萃取纖維頭為100 μL PDMS，美國(guó)Supelco公司。

1.2 方法

為對(duì)比桉葉精油在氣相擴(kuò)散(濾紙片法、平板法)方式下的抑菌效果(通過(guò)抑菌圈和MIC進(jìn)行判定)，本試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行液相擴(kuò)散(平板打孔法、試管二倍稀釋法)和固相擴(kuò)散(濾紙片法、平板稀釋法)抑菌試驗(yàn)。

1.2.1 菌懸液的制備 用固體斜面培養(yǎng)基對(duì)供試菌進(jìn)行活化，細(xì)菌采用平板計(jì)數(shù)法，霉菌采用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法測(cè)菌體個(gè)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，制成菌體濃度為106～107CFU/mL的均勻菌懸液，備用[14]。

1.2.2 含菌平板的制備 無(wú)菌條件下，向培養(yǎng)皿倒入20 mL冷卻至45 ℃左右的培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基自然冷卻凝固后，滴入上述菌懸液100 μL，均勻涂布，靜置待菌液被吸收即成含菌平板，備用。

1.2.3 精油氣相擴(kuò)散抑菌試驗(yàn)

(1) 抑菌圈的測(cè)定：采用濾紙片法[15]。無(wú)菌條件下，直徑6 mm的無(wú)菌濾紙片貼于含菌平板的皿蓋內(nèi)中央，每皿蓋中央放1片濾紙片，并使之展開(kāi)，向?yàn)V紙片滴加桉葉精油，桉葉精油添加量依次為5，10，25 μL，以添加無(wú)菌水的濾紙片為空白對(duì)照，培養(yǎng)皿用保鮮膜密封。細(xì)菌于37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)20 h，霉菌于28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)4～5 d。培養(yǎng)結(jié)束，用十字交叉法測(cè)量各抑菌圈直徑，結(jié)果取平均值。每個(gè)菌種重復(fù)試驗(yàn)9次[16]。

(2) 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定：采用平板法[17]。氣相抑菌試驗(yàn)中精油的濃度表示為培養(yǎng)皿內(nèi)單位體積空氣中的精油質(zhì)量，即mg/L(空氣)[18]。無(wú)菌條件下，向每個(gè)培養(yǎng)皿加入15 mL冷卻至45 ℃左右的培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基自然冷卻凝固后滴入菌懸液100 μL，涂布均勻，待菌液被吸收后倒置放置。用移液槍吸取一定體積的桉葉精油至含菌平板的皿蓋內(nèi)中央，使細(xì)菌培養(yǎng)皿內(nèi)空氣中桉葉精油濃度分別達(dá)到0.180 0 ，0.090 00，0.045 00，0.022 50，0.011 25 mg/mL(空氣)，霉菌分別為0.720，0.360，0.180，0.090，0.045 mg/mL(空氣)(9 cm培養(yǎng)皿去除培養(yǎng)基后的空間體積約為100 mL)，以不添加桉葉精油的培養(yǎng)皿為空白對(duì)照。培養(yǎng)皿用保鮮膜密封，培養(yǎng)時(shí)間和溫度同上。以不生長(zhǎng)菌的樣品的最低濃度為精油對(duì)該菌的氣相MIC。每個(gè)菌種重復(fù)試驗(yàn)9次。

1.2.4 精油液相擴(kuò)散抑菌試驗(yàn)

(1) 抑菌圈的測(cè)定：采用平板打孔法[19]。無(wú)菌條件下，直徑為9 mm的無(wú)菌槍頭在含菌平板中央打1個(gè)孔，無(wú)菌鑷子剔去孔內(nèi)培養(yǎng)基，用無(wú)菌移液槍吸取1滴上述45 ℃左右的培養(yǎng)基封底。向孔內(nèi)滴加桉葉精油，桉葉精油添加量依次為5，10，25 μL，以添加無(wú)菌水為空白對(duì)照，培養(yǎng)皿用保鮮膜密封。培養(yǎng)溫度和時(shí)間同1.2.3，測(cè)量抑菌圈大小。

(2) MIC的測(cè)定：取無(wú)菌試管9支，編號(hào)。第1～6號(hào)管采用試管二倍稀釋法[20]，依次配成含桉葉精油濃度為36.00，18.00，9.00，4.50，2.25，1.13 mg/mL液體培養(yǎng)基的系列濃度。無(wú)菌環(huán)境下向1～6號(hào)管中分別添加100 μL菌懸液，第7號(hào)管添加液體培養(yǎng)基和菌懸液，為陽(yáng)性對(duì)照，第8號(hào)管僅添加液體培養(yǎng)基，第9號(hào)管僅添加精油。試管用硅膠塞塞緊，置于搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度和時(shí)間同1.2.3。以肉眼可見(jiàn)澄清透明的試管中精油的最低濃度為對(duì)應(yīng)菌種的MIC。

1.2.5 精油固相擴(kuò)散抑菌試驗(yàn)

(1) 抑菌圈的測(cè)定：無(wú)菌條件下，取1片直徑6 mm的濾紙片貼于含菌平板瓊脂表面中央，并使之展開(kāi)，向?yàn)V紙片上滴加桉葉精油，滴加在濾紙片上的精油量依次為5，10，25 μL。以添加無(wú)菌水的濾紙片為空白對(duì)照，培養(yǎng)皿用保鮮膜密封。培養(yǎng)溫度和時(shí)間同1.2.3，測(cè)量抑菌圈大小[18]。

(2) MIC的測(cè)定：采用平板稀釋法[21]。桉葉精油以丙二醇為稀釋劑，用二倍稀釋法配置成不同濃度的溶液。準(zhǔn)確量取20 mL冷卻至45 ℃左右的培養(yǎng)基，加至含1 mL桉葉精油溶液的無(wú)菌平皿中，搖勻。待培養(yǎng)基凝固后滴入菌懸液100 μL，涂布均勻。精油濃度為36.00，18.00，9.00，4.50，2.25，1.13 mg/mL 培養(yǎng)基。培養(yǎng)時(shí)間和溫度同1.2.3。以不生長(zhǎng)菌的培養(yǎng)皿所對(duì)應(yīng)的最低濃度為精油對(duì)該菌的固相MIC。

1.2.6 桉葉精油成分分析 采用氣相色譜—質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)[17]。

1.2.7 氣相桉葉精油成分分析

(1) 樣品前處理：取樣品1 g，置于50 mL固相微萃取儀頂空采樣瓶中，插入PDMS-100 μL纖維頭在常溫下萃取桉葉精油揮發(fā)物，快速抽出萃取頭并立即插入氣象色譜儀進(jìn)樣口(溫度250 ℃)中，熱解析4 min后進(jìn)樣[22]。

(2) 氣相色譜和質(zhì)譜條件：參照文獻(xiàn)[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌效力測(cè)定結(jié)果

通過(guò)測(cè)定桉葉精油對(duì)供試菌抑菌圈的大小初步確定桉葉精油氣相擴(kuò)散的抑菌效力，結(jié)果見(jiàn)表1。抑菌圈試驗(yàn)的判定標(biāo)準(zhǔn)：>20 mm：極度敏感，15～20 mm：高度敏感，10～15 mm：中度敏感，7～10 mm：低度敏感，無(wú)抑菌圈者為不敏感[23-24]。

表1桉葉精油對(duì)供試菌的抑菌直徑

Table 1 Inhibition zone diameters of tested microorganisms byEucalyptusessentialoil (n=9)mm

由表1可知，桉葉精油添加量為25 μL時(shí)，除對(duì)黑曲霉的固相抑菌圈直徑為18.17 mm(高度敏感)外，各抑菌方式下的抑菌圈直徑均低于20 mm(極度敏感范圍)。在10 μL時(shí)，液相擴(kuò)散抑菌圈直徑比氣相和固相略大，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑在18～22 mm范圍內(nèi)，而對(duì)黑曲霉菌的抑菌圈直徑為8～12 mm。在5 μL時(shí)，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)為中高度敏感，黑曲霉表現(xiàn)為中低度敏感。

總體來(lái)看，桉葉精油在氣相、液相和固相擴(kuò)散抑菌方式下對(duì)供試菌均具有明顯抑菌效力，且與劑量正相關(guān)，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用均優(yōu)于黑曲霉，與岳淑麗等[17]的研究結(jié)果一致。氣相擴(kuò)散時(shí)桉葉精油的抑菌效力略低于液相，與固相擴(kuò)散抑菌效力未有太大差異。固相擴(kuò)散抑菌圈小是因?yàn)樘砑釉跒V紙片上的桉葉精油易揮發(fā)，作用濃度小，使抑菌效力減弱[25]。氣相擴(kuò)散抑菌圈小，一方面因?yàn)殍袢~精油擴(kuò)散到培養(yǎng)皿空間中，無(wú)法形成高濃度的抑菌點(diǎn)，另一方面桉葉精油中某些抑菌成分揮發(fā)性較弱或不揮發(fā)，氣相桉葉精油中這部分抑菌成分含量較低，從而無(wú)法發(fā)揮抑菌作用[25]。

2.2 MIC值測(cè)定結(jié)果

在3種抑菌方式下測(cè)定桉葉精油對(duì)供試菌的MIC值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了在3種抑菌方式下，桉葉精油對(duì)黑曲霉的抑制效果略差。桉葉精油氣相擴(kuò)散對(duì)供試菌的MIC值(0.045～0.36 mg/mL)顯著低于液相的(4.5～18 mg/mL)和固相的(4.5～18 mg/mL)，說(shuō)明氣相擴(kuò)散時(shí)桉葉精油抑菌效果更好。桉葉精油不直接添加到培養(yǎng)基中，其揮發(fā)成分對(duì)供試菌仍具有較強(qiáng)的抑菌活性，這是因?yàn)榫蛽]發(fā)成分中某些單萜物質(zhì)具有較強(qiáng)的滲透性，更易被細(xì)胞吸收，破壞微生物生長(zhǎng)，因此較低劑量的桉葉精油即可抑制常見(jiàn)腐敗菌[19]，說(shuō)明微膠囊形式可應(yīng)用到氣調(diào)保鮮中。

表2 桉葉精油對(duì)供試菌的最低抑菌濃度

2.3 桉葉精油成分分析結(jié)果

采用氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)桉葉精油成分，其總離子流譜圖見(jiàn)圖1。采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定按葉精油揮發(fā)性成分，其總離子流譜圖見(jiàn)圖2。

圖1 桉葉精油的總離子流圖Figure 1 Total ion chromatogram of chemical components of Eucalyptus essential oil

圖2 氣相桉葉精油的總離子流圖

Figure 2 Total ion chromatogram of chemical components of vapor-phaseEucalyptusessentialoil

圖2中，由于桉葉精油揮發(fā)性成分中多種物質(zhì)的離子出峰時(shí)間很接近，使得離子流圖看起來(lái)出現(xiàn)了連峰。

利用計(jì)算機(jī)對(duì)圖1和圖2分離出的各組分提取質(zhì)譜圖，用NIST14標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行檢索，根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行核對(duì)，參考標(biāo)準(zhǔn)圖譜和相關(guān)文獻(xiàn)[17,26-28]確定各組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)百分含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，桉葉精油共檢測(cè)出66種物質(zhì)，鑒定出其中的36個(gè)化合物，占精油總量的96.576%。含量超過(guò)1%的化學(xué)成分共有12種，按含量高低分別為α-蒎烯、1,4-桉葉素、右旋檸檬烯、o-傘花烴、莰烯、異松油烯、1,8-桉葉素、3-蒈烯、γ-松油烯、α-水芹烯、月桂烯、3-對(duì)薄荷烯。桉葉精油中，萜烯類(lèi)化合物14種，占58.707%；烷烴類(lèi)化合物7種，占1.893%；醇類(lèi)化合物13種，占25.807%；苯類(lèi)化合物1種，占9.516%；酮類(lèi)化合物1種，占0.148%；醚類(lèi)化合物1種，占0.504%。

氣相桉葉精油共檢測(cè)出32種物質(zhì)，鑒定出其中的27個(gè)化合物，占?xì)庀喑煞挚偭康?9.492%。含量超過(guò)1%的化學(xué)成分共有11種，按含量高低分別為α-蒎烯、右旋檸檬烯、波斯菊萜、右旋莰烯、1,4-桉葉素、3-蒈烯、異松油烯、(-)-反式蒈烷、月桂烯、蒈烷。氣相桉葉精油中，萜烯類(lèi)化合物14種，占82.042%；烷烴類(lèi)5種，占5.448%；醇類(lèi)化合物8種，占11.961%；苯類(lèi)化合物1種，占0.041%。

表3 桉葉精油及氣相桉葉精油的化學(xué)成分及相對(duì)含量

由表3可知，物態(tài)的變化并未對(duì)桉葉精油的主要成分造成明顯影響，桉葉精油與氣相桉葉精油均以萜烯類(lèi)和醇類(lèi)物質(zhì)為主[28-29]。氣相桉葉精油中萜烯類(lèi)化合物的相對(duì)含量升高了23.335%，烷烴類(lèi)化合物的相對(duì)含量升高了3.555%，醇類(lèi)化合物的相對(duì)含量減少了13.846%，苯類(lèi)化合物的相對(duì)含量減少了9.475%，未檢出酮類(lèi)和醚類(lèi)化合物， 結(jié)合2.1的抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果可知這部分減少或消失的物質(zhì)是氣相抑菌效力稍差的原因[30-31]。據(jù)報(bào)道，小分子的萜烯類(lèi)物質(zhì)、酚類(lèi)物質(zhì)和醛酮類(lèi)物質(zhì)是精油的主要抑菌有效成分，醇類(lèi)、醚類(lèi)、苯類(lèi)物質(zhì)也具有一定的抑菌活性[32-34]。本試驗(yàn)測(cè)得的桉葉精油及氣相桉葉精油中均含有萜烯類(lèi)、醇類(lèi)、苯類(lèi)等物質(zhì)，因此桉葉精油及氣相桉葉精油均具有一定的抑菌活性。

結(jié)合2.2的結(jié)果可知，桉葉精油的抑菌活性與成分及其含量有關(guān)[20,28]。氣相桉葉精油中減少的醇類(lèi)物質(zhì)主要為1,8-桉葉素和1,4-桉葉素，而抑菌活性卻有所提高，與Tyagi A K等[19]的研究結(jié)果一致，可見(jiàn)萜烯類(lèi)化合物的成分及其含量是影響桉葉精油抑菌活性的主要因素[17,20]。據(jù)報(bào)道[30,35-38]，α-蒎烯、莰烯、右旋檸檬烯、1,8-桉葉素、3-蒈烯、異松油烯和月桂烯等物質(zhì)具有一定程度的抑菌活性，說(shuō)明氣相桉葉精油的抑菌活性與α-蒎烯、右旋檸檬烯、3-蒈烯、異松油烯和月桂烯等單萜物質(zhì)有關(guān)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)的結(jié)果表明氣相桉葉精油具有明顯抑菌活性，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑制作用較好，對(duì)黑曲霉抑制作用稍差。氣相桉葉精油中減少或消失的醇類(lèi)、苯類(lèi)、酮類(lèi)和醚類(lèi)等不揮發(fā)或揮發(fā)性稍差的物質(zhì)，是導(dǎo)致抑菌效力稍差的主要原因[10]。氣相桉葉精油對(duì)供試菌的MIC值(0.045～0.36 mg/mL)顯著低于液相的(4.5～18.0 mg/mL)和固相的(4.5～18.0 mg/mL)，說(shuō)明桉葉精油不直接添加到培養(yǎng)基中，其揮發(fā)成分對(duì)供試菌也有較強(qiáng)的抑制作用。桉葉精油物態(tài)的變化并未對(duì)其主要成分造成明顯的影響，氣相桉葉精油仍以萜烯類(lèi)和醇類(lèi)物質(zhì)為主。氣相桉葉精油的抑菌活性與α-蒎烯、右旋檸檬烯、3-蒈烯、異松油烯和月桂烯等單萜物質(zhì)有關(guān)，萜烯類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量的升高導(dǎo)致抑菌活性變強(qiáng)，單萜物質(zhì)在氣相狀態(tài)下更易被細(xì)胞吸收，從而更有效地發(fā)揮抑菌作用[15]，說(shuō)明桉葉精油的抑菌活性還與抑菌成分的物態(tài)形式有關(guān)，具體作用機(jī)制有待更深入的研究?？傊?，氣相桉葉精油可以在空間中發(fā)揮抑菌作用，這為桉葉精油微膠囊應(yīng)用到氣調(diào)保鮮中提供了理論依據(jù)。

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