不同葡萄品種對(duì)灰霉病菌脅迫的響應(yīng)

姜彩鴿，王國(guó)珍，張 怡，邵鵬梅

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，銀川 750002；2.銀川市西夏區(qū)鎮(zhèn)北堡鎮(zhèn)人民政府農(nóng)技服務(wù)中心，銀川 750021)

不同葡萄品種對(duì)灰霉病菌脅迫的響應(yīng)

姜彩鴿1，王國(guó)珍1，張 怡1，邵鵬梅2

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，銀川 750002；2.銀川市西夏區(qū)鎮(zhèn)北堡鎮(zhèn)人民政府農(nóng)技服務(wù)中心，銀川 750021)

為了解賀蘭山東麓不同主栽葡萄品種對(duì)灰霉病的感病程度，依據(jù)不同品種抗性不同的分布特點(diǎn)制定相應(yīng)的防治措施，提高防治效果。對(duì)各葡萄品種的內(nèi)含物-花青素、酚類(lèi)物、糖分、總抗壞血酸(或維生素C)及維生素E分別采用錦葵色素標(biāo)準(zhǔn)品法、Arnow試劑法、直接滴定法、熒光法(或2,6-二氯靛酚滴定法)、高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：發(fā)病果實(shí)的花青素等物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與健康果實(shí)存在明顯差異，證明葡萄灰霉病的發(fā)生和花青素等物質(zhì)有密切關(guān)系，質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高抗病性較強(qiáng)，反之則弱；依不同葡萄品種被灰霉病菌侵染后各內(nèi)含物的降幅進(jìn)行比較判斷，其抗病性強(qiáng)弱依次為‘赤霞珠’>‘梅鹿輒’>‘西拉’>‘雷司令’>‘霞多麗’>‘白詩(shī)楠’。由此可見(jiàn)，室內(nèi)檢測(cè)結(jié)果與田間發(fā)病表現(xiàn)一致，田間防治應(yīng)以白色品種為重點(diǎn)。

葡萄；灰霉病菌；內(nèi)含物監(jiān)測(cè)；抗病性

葡萄灰霉病是制約葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大障礙，是常見(jiàn)、也是危害最大的病害之一[1]，更是保護(hù)地葡萄生產(chǎn)和葡萄貯藏期最為重要的病害種類(lèi)之一，在中國(guó)南方地區(qū)和北方溫室葡萄生產(chǎn)中發(fā)生尤為嚴(yán)重[2]，每年該病造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。葡萄灰霉病帶來(lái)的危害是雙重性的：一方面，由于果穗的減少而導(dǎo)致產(chǎn)量的降低。有些感病品種如遇持續(xù)高濕陰雨，花穗會(huì)嚴(yán)重受害，病穗率可達(dá)70%以上[3-4]。葡萄灰霉病在貯藏過(guò)程中發(fā)病是毀滅性的，每年因灰霉病造成的葡萄產(chǎn)后損失在20%～30%左右，最高可達(dá)50%[5-6]。另一方面，它還給葡萄酒帶來(lái)不良味感，同時(shí)使葡萄酒不耐陳釀，降低葡萄酒的質(zhì)量[7]。隨著葡萄種植面積不斷擴(kuò)大，葡萄灰霉病也逐漸成為寧夏葡萄生產(chǎn)中的主要病害之一，造成成熟期果實(shí)腐爛，病情一旦發(fā)生即發(fā)展迅速且難以控制[8-10]，已影響到該地區(qū)葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)。

目前，對(duì)于葡萄灰霉病的防治仍以化學(xué)防治為主[11-14]，引發(fā)環(huán)境污染、農(nóng)藥抗藥性、破壞生態(tài)平衡、農(nóng)藥殘留等嚴(yán)重問(wèn)題，對(duì)人們的健康極為不利。為此，本研究通過(guò)分析灰霉病與葡萄中花青素等物質(zhì)的相關(guān)性，了解賀蘭山東麓不同的主栽葡萄品種對(duì)灰霉病的感病程度，以期為品種的合理布局制定相應(yīng)的防治措施，為提高葡萄優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)及可持續(xù)發(fā)展等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

在葡萄果實(shí)膨大期(6月28日)、轉(zhuǎn)色期(8月21日)、成熟期(9月4日)于寧夏玉泉營(yíng)農(nóng)場(chǎng)采集‘赤霞珠’‘梅鹿輒’‘西拉’‘霞多麗’‘雷司令’‘白詩(shī)楠’的果實(shí)。每個(gè)品種采集2份各1 kg，1份健康果穗作為對(duì)照，另1份在室內(nèi)進(jìn)行灰霉病菌接種。

1.2 接種方法

樣品經(jīng)自來(lái)水沖洗3遍，蒸餾水沖洗3遍，φ=75%的酒精浸泡消毒1 min，無(wú)菌水沖洗3遍后，用消毒接種針在葡萄果實(shí)上刺小傷口，將果穗浸入孢子數(shù)密度為106mL-1菌懸液中1 h，使分生孢子充分發(fā)生作用，再分別轉(zhuǎn)入干燥器上層，干燥器底層注入 1 000 mL稀釋的菌懸液(飽和水)以保濕，上下分開(kāi)以防果實(shí)腐爛。放入21 ℃人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)1 d后進(jìn)行檢測(cè)。孢子懸浮液的準(zhǔn)備方法參照文獻(xiàn)[15]，即配制菌懸液時(shí)可放入φ=0.05%的Tween-20，再加入質(zhì)量濃度為0.005 g/mL 的葡萄糖和0.008 g/mL的磷酸二氫鉀以刺激分生孢子引起侵染。

1.3 各內(nèi)含物質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測(cè)方法

依采集品種內(nèi)含物的不同所需測(cè)定的指標(biāo)也不同，深色品種進(jìn)行花青素、酚類(lèi)物、糖分、總抗壞血酸及維生素E檢測(cè)(維生素C測(cè)定法不適用于深色樣品，因此深色品種檢測(cè)總抗壞血酸)，白色品種則進(jìn)行酚類(lèi)物、糖分及維生素C、E檢測(cè)(白色品種的花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)很低，不予檢測(cè))。

1.3.1 花青素測(cè)定 花青素提取液的制備：先對(duì)葡萄果實(shí)進(jìn)行預(yù)處理，用自來(lái)水和蒸餾水洗凈，晾干表面水分后，粉碎、勻漿冷凍，備用。參照Chiriboga和Francis的試驗(yàn)方法并作改進(jìn)提取花青素，取樣品10 g，提取溶劑為含φ=2%鹽酸的無(wú)水甲醇，料液比1∶10(質(zhì)量與體積之比)，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間1 h。提取次數(shù)為2次，葡萄提取液在8 000 r/min離心10 min后，收集上清液，備用以檢測(cè)花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

參照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行配比：精密稱(chēng)取定量錦葵色素標(biāo)準(zhǔn)品溶液至10 mL容量瓶中，用φ=2%的鹽酸甲醇溶解，并定容到刻度，即得到0.1 mg/mL的錦葵色素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以φ=2%的鹽酸甲醇溶液為空白，通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的全波長(zhǎng)掃描，確定花青素的最大吸收波長(zhǎng)為546 nm。

配制0.1 mg/mL的錦葵色素標(biāo)準(zhǔn)品母液(表1)。分別精密移取上述溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL到10 mL容量瓶中，用φ=2%的鹽酸甲醇定容至刻度，即得到錦葵色素標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度分別為 0、4、8、12、16、20、24 μg/mL。用φ=2%的鹽酸甲醇作空白，在546 nm處測(cè)定其吸光度值，以3次平均值為數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸處理得回歸方程，并作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

對(duì)果實(shí)中的花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定，平行測(cè)定3次，取平均值。從樣品提取液V2中精密稱(chēng)定V3到容量瓶V1中，φ=2%的鹽酸甲醇溶解并定容到刻度。φ=2%的鹽酸甲醇作空白。在546 nm 處測(cè)定其吸光度值?；ㄇ嗨刭|(zhì)量分?jǐn)?shù)按下列公式計(jì)算：

花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)=(A/K)×V1×(V2/V3)×(10-6/W)×100%

式中，A為最大吸收峰位置處的吸光度；K為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；V1為供試液體積(mL)；V2為提取液總體積(mL)；V3為吸取V2中用于檢測(cè)的提取液體積(mL)；W為樣品的初始質(zhì)量(g)。

表1 花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作中所用到的溶液配比Table 1 Solution ratio used in the production of anthocyanin standard curve

1.3.2 酚類(lèi)物質(zhì) 采用Arnow試劑法進(jìn)行測(cè)定[17]。取18只1.8 cm×18 cm的試管，按表2加液，每質(zhì)量濃度重復(fù)3次。當(dāng)NaOH液加入不久，管中溶液變?yōu)槌燃t色。在721分光光度計(jì)515 nm處測(cè)OD值，以3次平均值作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

采集樣品果實(shí)2 g進(jìn)行預(yù)處理，研磨待測(cè)定。稱(chēng)取樣品0.5 g，加10 mL無(wú)水乙醇進(jìn)行勻漿，洗入大試管中(用少許無(wú)水乙醇洗勻漿器，洗液并入試管中)，在90 ℃恒溫水浴中提取(試管加蓋)，10 min后取出，冷卻。再在3 000 r/min離心10 min。取上清液倒入50 mL容量瓶中，沉淀再重復(fù)提取2次。合并上清液，用無(wú)水乙醇定容至50 mL即為樣品液。吸取樣品液1 mL于試管中，其余步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定。以1 mLφ=95%的乙醇作對(duì)照，樣品與對(duì)照各重復(fù)3次，測(cè)定樣品中總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)。以3次重復(fù)的平均值查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求樣品中總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

每克鮮組織中總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)=查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得值(μg) / 樣品質(zhì)量(0.5 g)

1.3.3 可溶性總糖 總糖測(cè)定方法均是先利用酸水解法使沒(méi)有還原性的雙糖和多糖徹底水解成有還原性的單糖，利用還原糖的測(cè)定方法來(lái)測(cè)總糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)?？扇苄钥偺琴|(zhì)量分?jǐn)?shù)按照GB/T 5009.7-2008[18]直接滴定法進(jìn)行測(cè)定。

試樣處理：稱(chēng)取粉碎后的樣品果實(shí)2.5～5 g，置250 mL容量瓶中，加50 mL水，慢慢加入5 mL 乙酸鋅溶液及5 mL亞鐵氰化鉀溶液，加水至刻度，混勻，靜置30 min，用干燥濾紙過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，備用。

標(biāo)定堿性酒石酸銅溶液：吸取5.0 mL堿性酒石酸銅甲液及5.0 mL堿性酒石酸銅乙液，置于150 mL錐形瓶中，加水10 mL，加入玻璃珠2粒，從滴定管滴加約9 mL葡萄糖或其他還原糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，控制在2 min內(nèi)加熱至沸，趁熱以每2 s加1滴的速度繼續(xù)滴加葡萄糖或其他還原糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，直至溶液藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄消耗葡萄糖或其他還原糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的總體積，同時(shí)平行操作3份，取其平均值，計(jì)算每10 mL(甲、乙液各5 mL)堿性酒石酸銅溶液相當(dāng)于葡萄糖的質(zhì)量或其他還原糖的質(zhì)量(mg)[也可以按上述方法標(biāo)定4～20 mL堿性酒石酸銅溶液(甲、乙液各半)來(lái)適應(yīng)試樣中還原糖的質(zhì)量濃度變化]。

表2 Arnow法標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定Table 2 Determination of Arnow standard curve

試樣溶液預(yù)測(cè)：吸取5.0 mL堿性酒石酸銅甲液及5.0 mL堿性酒石酸銅乙液，置于150 mL錐形瓶中，加水10 mL，加入玻璃珠2粒，控制在2 min內(nèi)加熱至沸，保持沸騰，以先快后慢的速度從滴定管中滴加試樣溶液，并保持溶液沸騰狀態(tài)，待溶液顏色變淺時(shí)，以每2 s加1滴的速度滴定，直至溶液藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄樣液消耗體積。當(dāng)樣液中還原糖質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，應(yīng)適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行正式測(cè)定，使每次滴定消耗樣液的體積控制在與標(biāo)定堿性酒石酸銅溶液時(shí)所消耗的還原糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積相近，約10 mL左右，結(jié)果按下式(1)計(jì)算。當(dāng)質(zhì)量濃度過(guò)低時(shí)則采取直接加入10 mL樣品液，免去加水10 mL，再用還原糖標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點(diǎn)，記錄消耗的體積與標(biāo)定堿性酒石酸銅溶液時(shí)消耗的還原糖標(biāo)準(zhǔn)溶液體積之差相當(dāng)于10 mL樣液中所含還原糖的量，結(jié)果按下式(2)計(jì)算。

試樣溶液測(cè)定：吸取5.0 mL堿性酒石酸銅甲液及5.0 mL堿性酒石酸銅乙液，置于150 mL錐形瓶中，加水10 mL，加入玻璃珠2粒，從滴定管滴加比預(yù)測(cè)體積少1 mL的試樣溶液至錐形瓶中，在2 min內(nèi)加熱至沸，保持沸騰繼續(xù)以每2 s加1滴的速度滴定，直至藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄樣液消耗體積，同法平行操作3份，得出平均消耗體積。

試樣中還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(以某種還原糖計(jì))按式(1)進(jìn)行計(jì)算：

X=m1/ (m×V/250×1 000) ×100

(1)

式中：X為試樣中還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(以某種還原糖計(jì))，m1為堿性酒石酸銅溶液(甲、乙液各半)相當(dāng)于某種還原糖的質(zhì)量，m為試樣質(zhì)量，V為測(cè)定時(shí)平均消耗試樣溶液體積。

當(dāng)質(zhì)量濃度過(guò)低時(shí)試樣中還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(以某種還原糖計(jì))按式(2)進(jìn)行計(jì)算：

X=m2/(m×10/250×1 000) ×100

(2)

式中：X為試樣中還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(以某種還原糖計(jì))，m2為標(biāo)定時(shí)體積與加入樣品后消耗的還原糖標(biāo)準(zhǔn)溶液體積之差相當(dāng)于某種還原糖的質(zhì)量，m為試樣質(zhì)量。

還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥10 g/100 g時(shí)計(jì)算結(jié)果保留3位有效數(shù)字；還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)<10 g/100 g時(shí)，計(jì)算結(jié)果保留2位有效數(shù)字。

1.3.4 總抗壞血酸 按照GB/T 5009.86-2003中熒光法[19]測(cè)定。

試劑：(1)抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/mL)(臨用前配制)。準(zhǔn)確稱(chēng)取50 mg抗壞血酸，用偏磷酸-乙酸溶液溶于50 mL容量瓶中，并稀釋至刻度。(2)抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)使用液(100 μg/mL)。取10 mL抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)液，用偏磷酸-乙酸溶液稀釋至100 mL，定容前試pH，如其pH>2.2時(shí)，則應(yīng)用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀釋。(3)0.4 mg/mL的百里酚藍(lán)指示劑溶液。稱(chēng)取0.1 g百里酚藍(lán)，加0.02 mol/L氫氧化鈉溶液，在玻璃研缽中研磨至溶解，氫氧化鈉的用量約為10.75 mL，磨溶后用水稀釋至250 mL。變色范圍：pH=1.2，紅色；pH=2.8，黃色；pH>4，藍(lán)色。

試樣的制備：稱(chēng)取100 g鮮樣，加100 mL偏磷酸-乙酸溶液，倒入搗碎機(jī)內(nèi)打成勻漿，用百里酚藍(lán)指示劑調(diào)試勻漿酸堿度。如呈紅色，即可用偏磷酸-乙酸溶液稀釋?zhuān)舫庶S色或藍(lán)色，則用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀釋?zhuān)蛊鋚H為1.2。勻漿的取量需根據(jù)試樣中抗壞血酸的質(zhì)量濃度而定。當(dāng)試樣液質(zhì)量濃度為40～100 μg/mL時(shí)，一般取20 g勻漿，用偏磷酸-乙酸溶液稀釋至100 mL，過(guò)濾，濾液備用。

測(cè)定：(1)氧化處理。分別取試樣濾液及標(biāo)準(zhǔn)使用液各100 mL于200 mL帶蓋三角瓶中，加2 g 活化過(guò)的活性炭，用力振搖1 min，過(guò)濾，棄去最初數(shù)毫升濾液，分別收集其余全部濾液，即試樣氧化液和標(biāo)準(zhǔn)氧化液，待測(cè)定。(2)各取10 mL標(biāo)準(zhǔn)氧化液于2個(gè)100 mL容量瓶中，分別標(biāo)明“標(biāo)準(zhǔn)”及“標(biāo)準(zhǔn)空白”。(3)各取10 mL試樣氧化液于2個(gè)100 mL容量瓶中，分別標(biāo)明“試樣”及“試樣空白”。(4)于“標(biāo)準(zhǔn)空白”及“試樣空白”溶液中各加5 mL硼酸-乙酸鈉溶液，混合搖動(dòng)15 min，用水稀釋至100 mL，在4 ℃冰箱中放置2～3 h，取出備用。(5)于“試樣”及“標(biāo)準(zhǔn)”溶液中各加5 mL 500 g/L乙酸鈉溶液，用水稀釋至100 mL，備用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取上述“測(cè)定(5)”中“標(biāo)準(zhǔn)”溶液(抗壞血酸質(zhì)量濃度為10 μg/mL)0.5、1.0、1.5和2.0 mL標(biāo)準(zhǔn)系列，取雙份分別置于10 mL帶蓋試管中，再用水補(bǔ)充至2.0 mL。

熒光反應(yīng)：取“測(cè)定(4)”中“標(biāo)準(zhǔn)空白”溶液、“試樣空白”溶液及“測(cè)定(5)”中“試樣”溶液各2 mL，分別置于10 mL帶蓋試管中。在暗室迅速向各管中加入5 mL鄰苯二胺溶液，振搖混合，在室溫下反應(yīng)35 min，于激發(fā)光波長(zhǎng)338 nm、發(fā)射光波長(zhǎng)420 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度。標(biāo)準(zhǔn)系列熒光強(qiáng)度分別減去標(biāo)準(zhǔn)空白熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的抗壞血酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或進(jìn)行相關(guān)計(jì)算，其直線回歸方程供計(jì)算使用。

計(jì)算公式見(jiàn)式(3)：

X=c·V/m×F×100/1 000

(3)

式中：X為試樣中抗壞血酸及脫氫抗壞血酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)，c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得或由回歸方程算得試樣溶液質(zhì)量濃度，m為試樣的質(zhì)量，V為熒光反應(yīng)所用試樣體積，F(xiàn)為試樣溶液的稀釋倍數(shù)。計(jì)算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后1位。

精密度：在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。

1.3.5 維生素C 按照GB 6195-86 中2,6-二氯靛酚滴定法[20]測(cè)定。此方法不適用于深色樣品。

抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/mL)：稱(chēng)取100 mg(準(zhǔn)確至0.l mg)抗壞血酸，溶于浸提劑中并稀釋至100 mL?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

2,6-二氯靛酚(2,6-二氯靛酚吲哚酚鈉鹽)溶液：稱(chēng)取碳酸氫鈉52 mg溶解在200 mL熱蒸餾水中，然后稱(chēng)取2,6-二氯靛酚50 mg溶解在上述碳酸氫鈉溶液中。冷卻定容至250 mL，過(guò)濾至棕色瓶?jī)?nèi)，保存在冰箱中。每次使用前，用標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸標(biāo)定其滴定度。即吸取1 mL抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于50 mL錐形瓶中，加入l0 mL浸提劑，搖勻，用2,6-二氯靛酚溶液滴定至溶液呈粉紅色15 s 不褪色為止。同時(shí)，另取10 mL浸提劑做空白試驗(yàn)。

滴定度按式(4)計(jì)算：

T=(C·V) / (V1-V2)

(4)

式中：T為每毫升2,6-二氯靛酚溶液相當(dāng)于抗壞血酸的毫克數(shù)；C為抗壞血酸的濃度，V為吸取抗壞血酸的體積，V1為滴定抗壞血酸溶液所用2,6-二氯靛酚溶液的體積，V2為滴定空白所用2,6-二氯靛酚溶液的體積。

樣液制備：稱(chēng)取樣品100 g，放入組織搗碎機(jī)中，加100 mL浸提劑，迅速搗成勻漿。稱(chēng)10～40 g 漿狀樣品，用浸提劑將樣品移入100 mL容量瓶，并稀釋至刻度，搖勻過(guò)濾。若濾液有色，可按每克樣品加0.4 g白陶土脫色后再過(guò)濾。

滴定：吸取l0 mL濾液放入50 mL錐形瓶中，用已標(biāo)定過(guò)的2,6-二氯靛酚溶液滴定，直至溶液呈粉紅色15 s不褪色為止。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

結(jié)果按式(5)計(jì)算：

維生素C質(zhì)量分?jǐn)?shù)=[(V-V0)·T·A] /W×100

(5)

式中：V為滴定樣液時(shí)消耗染料溶液的體積，V0為滴定空白時(shí)消耗染料溶液的體積，T為2,6-二氯靛酚染料滴定度，A為稀釋倍數(shù)，W為樣品質(zhì)量。

平行測(cè)定的結(jié)果用算術(shù)平均值表示，取3位有效數(shù)字，含量低的保留小數(shù)點(diǎn)后2位數(shù)字。平行測(cè)定結(jié)果的相對(duì)相差，在維生素C質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于20 mg/100 g時(shí)，不得超過(guò)2%，小于20 mg/100 g 時(shí)，不得超過(guò)5%。

1.3.6 維生素E 按照GB/T 5009.82-2003中高效液相色譜法[21]測(cè)定。

維生素E標(biāo)準(zhǔn)液：α-生育酚(純度95%)，γ-生育酚(純度95%)，δ-生育酚(純度95%)。用脫醛乙醇分別溶解以上3種維生素E標(biāo)準(zhǔn)品，使其濃度大約為1 mL相當(dāng)于1 mg。臨用前用紫外分光光度計(jì)分別標(biāo)定此3種維生素E溶液的準(zhǔn)確濃度。

內(nèi)標(biāo)溶液：稱(chēng)取苯并[е]芘(純度98%)，用脫醛乙醇配制成每1 mL相當(dāng)10 μg苯并[е]芘的內(nèi)標(biāo)溶液。

試樣處理：(1)皂化。準(zhǔn)確稱(chēng)取1～10 g試樣(含維生素E各異構(gòu)體約為40 μg)于皂化瓶中，加30 mL無(wú)水乙醇，進(jìn)行攪拌，直到顆粒物分散均勻?yàn)橹?。? mL 100 g/L抗壞血酸，苯并[е]芘標(biāo)準(zhǔn)液2.00mL，混勻。10 mL氫氧化鉀(1+1)，混勻。于沸水浴回流30 min使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷卻。(2)提取。將皂化后的試樣移入分液漏斗中，用50 mL水分2～3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用約100 mL乙醚分兩次洗皂化瓶及其殘?jiān)?，乙醚液并入分液漏斗中。如有殘?jiān)?，可將此液通過(guò)有少許脫脂棉的漏斗濾入分液漏斗。輕輕振搖分液漏斗2 min，靜置分層，棄去水層。(3)洗滌。用約50 mL水洗分液漏斗中的乙醚層，用pH試紙檢驗(yàn)直至水層不顯堿性(最初水洗輕搖，逐次振搖強(qiáng)度可增加)。(4)濃縮。將乙醚提取液經(jīng)過(guò)無(wú)水硫酸鈉(約5 g)濾入與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器配套的250～300 mL球形蒸發(fā)瓶?jī)?nèi)，用約100 mL乙醚沖洗分液漏斗及無(wú)水硫酸鈉3次，并入蒸發(fā)瓶?jī)?nèi)，并將其接至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，于55 ℃水浴中減壓蒸餾并回收乙醚，待瓶中剩下約2 mL乙醚時(shí)，取下蒸發(fā)瓶，立即用氮?dú)獯档粢颐?。立即加?.00 mL乙醇，充分混合，溶解提取物。(5)將乙醇液移入一小塑料離心管中離心5 min(5 000 r/min)。上清液供色譜分析。如果試樣中維生素含量過(guò)少，可用氮?dú)鈱⒁掖家捍蹈珊?，再用乙醇重新定容。并記下體積比。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：先標(biāo)定維生素E標(biāo)準(zhǔn)濃度，采用內(nèi)標(biāo)法[21]定量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

高效液相色譜分析：色譜條件確定。

試樣分析：取試樣濃縮液20 μL，待繪制出色譜圖及色譜參數(shù)后，再進(jìn)行定性和定量。(1)定性，用標(biāo)準(zhǔn)物色譜峰的保留時(shí)間定性。(2)定量，根據(jù)色譜圖求出某種維生素峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，以此值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到其質(zhì)量濃度?；蛴没貧w方程求出其質(zhì)量濃度。

計(jì)算公式見(jiàn)式(6)：

X=c/m×V×100/1 000

(6)

式中：X為維生素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到某種維生素質(zhì)量濃度，V為試樣濃縮定容體積，m為試樣質(zhì)量。計(jì)算結(jié)果表示到3位有效數(shù)字。

精密度：在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel及DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葡萄品種中花青素等物質(zhì)的動(dòng)態(tài)質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

將采集的不同葡萄品種及接種灰霉病菌后花青素等物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)匯總、統(tǒng)計(jì)分析及柱形圖如表3、圖1～圖6。

從圖1～圖6中可看出:(1)從隨著葡萄生育期的發(fā)展其內(nèi)含物變化的水平看，除酚類(lèi)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先下降后有所緩升的趨勢(shì)，與李楊昕等[22]的研究相一致，果實(shí)中總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)在漿果生長(zhǎng)期開(kāi)始下降，至漿果成熟期達(dá)最低點(diǎn)，之后有小幅度的上升；花青素、可溶性總糖、維生素C、總抗壞血酸及維生素E質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，符合生長(zhǎng)規(guī)律。(2)從健康果實(shí)和接種發(fā)病后果實(shí)其內(nèi)含物變化的水平看，同一品種的果實(shí)在接種發(fā)病后的花青素、酚類(lèi)物、維生素C、總抗壞血酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均比健康果實(shí)有所降低，而可溶性總糖和維生素E質(zhì)量分?jǐn)?shù)在接種發(fā)病后深色葡萄品種表現(xiàn)升高、白色品種表現(xiàn)下降，說(shuō)明灰霉病菌均對(duì)這些內(nèi)含物產(chǎn)生一定影響，且有規(guī)律可循。同時(shí)經(jīng)方差分析結(jié)果表明(表3)，大多數(shù)發(fā)病果實(shí)的花青素等物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與健康果實(shí)存在一定差異，這就證明葡萄灰霉病的發(fā)生和花青素等物質(zhì)有密切關(guān)系，質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高抗病性較強(qiáng)，反之則弱。(3)深色品種各內(nèi)含物質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本上均較白色品種高，且接種后仍高于白色品種。

表3 不同葡萄品種及接種灰霉病菌后花青素等物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 3 Mass fraction changes of anthocyanin and other material in different grape varieties and after inoculated with Botrytis cinerea

注： 數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”，同列不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note：Date in the table means mean±SE，different small letters within a column showed significant difference (P<0.05).The same as below.

圖1 深色葡萄品種中花青素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.1 Anthocyanin mass fraction in dark grape varieties

圖2 不同葡萄品種中酚類(lèi)物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.2 Phenols mass fraction in different grape varieties

圖3 不同葡萄品種中可溶性總糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.3 Total soluble sugar mass fraction in different grape varieties

圖4 白色葡萄品種中維生素C的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.4 Vitamin C mass fraction in white grape varieties

圖5 深色葡萄品種中總抗壞血酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.5 Total ascorbic acid mass fraction in dark grape varieties

2.2 賀蘭山東麓不同葡萄品種抗灰霉病差異

從圖7～12可看出: 在葡萄灰霉病菌侵染后，不同葡萄品種中花青素、酚類(lèi)物、糖分、維生素C、總抗壞血酸及維生素E的降幅較一致，均為‘赤霞珠’<‘梅鹿輒’<‘西拉’<‘雷司令’<‘霞多麗’<‘白詩(shī)楠’，降幅越小，說(shuō)明葡萄灰霉病菌對(duì)該品種的影響越小，其抗病性越強(qiáng)，反之越易感病。由此可知，深色品種由于含有較高抗氧化能力較強(qiáng)的花青素、酚類(lèi)物等物質(zhì)，且接種后仍高于白色品種，灰霉病菌對(duì)其影響較小，從而較白色品種具有很高的抗病性，尤其以‘赤霞珠’為最，其次為‘梅鹿輒’；白色品種以‘白詩(shī)楠’最易感病，其次是‘霞多麗’。

圖6 不同葡萄品種中維生素E的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.6 Vitamin E mass fraction in different grape varieties

2.3 不同葡萄品種各內(nèi)含物與灰霉病發(fā)生情況的相關(guān)性分析

從表4可以看出，不同葡萄品種大田果穗發(fā)病率和室內(nèi)接種后果粒發(fā)病率的發(fā)生規(guī)律與其相應(yīng)的各內(nèi)含物平均降幅高低相一致，呈正相關(guān)。比較抗灰霉病的品種(深色品種)，各內(nèi)含物平均降幅較小，品種之間無(wú)明顯差異；比較易感病的品種(白色品種)，各內(nèi)含物平均降幅較大，品種之間無(wú)明顯差異。而白色品種與深色品種相比差異明顯。

圖7 深色葡萄品種中花青素對(duì)葡萄灰霉病菌的響應(yīng)Fig.7 Response of anthocyanin in dark grape varieties to Botrytis cinerea

圖8 不同葡萄品種中酚類(lèi)物對(duì)葡萄灰霉病菌的響應(yīng)Fig.8 Response of phenolic in different grape varieties to Botrytis cinerea

圖9 不同葡萄品種中可溶性總糖對(duì)葡萄灰霉病菌的響應(yīng)Fig.9 Response of total soluble sugar in different grape varieties to Botrytis cinerea

圖10 白色葡萄品種中維生素C對(duì)葡萄灰霉病菌的響應(yīng)Fig.10 Response of vitamin C in white grape varieties to Botrytis cinerea

圖11 深色葡萄品種中總抗壞血酸對(duì)葡萄灰霉病菌的響應(yīng)Fig.11 Response of total ascorbic acid in dark grape varieties to Botrytis cinerea

圖12 不同葡萄品種中維生素E對(duì)葡萄灰霉病菌的響應(yīng)Fig.12 Response of vitamin E in different grape varieties to Botrytis cinerea

品種Varieties大田果穗發(fā)病率/%Incidenceofearinthefild室內(nèi)接種后果粒發(fā)病率/%Incidencerateoffruitafterindoorinoculation平均降幅/% Averagedecline花青素Anthocyanin酚類(lèi)物Phenols可溶性總糖Totalsolublesugar維生素CVitaminC總抗壞血酸Totalascorbicacid維生素EVitaminE赤霞珠 Cabernet1.0020.7613.24±1.15b14.14±1.69b-9.50±4.09c/3.67±0.22b-26.20±5.54c梅鹿輒 Merlot1.0035.1816.66±1.82b15.29±2.07ab4.34±6.64bc/17.90±0.62ab-17.07±2.76bc西拉 Syrah3.3361.1430.84±1.11a17.05±1.32ab7.55±7.02b/27.90±4.57a-13.17±3.86bc雷司令 Riesling5.7169.97/21.04±1.04ab11.78±6.44ab12.18±1.93a/0.25±7.01ab霞多麗 Chardonnay9.4372.23/26.20±3.07ab16.71±9.35ab23.68±3.85a/11.76±9.29a白詩(shī)楠 WhiteShinan10.8682.57/35.18±14.29a26.17±15.44a26.67±6.67a/15.87±6.92a

3 結(jié)論與討論

3.1 葡萄灰霉病與酚類(lèi)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的關(guān)系

葡萄中含有的酚類(lèi)物質(zhì)主要有類(lèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)、縮和單寧(即原花色素)、花色素和酚酸等。本試驗(yàn)中從果實(shí)膨大期到轉(zhuǎn)色期，再到成熟期，不同葡萄品種的酚類(lèi)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先下降后有所緩升的趨勢(shì)，與李楊昕等[22]的研究相一致，果實(shí)中總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)在漿果生長(zhǎng)期開(kāi)始下降，至漿果成熟期達(dá)最低點(diǎn)，之后有小幅度上升。可能是由于隨著果實(shí)的成熟，果粒內(nèi)部發(fā)生一系列復(fù)雜的生化變化：含糖量急劇增加，含酸量下降，果皮內(nèi)芳香物質(zhì)逐漸形成，單寧則不斷減少等；同時(shí)，種子由綠色變?yōu)樽睾稚?，種皮變硬。此時(shí)，果皮和果肉內(nèi)的總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低至最低點(diǎn)，可能與此時(shí)的酚類(lèi)物質(zhì)大量向種子運(yùn)輸有關(guān)。這與《葡萄學(xué)》(賀普超，1999)中關(guān)于葡萄果實(shí)發(fā)育和莖葉的生長(zhǎng)特點(diǎn)相符合，為進(jìn)一步深入闡明次生物質(zhì)代謝途徑提供一定試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

3.2 不同葡萄品種抗灰霉病菌的差異

在葡萄灰霉病菌侵染后，不同葡萄品種中花青素、酚類(lèi)物、糖分、維生素C、總抗壞血酸及維生素E的降幅較一致，均為‘赤霞珠’<‘梅鹿輒’<‘西拉’<‘雷司令’<‘霞多麗’<‘白詩(shī)楠’，降幅越小，說(shuō)明葡萄灰霉病菌對(duì)該品種的影響越小，其抗病性越強(qiáng)，反之越易感病。由此可知，所測(cè)深色品種中以‘赤霞珠’最為抗病，其次為‘梅鹿輒’；白色品種以‘白詩(shī)楠’最易感病，其次是‘霞多麗’。

3.3 有利葡萄灰霉病的發(fā)病條件及防治

低溫、高濕、傷口是葡萄灰霉病流行的主要因素，一般在葡萄較為敏感的開(kāi)花期及坐果期遇到這些條件，極易誘發(fā)病害流行。但在本研究中發(fā)現(xiàn)，葡萄灰霉病的防治還應(yīng)注意兩點(diǎn)：一是在轉(zhuǎn)色期即漿果即將成熟時(shí)和果實(shí)成熟期也是病菌易侵染的時(shí)期，應(yīng)適時(shí)通過(guò)減少菌源、農(nóng)業(yè)措施、藥劑防治，以控制其大發(fā)生，降低損失。二是根據(jù)不同品種的抗性不同有針對(duì)性的進(jìn)行防治，如易感染的白色品種‘白詩(shī)楠’‘霞多麗’可進(jìn)行重點(diǎn)防治，抗性較強(qiáng)的深色品種‘赤霞珠’‘梅鹿輒’可根據(jù)環(huán)境條件進(jìn)行靈活預(yù)防，減少投入與污染。

3.4 存在問(wèn)題

隨著不同葡萄品種對(duì)灰霉病菌脅迫響應(yīng)的深入研究，不斷有新的疑問(wèn)和問(wèn)題有待解決，如除果實(shí)外其他部位的內(nèi)含物變化是否與灰霉病有相關(guān)？在大田環(huán)境下接種后的研究結(jié)果是否會(huì)和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)接種研究結(jié)果一致？大田環(huán)境下怎樣實(shí)現(xiàn)有效接種？這些工作都還需進(jìn)一步研究論證。

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(責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

Response of Different Grape Cultivars toBotrytiscinereaStress

JIANG Caige1，WANG Guozhen1，ZHANG Yi1and SHAO Pengmei2

(1.Institute of Plant Protection，Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Yinchuan 750002，China; 2.Agricultural Technology Service Center of Zhenbeibao Township in Xixia District of Yinchuan，Yinchuan 750021，China)

In order to investigate the susceptibility of various leading grape cultivars toBotrytiscinereain the eastern foot of Helan Mountain，and to propose the corresponding control measures based on the distribution characteristics of various cultivars with different resistances，the contents of inclusions in various grape cultivars，namely，anthocyanins，phenols，sugar，total ascorbic acid (vitamin C) and vitamin E were detected using malvidin standard method，Arnow method，direct titration method，fluorescence method (or 2,6-two chlorine indophenol titration method) and HPLC detection respectively.The results showed that the mass fractions of various substances in the pathogenetic fruit were significantly different from those of the healthy fruit.It was proved that the incidence ofBotrytiscinereawas closely related to the grape inclusions，the higher the mass fraction，the stronger the disease resistance，and the weaker in the opposite.Judging by the decreasing amplitude of the inclusions of different grape cultivators infected byBotrytiscinerea，the disease resistances of various grape cultivators were in following sequence:‘Cabernet’>‘Merlot’>‘Syrah’>‘Riesling’>‘Chardonnay’>‘White Shinan’.The lab detecting results were consistent with the field incidence，and the field control should be focused on white cultivars.

Grape;Botrytiscinerea; Inclusion investigation; Disease resistance

JIANG Caige，female，master，assistant research fellow.Research area：grape diseases and pests.E-mail：jiangcaige168@126.com

ZHANG Yi，male，master，research fellow.Research area：prevention and control of diseases and pests in agriculture and forestry.E-mail：nxzhy0951@163.com

日期：2016-12-29

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161229.1008.030.html

2015-09-06

2016-07-27

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2013BAD09B02)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專(zhuān)項(xiàng)資金(CARS-30)；寧夏自然科學(xué)基金(NZ1168)；寧夏農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新先導(dǎo)資金(NKYQ-15-05)。

姜彩鴿，女，碩士，助理研究員，從事葡萄病蟲(chóng)害研究。E-mail:jiangcaige168@126.com

張 怡，男，碩士，研究員，主要從事農(nóng)林病蟲(chóng)害防治研究。E-mail:nxzhy0951@163.com

S436.631.1+9

A

1004-1389(2017)02-0262-12

Received 2015-09-06 Returned 2016-07-27

Foundation item Key Sci-tech Project of the“12th 5-Year-Plan”of China(No.2013BAD09B02)；Special Fund for the Technical System of Modern Agricultural Industry(No.CARS-30)；Natural Science Foundation of Ningxia(No.NZ1168)；Science and Technology Innovation Pilot Project of Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences(No.NKYQ-15-05).