桑樹組織培養(yǎng)育苗初報*

蘇 偉 李茂生 陳 谷 蘇茂科

(四川省三臺蠶種場，四川 三臺 621100)

隨著桑樹產(chǎn)業(yè)的多元化發(fā)展，各地區(qū)對優(yōu)良桑苗的需求量急劇上升，而許多優(yōu)良的桑品種為保持母本性狀只能通過嫁接繁育，嫁接繁育成活率與嫁接技術(shù)和砧木健壯程度有很大關(guān)系，一般情況下育成一株完整的嫁接苗至少需要1年的時間，這大大影響了其推廣程度。研究優(yōu)質(zhì)桑苗快繁技術(shù)迫在眉睫。本文以接近一年的組培試驗為基礎(chǔ)資料，現(xiàn)就組織培養(yǎng)育苗操作及優(yōu)劣勢進(jìn)行介紹，供同仁參考。

1 桑樹組織培養(yǎng)流程

1.1 培養(yǎng)材料的采集

在試驗當(dāng)天采取桑樹品種枝條上嫩葉和新梢。

1.2 培養(yǎng)材料的消毒及外植體的制備

(1)先用流動水沖洗采集的培養(yǎng)材料，直至表面無殘留污垢，用濾紙吸干水分，置于無菌操作臺進(jìn)行紫外滅菌30min。

(2)將桑樹葉片切成約0.5cmx0.5cm的小片，新梢切成約0.5cm的小段，用75%的乙醇溶液漂洗30s后，迅速取出材料，用無菌水沖洗2次，用體積分?jǐn)?shù)為5%的次氯酸鈉溶液消毒8min，再用無菌水沖洗5次，用無菌濾紙吸干水分，得到接種所用的無菌外植體[1]。

1.3 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配置

根據(jù)王琳[2]利用組織培養(yǎng)技術(shù)繁育桑樹無病毒苗的試驗和王茜齡[3]利用桑樹特異種質(zhì)資源的冬芽組織培養(yǎng)再生植株的試驗基礎(chǔ)數(shù)據(jù)來配制培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基(含糖和瓊脂粉)，加入無菌水，pH值保證在5.8，攪拌均勻，分別加入6-BA 溶液，2.4-D溶液，NAA溶液，KT溶液，定容后保證濃度分別為1.5mol/L、0.5mol/L、0.5mol/L、1mol/L。裝瓶后在高壓滅菌鍋中消毒，取出試劑瓶待培養(yǎng)基冷卻成半透明固體膠狀后進(jìn)行接種。

1.4 接種和初代培養(yǎng)

(1)接種：接種前，操作人員一定要提前進(jìn)行消毒處理，避免帶菌操作。在無菌壞境下，利用無菌操作臺將切好的外植體立即接在培養(yǎng)基上，每瓶接種3-6個。接種后，用專業(yè)封口膜口。

(2)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基大多應(yīng)保持在25℃左右，在形成愈傷組織前不需要光照。

1.5 增殖培養(yǎng)

外植體的增殖是組培的關(guān)鍵階段，在新梢等形成后為了擴大繁殖系數(shù)，需要繼代培養(yǎng)。把材料分株或切段轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中。采用1/2MS培養(yǎng)基(含糖和瓊脂)，增殖培養(yǎng)基內(nèi)含物濃度為1mg/L 6-BA，0.25mg/L 2.4-D。在pH值5.8、溫度25℃、2000lux光照12h條件下增殖培養(yǎng)1個月左右后，可視情況進(jìn)行再增殖。

1.6 根的誘導(dǎo)

繼代培養(yǎng)形成的不定芽和側(cè)芽等一般沒有根，必須轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。將繼代培養(yǎng)中高于1.5cm的幼苗取出，轉(zhuǎn)接到1/2MS(含糖和瓊脂)生根培養(yǎng)基中,內(nèi)含物濃度為0.75mg/L 6-BA，0.25mg/L 2.4-D，1.5mg/L NAA。pH值、溫度、光照條件同上述增殖培養(yǎng)參數(shù)，1個月后即可獲得鍵壯根系。

1.7 組培苗的練苗移栽

試管苗從無菌到光、溫、濕穩(wěn)定的環(huán)境進(jìn)入自然環(huán)境，必須進(jìn)行煉苗。一般移植前，先將培養(yǎng)容器打開，于室內(nèi)自然光照下放3d，然后取出小苗，用自來水把根系上的營養(yǎng)基沖洗干凈，再栽入已準(zhǔn)備好的基質(zhì)中，基質(zhì)使用前最好消毒。移栽前要適當(dāng)遮蔭，加強水分管理，保持較高的空氣濕度(相對濕度98%左右)，但基質(zhì)不宜過濕，以防爛苗。

2 操作注意事項

2.1 接種室的消毒

植物組織培養(yǎng)技術(shù)實際上是一種無菌操作和無菌培養(yǎng)技術(shù),做好接種室的消毒是至關(guān)重要的。污染的主要來源是空氣中的細(xì)菌和真菌孢子,因此,每次接種前應(yīng)進(jìn)行地面的清潔衛(wèi)生工作,并用70%酒精噴霧使空氣的灰塵沉降,并用紫外線燈照射20min。接種前超凈工作臺面要用新潔爾滅或酒精擦洗,并定期清洗過濾膜,以延長使用壽命。

2.2 無菌操作要求

工作人員使用的工作服、帽子、口罩等,要經(jīng)常保持干凈,并定期進(jìn)行消毒,即將洗凈、晾干的衣帽、口罩等用紙包好后與培養(yǎng)基一起進(jìn)行高壓滅菌。工作人員的頭發(fā)、衣服、手指中都帶有許多雜菌,為此要穿上工作服,戴上帽子,也必須剪除指甲,并用肥皂擦洗,最好再在新潔爾滅溶液中浸泡10min,接種操作前則用70%酒精擦洗。工作人員的呼吸所產(chǎn)生的污染,主要是在接種時談話或咳嗽所引起的,因此,在操作時應(yīng)禁止談話并應(yīng)戴上口罩。

2.3 材料的分離、切取和接種

切割動作要快,防止擠壓使材料受損傷而招致培養(yǎng)失敗,也要避免使用生銹的刀片,以防止氧化現(xiàn)象產(chǎn)生。接種時要防止交叉污染的發(fā)生,刀和鑷子等接種工具使用一次應(yīng)放入70%酒精中浸泡,然后灼燒放涼備用。

接種時輕輕取下封口紙,動作要慢以免氣流沖入瓶中造成污染。將瓶口靠近酒精燈火焰,瓶口傾斜,以免空氣中的微生物落入瓶中,將瓶口外部在燈焰上燎數(shù)秒鐘,將灰塵雜物等固定在原處,然后用鑷子將外植體送入瓶中,材料在培養(yǎng)容器內(nèi)的分布要均勻,以保證必要的營養(yǎng)面積和光照條件。

3 組培的優(yōu)勢

(1)繁殖速度快、繁殖系數(shù)大用試管快繁技術(shù)繁殖, 可節(jié)約繁殖材料，只取原材料上的一小塊組織或器官就能在短期內(nèi)生產(chǎn)出大量市場所需的優(yōu)質(zhì)苗木, 每年可以繁殖出幾萬甚至數(shù)百萬的小植株，既不損傷原材料又可獲得較高的經(jīng)濟效益。

(2)繁殖方式多有短枝扦插、芽增殖、原球莖、器官分化和胚狀體發(fā)生。

(3)繁殖后代整齊一致,能保持原有品種的優(yōu)良性狀 試管繁殖是一種微型的無性繁殖,它取材于同一個體的體細(xì)胞而不是性細(xì)胞,因此其后代遺傳性非常一致,能保持原有品種的優(yōu)良性狀。對保質(zhì)、保純有著特殊作用?？色@得大量的統(tǒng)一規(guī)格、高質(zhì)量的桑苗，桑苗商品性好。

(4)可獲得無毒苗 采用莖尖培養(yǎng)的方法或結(jié)合熱處理除去絕大數(shù)植物的病毒、真菌和細(xì)菌，使植株生長勢強、色澤鮮艷、抗逆能力提高。

(5)可進(jìn)行周年工廠化生產(chǎn) 、經(jīng)濟效益高試管快繁是在人工控制的條件下進(jìn)行的集約化生產(chǎn),不受自然環(huán)境中季節(jié)和惡劣天氣的影響。所以不受季節(jié)限制，可以全年進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn), 生產(chǎn)效率高。從取材→接種→培養(yǎng)→生根→移栽，可像工廠化一樣生產(chǎn)，所以這一技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用被稱為是農(nóng)業(yè)上的一次“革命”。對反季節(jié)生產(chǎn)有著特殊作。

4 存在的問題

(1)基礎(chǔ)設(shè)施缺乏由于組織培養(yǎng)對于基礎(chǔ)設(shè)施條件要求較高，現(xiàn)目前許多單位都不具備硬件設(shè)施，導(dǎo)致開展起來有一定難度，特別是對于培養(yǎng)基的滅菌以及接種無菌操作。組織培養(yǎng)對于無菌環(huán)境要求較高，在培養(yǎng)的任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都會導(dǎo)致試驗的失敗。即加大硬件設(shè)施的建設(shè)，完善相關(guān)的儀器設(shè)備對開展基礎(chǔ)科學(xué)試驗是很有必要的。

(2)專業(yè)人員水平薄弱組織培養(yǎng)需要熟悉相關(guān)操作且掌握此類專業(yè)知識的專業(yè)技術(shù)人員，由于缺少這樣的專業(yè)技術(shù)人員或者專業(yè)人員理論水平薄弱，即使在有條件的情況下也沒法進(jìn)行組織培養(yǎng)育苗。所以加大對專技人員的繼續(xù)教育和培訓(xùn)有助于提高整體的創(chuàng)造力和技術(shù)水平。

(3)成本偏高、風(fēng)險高對于傳統(tǒng)育苗來說，一株成型的嫁接苗成本大約在5-8角之間，而組織培養(yǎng)育苗，除去基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)，僅僅算上組培藥物成本、人力成本、水電成本以及移栽成本，一株桑苗成本基本在4-5元左右，成本接近傳統(tǒng)育苗的10倍。高成本費用對于桑苗這種市面經(jīng)濟價值不高的苗木來說并不劃算。組織培養(yǎng)對于滅菌要求很嚴(yán)格，若是不小心染菌，培養(yǎng)材料則會污染作廢，對其是必是致命的打擊，所以組織培養(yǎng)對平時的操作要求和環(huán)境消毒很嚴(yán)格，存在一定風(fēng)險性。

(4)移栽苗生長前期處于弱勢桑苗屬于木本植物，相比草本植物不易培養(yǎng)，且從培養(yǎng)瓶中組培生產(chǎn)的苗初次移栽到大田中，前期有一段適應(yīng)期，適應(yīng)期期間普遍抗逆性都沒有傳統(tǒng)擴繁的桑苗強，長勢較弱，前期生長較慢，易死亡，存活率不高。

5 討論

根據(jù)以往桑苗組織培養(yǎng)試驗數(shù)據(jù)來看，綜合分析對比組織培養(yǎng)優(yōu)缺點，可見組織培養(yǎng)雖能保存母本優(yōu)良性狀，培養(yǎng)無毒苗，但是成本和技術(shù)要求頗高。組織培養(yǎng)在桑樹苗木產(chǎn)業(yè)化上暫時存在部分問題，但是潛力巨大。同時組織培養(yǎng)在稀缺桑品種資源保存方面可以發(fā)揮優(yōu)勢，擴繁稀有品種，保存稀缺資源和維持品種多樣性。并且植物組織培養(yǎng)對于從細(xì)胞多倍體方向研發(fā)新品種[4]也有至關(guān)重要的作用。

[1] 談建中. 桑樹組織培養(yǎng)研究綜述[J]. 江蘇蠶業(yè),1991,13(4):1-6.

[2] 王琳. 利用組織培養(yǎng)技術(shù)繁育桑樹無病毒苗的試驗[J].蠶業(yè)科學(xué)，2013,39(4)：643-649.

[3] 王茜齡.利用桑樹特異種質(zhì)資源的冬芽組織培養(yǎng)再生植株的試驗[J].蠶業(yè)科學(xué),2012,38(5)：924-929.

[4] 王茜齡. 桑樹組織培養(yǎng)誘導(dǎo)多倍體植株[J].林業(yè)科學(xué),2008,44(6)：164-167.