紫草素抑制紫外線輻射后黑素合成的研究

訾紹霞　劉愛英　張?zhí)m娟　靳旺洋　馬慧軍　程玉娟

[摘要]目的：研究紫草素對(duì)正常人表皮黑素細(xì)胞黑素合成的影響，及對(duì)紫外線輻射后黑素細(xì)胞黑素合成的影響。方法：用體外培養(yǎng)正常人表皮黑素細(xì)胞供給實(shí)驗(yàn)，黑素細(xì)胞經(jīng)10mJ/cm²外線輻射后，分別以選定的幾個(gè)濃度（主要為0.25ug/L、0.5ug/L、1ug/L三種濃度）的紫草素培養(yǎng)72h，測(cè)定細(xì)胞增殖率、黑素含量及酪氨酸酶活性。結(jié)果：紫草素可減輕紫外線輻射對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，并可抑制紫外線輻射后的表皮黑素細(xì)胞的黑素合成；較高濃度紫草素（大于0.5ug/L）對(duì)未經(jīng)照射的表皮黑素細(xì)胞的增殖有抑制作用，但對(duì)黑素合成無明顯影響。結(jié)論：紫草素可以明顯抑制紫外線輻射后表皮黑素細(xì)胞的黑素合成，推測(cè)其對(duì)紫外線輻射的黑素細(xì)胞有光保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]紫草素；黑素細(xì)胞；黑素合成；酪氨酸酶；紫外線輻射；光保護(hù)

[中圖分類號(hào)]R339.3 8

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1008-6455（2017）01-0088-03

色素增加性皮膚病如黃褐斑、炎癥后色素沉著等一直是皮膚科比較常見的疾病，紫外線輻射可以加重或者誘發(fā)色素沉著發(fā)生的問題已經(jīng)越來越受到重視，隨著人們生活水平的提高，美白外用療法及對(duì)防曬產(chǎn)品的研究漸漸成為熱點(diǎn)。紫草含具有多種生物活性的有效成分，主要包括萘醌類化合物左旋紫草素及其衍生物，其有抗炎作用，抗病原微生物作用，抗癌作用，抗生育作用，抗氧化作用等。姜愛莉等人則報(bào)道了紫草中的抗氧化化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)其有很強(qiáng)的抗氧化活性，是一種有開發(fā)前途的抗氧化劑。作為一種強(qiáng)抗氧化劑，紫草對(duì)黑素細(xì)胞的光保護(hù)作用，目前卻沒有相關(guān)的報(bào)道，筆者基于此，進(jìn)行了以下相關(guān)研究。

1.材料和方法

1.1材料：二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶、分離酶（dispase）、MCDBl53培養(yǎng)基、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）均購自Sigma公司；小牛血清、胎牛血清、1640培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、左旋多巴、TritonX 100購自Hyclone公司；細(xì)胞因子（NGF，F(xiàn)GF，ET1）購自Sino Biological公司；紫草素由中國(guó)人民解放軍309醫(yī)院皮膚科惠贈(zèng)；以DMSO配制成50ug/L的貯存液，-80°C冰箱保存，使用前稀釋至工作濃度。25cm²塑料培養(yǎng)瓶，96孔培養(yǎng)板為美國(guó)Corning公司產(chǎn)品；GS-2004日光模擬器（北京澳華公司），紫外分光光度計(jì)（上海精密分析儀器有限公司），光輻照度計(jì)量?jī)xSUV 5（中國(guó)計(jì)量科學(xué)院）；Therm0371型二氧化碳培養(yǎng)箱，Eppendorf微量移液器，Leica倒置顯微鏡，無菌工作臺(tái)等。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：取泌尿外科包皮環(huán)切術(shù)后的分離體做標(biāo)本，碘伏浸泡15min，PBS沖洗3遍，眼科剪去除皮下脂肪組織及微小血管，將組織剪成1cm×1cm的小塊，加入0.5%分離酶至液體完全覆蓋組織，放置4℃過夜使真皮表皮充分分離，眼科鑷小心分離表真皮，將表皮置于0.25%的胰酶中37℃消化5～10min，顯微鏡觀察消化情況良好后加入3～5ml含新生牛血清的1640培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打細(xì)胞懸液，使細(xì)胞分散，200目濾網(wǎng)過濾，2000rpm離心5min，棄掉上清液后加入配制好的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基，吹打使細(xì)胞懸浮，計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)合適的細(xì)胞濃度，接種到25cm²的培養(yǎng)瓶中（接種密度為10⁵個(gè)細(xì)胞/cm²），常規(guī)培養(yǎng)換液，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)傳代，取傳代2代～3代純化的黑素細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞接種24h后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)處理。

黑素細(xì)胞的鑒定：采取HMB45單抗免疫組化和FontanaMasson染色方法對(duì)黑素細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.2.2紫外線照射：GS-2004日光模擬器能夠模擬自然紫外線照射，根據(jù)文獻(xiàn)選定紫外線照射劑量為10mJ/cm²，照射強(qiáng)度為1mw/cm²，光源距離培養(yǎng)板20cm垂直照射，照射前將培養(yǎng)基換為0.1M滅菌的PBS，照射后換回相應(yīng)的培養(yǎng)基。

1.2.3藥物配制和實(shí)驗(yàn)分組：使用DMSO配制紫草素母液，濃度為50ug/L，-80℃保存，用前再用新鮮培養(yǎng)基調(diào)至終濃度。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)選用紫草素的終濃度為0.25ug/L、0.5ug/L、1ug/L、2.5ug/L、5ug/L。

實(shí)驗(yàn)分組分別為空白對(duì)照組（僅加入等量相應(yīng)溶媒）、紫草素組（濃度分別為0.25ug/L、0.5ug/L、1ug/L、2.5ug/L、5ug/L）、紫外線輻射組、紫外線輻射+紫草素組（0.25ug/L、0.5ug/L 2個(gè)濃度）、陽性對(duì)照組（紫外線輻射+20ug/ml維生素c）。每一處理組分別作用細(xì)胞72h。

1.2.4MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖率：用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度A490nm值。細(xì)胞增值率以處理組A490/空白對(duì)照組A490的百分率來表示。

1.2.5黑素含量測(cè)定：NaOH裂解法測(cè)黑素含量，參照文獻(xiàn)的方法稍做改良，用分光光度計(jì)測(cè)定黑素的吸光度（A470nm）。黑素含量以（處理組A470/細(xì)胞數(shù)）/（空白對(duì)照組A470/細(xì)胞數(shù)）×100來表示。每一實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.6酪氨酸酶活性測(cè)定：參照文獻(xiàn)采用多巴氧化法，分光光度計(jì)測(cè)定黑素的吸光度值（A475nm）。酪氨酸酶活性以（處理組A475值/細(xì)胞數(shù)）/（空白對(duì)照組A475值/細(xì)胞數(shù)）×100來表示。每一實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.7數(shù)據(jù)處理：各組數(shù)據(jù)用x±s表示。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行組問單因素方差分析，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1對(duì)黑素細(xì)胞增殖率的影響：與空白對(duì)照組相比，紫草素濃度為0.25ug/L時(shí)，對(duì)黑素細(xì)胞的增殖沒有影響（P>0.05），紫草素濃度在0.5ug/L、1ug/L、2.5ug/L、5ug/L時(shí)對(duì)黑素細(xì)胞增殖率隨著濃度的增加而下降并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）（圖1）；紫外線（10mJ/cm²）照射后細(xì)胞增殖率降低（P<0.05），紫外線照射+紫草素組（濃度為0.25ug/L、0.5ug/L）與照射組相比，細(xì)胞增殖有明顯增加（P<0.05）。

2.2對(duì)黑素含量的影響：根據(jù)上述對(duì)黑素細(xì)胞增值率的影響結(jié)果及有關(guān)文獻(xiàn)。的報(bào)道，我們選擇了0.25ug/L，0.5ug/L，1ug/L三種濃度的紫草素來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比較，上述三種濃度的紫草素對(duì)黑素含量無影響（P>0.05）；紫外線照射可以明顯增加黑素含量（P<0.05），但紫外線輻射+紫草素（0.25ug/L，0.5ug/L）后，與單純紫外線輻射組相比較，黑素含量有所下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示有顯著差異（P<0.05）（圖2）。20ug/mL維生素c也有一定程度抑制紫外線輻射后黑素細(xì)胞黑素合成增加的作用，但與紫外線輻射組比較無明顯差異（P>0.05）。

2.3對(duì)酪氨酸酶活性的影響：紫草素組（0.25ug/L，0.5ug/L，1ug/L）與對(duì)照組比較，其對(duì)黑素細(xì)胞的酪氨酸酶活性無影響（P>0.05），紫外線照射可明顯增加酪氨酸酶活性（P<0.05）。與紫外線輻射組比較，加0.25ug/L紫草素和0.5ug/L紫草素組可明顯降低細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性（P<0.05）；20ug/ml維生素c組對(duì)紫外線輻射后細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性無明顯影響（P>0.05）（見圖3）。

3.討論

紫草的有效成分主要有以下兩大類：一類是脂溶性的萘醌類色素，包括紫草素（sh ikonin），乙酰紫草素（acetylshikonin），β，β二甲基丙烯酰紫草素（i sobuthyl2shikonin），β羥基異戊酰紫草素（β-hydaroxyi sovalerylshikonin），異戊酰紫草素（isovaleryl shikonin），去氧紫草素（deoxy shikonin）等；另一類是水溶性的多糖成分，含量在2%左右。萘醌類色素的主要藥理作用除了抗炎作用、抗病原微生物作用、抗癌作用、抗生育作用、保肝作用以外，還有抗凝血、抗免疫缺陷、抗前列腺素合成、抗真菌以及清除活性氧作用等。

本試驗(yàn)結(jié)果提示：紫草素在對(duì)黑素細(xì)胞增殖率影響不大（>83%）的濃度下（0.25ug/L、0.5ug/L）可以明顯抑制經(jīng)紫外線輻射后的黑素細(xì)胞的黑素合成，但對(duì)正常黑素細(xì)胞的黑素合成無影響。這與以前的相關(guān)研究有差異，筆者分析這可能與選擇培養(yǎng)的細(xì)胞株不同有關(guān)，也與培養(yǎng)細(xì)胞的所處狀態(tài)不同有關(guān)，共培養(yǎng)體系中的黑素細(xì)胞與純化的單一黑素細(xì)胞對(duì)紫草素的反應(yīng)是可以不同的，因?yàn)榻琴|(zhì)形成細(xì)胞可以通過分泌細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞的功能。在以前的研究中，王威，劉婷等表明，紫草素以及紫草多糖都具有一定的抗氧化活性。其中紫草素的抗氧化能力相當(dāng)于維生素c的35.5%，其抗氧化作用主要由于其醌結(jié)構(gòu)中在5位和8位上具有對(duì)應(yīng)酚羥基決定的?；诖耍覀兺茰y(cè)紫草素對(duì)紫外線輻射后的黑素細(xì)胞會(huì)有保護(hù)作用并設(shè)計(jì)了本研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了在不影響黑素細(xì)胞增殖率的濃度下（0.25ug/L）及影響不大的濃度下（0.5ug/L），紫草素可以明顯地抑制紫外線輻射后黑素細(xì)胞的黑素合成及酪氨酸酶活性，其光保護(hù)作用得到了證實(shí)。另有研究表明，復(fù)方紫草油外用于燒傷創(chuàng)面可以使局部ET-1和NO釋放減少，兩者比例更趨于協(xié)調(diào)，從而使創(chuàng)面微血管的收縮痙攣狀態(tài)減輕，組織缺血狀態(tài)得到緩解，自由基生成減少，最后達(dá)到抗炎的效果。而且早有實(shí)驗(yàn)證實(shí)活性氧自由基（ROs）與一氧化氮（NO）均具有很強(qiáng)的刺激黑素細(xì)胞黑素合成作用，紫外線輻射可誘導(dǎo)二者的產(chǎn)生，這也是紫外線促進(jìn)黑素合成的重要原因之一。因此我們推測(cè)紫草素可能通過抑制上述物質(zhì)的產(chǎn)生來發(fā)揮其光保護(hù)作用，這值得我們進(jìn)一步探討和研究。