低劑量ALA—PDT對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)和分泌細(xì)胞因子的作用研究

楊航　譚楊　唐輝　楊濤　楊桂紅　雷霞

[摘要]目的：研究不同劑量5-氨基酮戊酸-光動(dòng)力治療（5-aminolevulinic acid photodynami c，ALA-PDT）對(duì)體外培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響和分泌生長(zhǎng)因子的作用。方法：首先以噻唑藍(lán)（methylthi azolyldiphenyl-tetrazo liumbromide，MTT）檢測(cè)ALA-PDT對(duì)永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞系）增殖的影響，再用相同的方法檢測(cè)ALA-PDT對(duì)分離的人角質(zhì)形成細(xì)胞（kerot inocyte，Kc）增殖的影響，最后vXELISA法檢測(cè)ALA-PDT對(duì)Kc培養(yǎng)上清液中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量的影響。結(jié)果：低劑量ALA-PDT（0.1mM和0.OlmM ALA，紅光21J/cm²）能促進(jìn)HaCaT細(xì)胞和人角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖；高劑量ALA-PDT（0.5mM ALA，紅光21J/cm²）抑制其增殖。低劑量ALA-PDT干預(yù)24h后，bFGF分泌明顯高于0.5mM ALA組和單純紅光組；而VEGF呈現(xiàn)24h時(shí)輕度下降，24h后明顯增加的趨勢(shì)。結(jié)論：高劑量ALA-PDT抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，甚至殺傷細(xì)胞；低劑量ALA-PDT能促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，并且促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌bFGF和VEGF。

[關(guān)鍵詞]HaCaT細(xì)胞；角質(zhì)形成細(xì)胞；光動(dòng)力治療；ALA-PDT；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

[中圖分類號(hào)]R339.38 Q813.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1008-645 5（2017）01-0013-03

光動(dòng)力治療（photodynamic therapy，PDT）指的是在光敏劑參與下，以特定波長(zhǎng)的光照射病灶區(qū)，產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)，生成各種高反應(yīng)性的化學(xué)活性物質(zhì)，達(dá)到治療目的的新型治療方法。5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）是目前光動(dòng)力局部治療中最常用的光敏劑之一。應(yīng)用PDT治療疾病過程中，研究者們發(fā)現(xiàn)高劑量PDT可以殺滅腫瘤細(xì)胞和微生物，低劑量的則有抑制炎癥，治療光老化等作用。為了進(jìn)一步了解低劑量光動(dòng)力對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞的作用，本文擬研究不同劑量ALA-PDT對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞（kerotinocyte，Kc）增殖的影響和分泌細(xì)胞因子的作用。

1.材料和方法

1.1主要材料：改良1640培養(yǎng)基（賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司）、小牛血清（gibco，新西蘭）、二甲基亞砜（DMSO，成都市科龍化工試劑廠）、Epilife培養(yǎng)基（gibco，Cascade Biologics）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS，北京中杉金橋）、分離酶（Roche，日本）、胰蛋白酶、噻唑藍(lán)（MTT，重慶索萊寶）、5氨基酮戊酸（北京英發(fā)康美）、ELISA試劑盒（上海依科賽生物制品有限公司）；LED IA光動(dòng)力治療儀（武漢亞格光技術(shù)有限公司）。

1.2HaCaT細(xì)胞的分離培養(yǎng)和傳代：HaCaT細(xì)胞系來源于上海中科院細(xì)胞研究所，由本實(shí)驗(yàn)室凍存?zhèn)鞔Ｓ贸Ｒ?guī)方法復(fù)蘇細(xì)胞后，使用含5%小牛血清的改良1640培養(yǎng)基在37°C二氧化碳培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞增殖至鋪滿80%左右時(shí)，使用胰蛋白酶常溫下消化數(shù)分鐘，小牛血清終止消化，常規(guī)方法傳代。

1.3Kc的分離培養(yǎng)和傳代：皮膚來源于正常男子包皮環(huán)切術(shù)后包皮組織。取全層皮膚用PBS反復(fù)漂洗后，除去脂肪和結(jié)締組織。剪碎皮膚移入分離酶中，4°C過夜后分離表皮，熱消化，1000rpm離心5min，加入Epilife培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞增殖至鋪滿80%左右時(shí)，使用胰蛋白酶冷消化，常規(guī)方法傳代。

1.4實(shí)驗(yàn)分組與實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1HaCaT細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)：接種HaCaT細(xì)胞于3塊24孔板，細(xì)胞密度40000個(gè)/孔，每塊板均設(shè)4個(gè)組，A（ALAOmM，紅光能量21J/cm²），B（ALA 0.01mM，紅光能量21J/cm²），c（ALA0.1mM，紅光能量21J/cm²），D（ALA0.5mM，紅光能量21J/cm²）。各組培養(yǎng)24h后，按分組加入ALA避光孵育30min，633nm紅光照射，分別于0h、24h、48行MTT測(cè)A490值。

1.4.2人角質(zhì)形成細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)：接種角質(zhì)形成細(xì)胞于3塊96孔板，細(xì)胞密度10⁴個(gè)/孔，分組和實(shí)驗(yàn)均同HaCaT細(xì)胞，最后也分別于0h、2411、48h行MTT測(cè)A490值。

1.4.3細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)分組同人角質(zhì)形成細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)，每組培養(yǎng)24h，加入ALA避光孵育30min，633nm紅光照射后，分別于0h、24h、48h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，再按ELISA試劑盒說明書的方法，分別檢測(cè)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（YEW）的濃度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用Excel和CurveExpert1.3軟件進(jìn)行曲線制作和分析，SPSSl9.0軟件作單因素方差分析（P<0.05）。

2.結(jié)果

2.1角質(zhì)形成細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：倒置顯微鏡下觀察可見，表皮細(xì)胞接種24h內(nèi)貼壁，細(xì)胞以圓形為主，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞伸展成橢圓形、不規(guī)則形，體積變大。3d左右可見數(shù)個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞形成的小集落，4周可見衛(wèi)星樣表皮細(xì)胞增殖。1周左右細(xì)胞匯合連接成片。0.5mM ALA-PDT干預(yù)48h后細(xì)胞部分脫離貼壁狀態(tài)；其他濃度劑量的ALA-PDT干預(yù)后與單純紅光照射后相比未有明顯不同。

2.2ALA-PDT對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響：結(jié)果可見，在PDT作用后24h和48h，低劑量AIA（0.1mM和0.01mM）預(yù)處理，PDT能促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的增殖（B、c組），且二者差異不大（P>0.05）；而當(dāng)ALA濃度為0.5mM時(shí)，ALA-PDT明顯抑制細(xì)胞增殖（P<0.05）（D組）（圖1）。

2.2ALA-PDT對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞（Kc）增殖的影響：結(jié)果可見，在ALA-PDT作用后24h和48h，低劑量ALA（0.1mM和0.01mM）預(yù)處理，PDT均能促進(jìn)Kc的增殖（B、c組），且二者無明顯差異（P>0.05）；而當(dāng)ALA濃度為0.5mM時(shí)，ALAPDT抑制細(xì)胞增殖，且48h后抑制作用更明顯（P<0.05）（D組）（圖2）。

2.3ALA-PDT對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌bFGF和VEGF的影響：ELISA檢測(cè)bFGF結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)ALA-PDT作用后24h時(shí)，A、B、c各組bFGF濃度明顯高于D組，而低劑量組（A、B組）的bFGF濃度升高最為明顯。ELISA檢測(cè)VEGF結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)光照后24h，各組VEGF輕度下降；48h后，各組VEGF明顯升高。

3.討論

近年來，光動(dòng)力治療在皮膚科應(yīng)用廣泛，無論是在癌前病變還是腫瘤性疾病都取得一定的療效，尤其是在日光性角化病、Bowens病、增殖性紅斑、基底細(xì)胞癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌等疾病中得到了較好的效果。同時(shí)，光動(dòng)力治療在一些非腫瘤性疾病如痤瘡、尖銳濕疣等也療效顯著，能明顯降低復(fù)發(fā)率。綜合來看，光動(dòng)力治療大部分都應(yīng)用在殺滅細(xì)菌和殺死腫瘤細(xì)胞的方面，其基本原理主要在于：①當(dāng)光敏劑被組織攝取，暴露于適當(dāng)波長(zhǎng)的光，將從基態(tài)激活到激發(fā)態(tài)。激活的光敏劑可以形成自由基，然后與氧氣產(chǎn)生活性氧（ROS）（I型反應(yīng)）；也可以形成單線態(tài)氧（O₂）（II型反應(yīng)）；ROS與O₂的氧化作用可以殺傷細(xì)胞和微生物，而光敏劑聚集越多的地方則殺傷作用愈強(qiáng)；②PDT可以激活多種免疫細(xì)胞和炎性細(xì)胞因子，產(chǎn)生殺傷作用。

目前，大部分的研究和應(yīng)用都基于高劑量的光敏劑和高能量的光照，通過其殺傷作用達(dá)到治療目的。但是最近的一些研究表明，低劑量光動(dòng)力治療其實(shí)有不同的效果，其有抑制炎癥，治療光老化等作用。本文的研究旨在探討低劑量PDT對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，21J/cm²光照條件下，0.5mM ALA預(yù)處理與0.1mM和0.01mM ALA預(yù)處理后的結(jié)果有顯著差異，0.5mM ALA-PDT組抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，而低劑量（0.1mM和O.01raM）ALA-PDT有不同程度的促進(jìn)作用。

我們進(jìn)一步用ELISA檢測(cè)ALA-PDT對(duì)體外培養(yǎng)人角質(zhì)形成細(xì)胞分泌bFGF和VEGF的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①低劑量ALAPDT作用后24h和48h，人角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的bFGF高于高劑量組和單純紅光組；②ALA-PDT干預(yù)后，24h時(shí)，人角質(zhì)形成細(xì)胞分泌VEGF的變化較小，48h時(shí)，各組的VEGF的含量明顯上升，0.1mM和0.5mM組上升更明顯。既往的研究中，Stachon等人。證明了以二氫卟吩E6為光敏劑，637nm紅光（24J/cm²）照射人角膜細(xì)胞24h之后，VEGF有上升的趨勢(shì)，但他們沒有進(jìn)一步研究干預(yù)48h后的變化。也有研究者發(fā)現(xiàn)PDT通過激活c-Jun氨基末端激酶/應(yīng)激活化蛋白激酶通路和p38有絲分裂原激活蛋白酶通路誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)。于是，我們推測(cè)低劑量PDT產(chǎn)生的低濃度的ROS，誘導(dǎo)了生物調(diào)節(jié)作用，也許能通過某些信號(hào)途徑（如有絲分裂原激活蛋白酶通路）促進(jìn)bFGF和VEGF的分泌，但是，兩種生長(zhǎng)因子的分泌規(guī)律并不與細(xì)胞增殖完全相同，提示還有其他因素起了重要作用，其中的具體機(jī)制和涉及的信號(hào)通路有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)闡明。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)高劑量ALA-PDT抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，低劑量ALA-PDT則有利于其增殖，并且能促進(jìn)其分泌bFGF和VEGF，但其規(guī)律和具體機(jī)制有待探討。繼續(xù)深入探索低劑量ALA-PDT作用的具體機(jī)制很有必要，對(duì)明確PDT這種全新治療方法在不同條件下的不同生物學(xué)效應(yīng)，并全面了解其作用原理有著重要的意義，更為拓展PDT的適應(yīng)癥奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。