轉(zhuǎn)地蜂群病原微生物及腸道共生菌的變化

劉珊，王劉豪，郭軍,2，李繼蓮，徐龍龍

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轉(zhuǎn)地蜂群病原微生物及腸道共生菌的變化

劉珊1，王劉豪1，郭軍1,2，李繼蓮1，徐龍龍1

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所農(nóng)業(yè)部授粉昆蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100093；2昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500）

【目的】探明轉(zhuǎn)地放蜂過程中常見蜜蜂病毒和寄生蟲的流行規(guī)律，及不同地區(qū)工蜂腸道中兩種主要共生菌和的變化情況?！痉椒ā?在轉(zhuǎn)地放蜂過程中，對(duì)同一意大利蜜蜂()蜂場(chǎng)的固定蜂群連續(xù)取樣，采用RT-PCR方法檢測(cè)蜂群中病毒和寄生蟲的感染情況，使用SPSS 17.0軟件對(duì)不同地區(qū)、不同季節(jié)樣本的病毒和寄生蟲感染率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。以蜜蜂為內(nèi)參基因，對(duì)不同地區(qū)樣本中的共生菌和進(jìn)行熒光定量PCR分析，檢測(cè)轉(zhuǎn)地過程中工蜂腸道中這兩種細(xì)菌的變化情況，并采用Kendall Rank相關(guān)系數(shù)對(duì)病原物感染率和共生菌含量進(jìn)行相關(guān)性分析?！窘Y(jié)果】 轉(zhuǎn)地放蜂7個(gè)地區(qū)的樣本中，僅檢測(cè)出以色列急性麻痹病毒（IAPV）、黑蜂王臺(tái)病毒（BQCV）和蜜蜂殘翅病毒（DWV）3種蜜蜂病毒。其中IAPV和BQCV在所有地區(qū)均有檢出且感染率較高，不同地區(qū)之間感染率差異顯著；DWV感染率相對(duì)較低，不同地區(qū)之間感染率差異極顯著。西方蜜蜂微孢子蟲（）在各地區(qū)樣本中均未檢出，東方蜜蜂微孢子蟲（）在4個(gè)地區(qū)的樣本中檢出，且不同地區(qū)間感染率差異極顯著，熊蜂微孢子蟲（）在各個(gè)地區(qū)均有檢出，不同地區(qū)間感染率差異顯著；季節(jié)性差異分析表明，IAPV在不同季節(jié)的感染率差異不顯著，而BQCV、DWV、和在不同季節(jié)的感染率差異顯著，且春夏季的感染率普遍高于秋冬季；不同轉(zhuǎn)地地區(qū)的工蜂腸道內(nèi)均含有共生菌和, 且兩種共生菌含量在不同地區(qū)間均差異極顯著；相關(guān)性分析表明，和IAPV之間呈顯著負(fù)相關(guān)作用?！窘Y(jié)論】轉(zhuǎn)地蜂場(chǎng)工蜂病原微生物的檢測(cè)結(jié)果表明IAPV、BQCV、DWV和微孢子蟲在蜂群中普遍存在；蜜蜂病原物的感染率和腸道共生菌的含量在不同地理區(qū)域間差異顯著；部分病原物與腸道共生菌間呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；轉(zhuǎn)地放蜂方式對(duì)蜜蜂的健康狀況有一定影響。

轉(zhuǎn)地放蜂；意大利蜜蜂；病原微生物；共生菌；熒光定量PCR

0 引言

【研究意義】蜜蜂轉(zhuǎn)地飼養(yǎng)是一種流動(dòng)型的養(yǎng)蜂方式。中國地域遼闊，蜜粉源植物豐富，不同季節(jié)花期交錯(cuò)，養(yǎng)蜂人員為了充分利用各地蜜粉源植物繁殖蜂群，擴(kuò)大養(yǎng)蜂生產(chǎn)，增加蜂產(chǎn)品產(chǎn)量，每年都會(huì)進(jìn)行轉(zhuǎn)地放蜂飼養(yǎng)[1]。中國是世界上最大的養(yǎng)蜂國之一，200萬群東方蜜蜂飼養(yǎng)量和600萬群的西方蜜蜂飼養(yǎng)量均居世界首位，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2]。轉(zhuǎn)地養(yǎng)蜂是中國主要的養(yǎng)蜂方式之一，但有研究表明，轉(zhuǎn)地養(yǎng)蜂會(huì)影響蜜蜂的健康[3]，其中蜜蜂病毒和寄生蟲在轉(zhuǎn)地過程中的廣泛傳播是主要影響因素之一[3-4]。另一方面，蜜蜂腸道內(nèi)有著數(shù)量眾多的共生菌群，它們?cè)跔I養(yǎng)吸收、抵抗病原物侵染、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面均發(fā)揮著積極作用[5-7]。因此，探究轉(zhuǎn)地養(yǎng)蜂過程中蜜蜂病原微生物與腸道共生菌群的變化，對(duì)于蜜蜂疾病的防控以及養(yǎng)蜂業(yè)的發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蜜蜂病毒傳播廣泛，可以感染不同生長階段和不同級(jí)型的蜜蜂，且在蜂箱、蜂糧及蜜蜂寄生蟲體內(nèi)都可檢測(cè)到[8-11]。但大多數(shù)病毒在蜜蜂表現(xiàn)癥狀之前都存在著隱形感染現(xiàn)象[12-13]，當(dāng)受到特定的外界壓力如寄生蟲感染、周圍環(huán)境變化時(shí)，蜜蜂病毒被激活并快速增殖，表現(xiàn)出強(qiáng)致病性并導(dǎo)致宿主的快速死亡[14]。另一方面，9大類蜜蜂腸道微生物卻與蜂群的健康密切相關(guān)[15]，有研究表明它們和宿主相互協(xié)作從而增加整個(gè)機(jī)體的適應(yīng)性[16]，其中-變形菌綱的和-變形菌綱的是蜜蜂腸道中的優(yōu)勢(shì)菌，占成年工蜂回腸和中腸中菌群總數(shù)的50%以上，為中腸內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群，為回腸中的優(yōu)勢(shì)菌群[17]。此外有關(guān)中國不同地區(qū)蜜蜂病原物及共生菌的研究也有著許多報(bào)道，LI等[18]對(duì)中國19個(gè)?。ㄊ小⒌貐^(qū)）的中華蜜蜂（）病原物感染和共生菌的數(shù)量變化情況進(jìn)行了詳細(xì)報(bào)道；AI等[19]對(duì)中國18個(gè)?。ㄊ?、地區(qū)）的意大利蜜蜂（）蜂場(chǎng)常見7種蜜蜂病毒感染情況進(jìn)行調(diào)查；YANG等[20]對(duì)中國7個(gè)?。ㄊ?、地區(qū)）的意大利蜜蜂蜂場(chǎng)常見10 種病原體的感染率進(jìn)行了系統(tǒng)研究；賈慧茹等[21]對(duì)北京地區(qū)6種蜜蜂病毒的感染情況進(jìn)行普查等，但目前仍缺乏轉(zhuǎn)地蜜蜂飼養(yǎng)流行病學(xué)和共生菌方面的研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來關(guān)于蜜蜂流行病學(xué)的研究大多是從各個(gè)省區(qū)采集大量蜜蜂樣品進(jìn)行檢測(cè)。而對(duì)于轉(zhuǎn)地放蜂的過程中，同一蜂場(chǎng)內(nèi)在不同季節(jié)及不同蜜源條件下，蜜蜂病原微生物流行規(guī)律和共生菌變化情況尚缺乏研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探明轉(zhuǎn)地放蜂過程中常見蜜蜂病毒和寄生蟲的流行規(guī)律，及不同地區(qū)工蜂腸道中兩種主要共生菌和的變化情況及與病原物的相關(guān)性，進(jìn)一步探討轉(zhuǎn)地飼養(yǎng)方式對(duì)蜜蜂健康的影響，為蜜蜂疾病的防治措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

于2015年4—12月的轉(zhuǎn)地放蜂期間，對(duì)同一蜂場(chǎng)的指定蜂群進(jìn)行取樣。試驗(yàn)共選擇7個(gè)采集地區(qū)，采集的蜜源植物和地點(diǎn)分別為油菜（湖北省浠水縣）、洋槐（河北省靈壽縣）、椴樹（吉林省延邊縣）、蕎麥（內(nèi)蒙古赤峰市）、芝麻（河南省新蔡縣）、鹽膚木（湖北省英山縣）和茶樹（湖北省浠水縣），每個(gè)地區(qū)均在固定的6群蜂中取樣，每群取5只工蜂檢測(cè)病毒和微孢子蟲。共采集工蜂樣本210只，且均為活蜂，采樣后裝入含有糖粉的小盒中運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，工蜂樣品取腸道提取DNA，檢測(cè)3種微孢子蟲和2種腸道內(nèi)共生菌，剩下的部分提取RNA，檢測(cè)7種常見蜜蜂病毒。

1.2 DNA的提取及PCR檢測(cè)

剪取每只蜂的腹部并拉取腸道，分別放入不同離心管中，加入100 μL Krebs Ringer solution，使用無菌的研磨棒將腹部研磨成勻漿。每個(gè)樣品取50 μL勻漿，按照DNA提取試盒的操作方法（Wizard ? SV 96 Genomic DNA Purification System，Promega）提取DNA。提取后將DNA用于檢測(cè)東方蜜蜂微孢子蟲（）、西方蜜蜂微孢子蟲（）和熊蜂微孢子蟲（），引物如表1所示。PCR反應(yīng)體系：500 ng模板DNA，12.5 μL Mix，10 mmol·L-1正反向引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃4 min，然后94℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃ 10 min。每次PCR均做陰性（ddH2O）和陽性對(duì)照。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，染色后觀測(cè)結(jié)果。部分目的條帶使用瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒（Takara，Japan）回收PCR產(chǎn)物，送至公司測(cè)序以驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果。

表1 本試驗(yàn)采用的PCR引物

1.3 RNA的提取及RT-PCR檢測(cè)

采用Trizol法提取拉取腸道后剩余部分蜜蜂樣本的總RNA，并對(duì)采集的所有樣品進(jìn)行蜜蜂病毒RT-PCR檢測(cè)。選擇7種常見病毒蜜蜂急性麻痹病毒（ABPV）、黑蜂王臺(tái)病毒（BQCV）、蜜蜂慢性麻痹病毒（CBPV）、蜜蜂殘翅病毒（DWV）、克什米爾蜜蜂病毒（KBV）、蜜蜂以色列急性麻痹病毒（IAPV）和囊狀幼蟲病病毒（SBV）。將提取好的RNA取1 μg，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，Japan）合成cDNA。將合成的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，病毒引物參考文獻(xiàn)（表1）。PCR反應(yīng)體系：Mix 12.5 μL，正向和反向引物（10 μmol·L-1）各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR條件：反轉(zhuǎn)錄48℃ 45 min，95℃ 2 min，然后95℃ 30 s，55℃ 1 min，68℃ 2 min，共40個(gè)循環(huán)，68℃ 7 min。每次RT-PCR均做陰性（ddH2O）和陽性對(duì)照。PCR產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳，染色后在紫外燈下觀測(cè)結(jié)果。使用瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒（TaKara，Japan）回收PCR產(chǎn)物，送至公司測(cè)序。

1.4 腸道細(xì)菌的熒光定量PCR檢測(cè)

將上述提取的DNA樣品進(jìn)行分組，每個(gè)地區(qū)的樣品分為一組，每組取5只工蜂作為生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行檢測(cè)。使用SYBR Green染料進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，對(duì)不同地區(qū)工蜂樣本中的共生菌和的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。qPCR擴(kuò)增使用Mx3005P real-time PCR系統(tǒng)（Stratagene，La Jolla，CA）。為確保擴(kuò)增效率，使用蜜蜂為內(nèi)參基因。、和的引物如表1所示。 qPCR反應(yīng)條件：95℃3 min，然后95℃30 s，55℃ 30 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)，隨后進(jìn)行熔解曲線分析：55—95℃，0.5℃/read 1 s hold。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。對(duì)陽性結(jié)果進(jìn)行目的片段的回收并測(cè)序，測(cè)得的序列在NCBI上進(jìn)行對(duì)比。不同表達(dá)水平的細(xì)菌基因和使用循環(huán)數(shù)的閾值（Ct值）來衡量。每個(gè)樣品作3個(gè)復(fù)孔以減少試驗(yàn)誤差。目的基因表達(dá)水平用ΔΔCt法計(jì)算：目的基因的相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt，ΔΔCt= (Ct/target gene-Ct/actin) test group-(Ct/target gene-Ct/ actin)control，以表達(dá)量最低的樣品作為參照進(jìn)行計(jì)算，柱狀圖結(jié)果均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。首先對(duì)檢測(cè)出病毒和寄生蟲的樣品，根據(jù)感染病原種類進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，算出每個(gè)地區(qū)每種蜜蜂病毒和寄生蟲的感染率；再通過卡方檢驗(yàn)，比較每種病原物在不同地區(qū)間、不同季節(jié)間感染率的差異；采用Kendall Rank相關(guān)系數(shù)，分析每個(gè)地區(qū)樣本中IAPV、BQCV和DWV的感染率與腸道共生菌數(shù)量的相關(guān)性；采用ANOVA方差分析的方法對(duì)不同地區(qū)之間工蜂腸道菌表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)地蜂群病毒感染情況

從轉(zhuǎn)地放蜂經(jīng)過的7個(gè)地區(qū)共采集210只蜜蜂工蜂，檢測(cè)7種常見蜜蜂病毒，結(jié)果如表2所示。在工蜂樣本中僅檢測(cè)出IAPV、BQCV和DWV。IAPV在所有地區(qū)都有檢出，其中河南省新蔡縣感染率最高，達(dá)97%；在吉林省延邊州感染率最低，為60%；不同地區(qū)之間IAPV的感染率差異顯著（2=14.5，=0.02）。BQCV在所有地區(qū)也均有檢出，其中吉林省延邊州感染率最高，達(dá)到77%；河北省靈壽縣感染率最低，為10%；不同地區(qū)間BQCV的感染率差異極顯著（2=43.1,=0.0001）。DWV的感染率相對(duì)較低，在7個(gè)地區(qū)中有5個(gè)地區(qū)檢出，在吉林省延邊州和內(nèi)蒙古區(qū)赤峰市的感染率最高，為30%，不同地區(qū)間DWV的感染率差異極顯著（2=24.541，=0.001）。

表2 意大利蜜蜂蜂群樣本的采集情況及病原微生物的感染率

IAPV：蜜蜂以色列急性麻痹病毒；BQCV：黑蜂王臺(tái)病毒；DWV：蜜蜂殘翅病毒；：東方蜜蜂微孢子蟲；：熊蜂微孢子蟲

A：湖北省浠水縣Xishui, Hubei；B：河北省靈壽縣Lingshou, Hebei；C：吉林省延邊州Yanbian, Jilin；D：內(nèi)蒙古赤峰市Chifeng, Inner Mongolia；E：河南省新蔡縣Xincai, Henan；F：湖北省英山縣Yingshan, Hubei；G：湖北省浠水縣Xishui, Hubei。圖中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，柱形圖上不同字母表示基因表達(dá)差異顯著（P＜0.05）Each value represented mean±SE, and different letters above bars indicated significant differences (P＜0.05)

2.2 轉(zhuǎn)地蜂群寄生蟲感染情況

西方蜜蜂微孢子蟲在各樣本中均未檢出；東方蜜蜂微孢子蟲在4個(gè)地區(qū)存在感染情況，感染率為23%—57%，湖北省浠水縣感染率最高，吉林省延邊州感染率最低，不同地區(qū)間感染率差異極顯著（2=54.115，=0.0001）；熊蜂微孢子蟲在各個(gè)地區(qū)均有檢出，其中湖北省浠水縣感染率最高，為70%；吉林和內(nèi)蒙感染率最低，為27%?？ǚ綑z驗(yàn)分析表明不同地區(qū)間熊蜂微孢子蟲感染率差異顯著（2=16.44，=0.012）（表2）。

2.3 轉(zhuǎn)地蜂群病原微生物季節(jié)性變化

將取樣時(shí)間按季節(jié)進(jìn)行分類，4—5月為春季，7—8月為夏季，9—10月為秋季，12月為冬季。對(duì)每個(gè)季節(jié)取的樣品中病原物的感染率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，結(jié)果表明蜜蜂病毒IAPV在不同季節(jié)的感染率差異不顯著（2=2.236，=0.525），而BQCV、DWV在不同季節(jié)間的感染率差異極顯著（χ2=20.681，P=0.0001；χ2=21.176，P=0.0001）。在寄生蟲方面，熊蜂微孢子蟲和東方蜜蜂微孢子蟲在不同季節(jié)的感染率差異極顯著（χ2=12.597，P=0.006；χ2=62.286，P=0.0001）。

2.4 轉(zhuǎn)地蜂群腸道內(nèi)共生菌的檢測(cè)與相關(guān)性分析

對(duì)不同地區(qū)蜂群的腸道菌和進(jìn)行檢測(cè)和表達(dá)量測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。在7個(gè)地區(qū)工蜂腸道中均含有共生菌和。方差分析結(jié)果表明，的含量在湖北省英山縣最多，在內(nèi)蒙古區(qū)赤峰市最少，不同地區(qū)間數(shù)量差異極顯著（=0.0001）。的含量在湖北省英山縣最多，在河南省新蔡縣最少，且不同地區(qū)間數(shù)量差異也為極顯著（=0.004）。從兩種共生菌的含量來看，湖北省英山縣兩種共生菌的含量均最多，而河南省新蔡縣與內(nèi)蒙古區(qū)赤峰市兩種共生菌的含量均較少，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明工蜂體內(nèi)兩種共生菌的總數(shù)在不同地區(qū)間存在極顯著差異（=0.0001）。此外，對(duì)不同地區(qū)樣本的病原物感染率和共生菌含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示共生菌的含量和IAPV的感染率呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（Kendall’s tau rank：=0.878，=0.006）。

3 討論

本試驗(yàn)研究了在轉(zhuǎn)地放蜂過程中不同地域和不同蜜源植物條件下，同一意蜂蜂場(chǎng)主要病原物的感染率和部分腸道共生菌的變化情況，結(jié)果表明不同病毒和寄生蟲的感染率在不同地區(qū)差異顯著，這可能是季節(jié)、蜜源植物、溫濕度和地理位置綜合作用的結(jié)果。在7種常見蜜蜂病毒中，僅檢測(cè)出IAPV、BQCV和DWV這3種病毒，其中IAPV的檢出率較高，為60%—97%，Cox-Foster等[33]研究表明，IAPV與蜜蜂崩潰綜合癥（CCD）之間有著強(qiáng)烈的相關(guān)性，所以推測(cè)CCD的主要病原可能為IAPV，李志國[34]研究顯示蜜蜂球囊菌（）是IAPV的載體，而本研究蜂群中IAPV的感染率較高，進(jìn)一步說明了IAPV是危害蜜蜂的主要病毒之一。此外BQCV的檢出率也較高，該病毒通常在蜂群中不表現(xiàn)出癥狀，以一種隱形感染的方式長期存在于蜜蜂體內(nèi)，Ribière等[35]研究表明BQCV與微孢子蟲共感染表現(xiàn)出強(qiáng)烈的致病性，本研究中同樣檢出了微孢子蟲的存在，因此控制蜂群蜜蜂微孢子蟲是減少BQCV感染的主要方式[36]。Shen等[37]研究表明大蜂螨（）是DWV傳播的載體，在本研究中DWV的感染率較低，這可能是由于轉(zhuǎn)地養(yǎng)蜂是在大流蜜期，而這個(gè)時(shí)期也是大蜂螨低流行期[18]；DWV夏季的感染率高于春秋季，可能是因?yàn)橄募緶囟容^高，濕度較大的環(huán)境更有利于DWV的傳播。另外本研究中的轉(zhuǎn)地蜜蜂從河北省浠水縣出發(fā)，經(jīng)過5個(gè)地區(qū)后又回到浠水縣，而結(jié)果表明在此地區(qū)的兩個(gè)不同時(shí)間段內(nèi)，3種病毒的感染率均較高，這說明地理位置和季節(jié)均對(duì)病毒感染率有著較大的影響。

蜜蜂微孢子蟲病是危害西方蜜蜂的主要病原物[38]，其中東方蜜蜂微孢子蟲被認(rèn)為是對(duì)蜜蜂危害最為嚴(yán)重的一種病原[39]。本試驗(yàn)在意蜂樣品中檢出大量東方蜜蜂微孢子蟲，卻沒有檢測(cè)到西方蜜蜂微孢子蟲，這與LI等[18]的研究結(jié)果一致，前期研究表明東方蜜蜂微孢子蟲最初感染東方蜜蜂，目前已取代西方蜜蜂微孢子蟲，在全世界傳播[39]，本研究也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論。東方蜜蜂微孢子蟲在春季的感染率顯著高于秋冬季，在本研究的秋冬季樣本中，沒有檢測(cè)到東方蜜蜂微孢子蟲的存在，這一結(jié)果為東方蜜蜂微孢子蟲不耐低溫，其傳播能力和毒力在寒冷環(huán)境下較低的結(jié)論提供了更有力的證據(jù)[18]。此外，本研究也在意蜂腸道內(nèi)檢測(cè)到了熊蜂微孢子蟲，McIvor等[40]也有過類似報(bào)道，這一現(xiàn)象更進(jìn)一步說明熊蜂微孢子蟲可進(jìn)行跨種侵染。

和是蜜蜂體內(nèi)普遍存在的優(yōu)勢(shì)共生菌，從本研究中兩種共生菌的總數(shù)來看，在湖北省英山縣兩種共生菌的數(shù)量均最多，且與其他地區(qū)差異顯著，這可能是因?yàn)樵诤钡貐^(qū)的蜜源植物鹽膚木與其他地區(qū)相比，蜜、粉更為豐富，為蜂群提供了充足的營養(yǎng)條件。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)共生菌的含量與IAPV的感染率呈顯著負(fù)相關(guān)，LI等[18]發(fā)現(xiàn)感染東方蜜蜂微孢子蟲的中華蜜蜂體內(nèi)共生菌數(shù)量較正常蜂顯著減少，這表明蜜蜂腸道菌群的組成可能影響其對(duì)病原物的敏感性，共生菌屏蔽病原的作用可能是蜜蜂對(duì)抗疾病的一種重要途徑[41]。Koch等[42]的研究結(jié)果也表明這兩種菌具有抵抗短膜蟲的作用，但這兩種菌是否具有抵抗病毒的作用還有待進(jìn)一步研究。

中國是世界第一養(yǎng)蜂大國，轉(zhuǎn)地放蜂是一種特色的蜜蜂飼養(yǎng)形式，可在最大程度上充分利用蜜源植物，產(chǎn)生更高的收益[43]。而轉(zhuǎn)地放蜂主要采用卡車運(yùn)輸，蜂群在運(yùn)輸過程中處于受熱、缺水和振動(dòng)的環(huán)境，且蜂群擺放相對(duì)集中，密度較大，破壞了蜜蜂的正常生活狀態(tài)，因此轉(zhuǎn)地放蜂很可能是蜜蜂疾病發(fā)生和傳播的因素之一。蜜蜂疾病的流行與暴發(fā)會(huì)給養(yǎng)蜂業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此對(duì)轉(zhuǎn)地蜂群蜜蜂疾病進(jìn)行調(diào)查是非常有必要的。本研究通過對(duì)同一蜂場(chǎng)不同時(shí)期的病原微生物流行情況的調(diào)查，進(jìn)一步明確了不同時(shí)期的病毒感染情況，以及共生菌和病原物之間的相關(guān)性。此外，多種因素如氣候、季節(jié)、地域和蜜源植物的不同，都可以對(duì)蜂群健康產(chǎn)生影響。但對(duì)于蜜蜂腸道共生菌的功能和有害病原物的致病機(jī)制，以及蜜蜂是否可以通過調(diào)控腸道菌群來控制病原物感染等問題仍需要進(jìn)行更深入的研究。

4 結(jié)論

轉(zhuǎn)地飼養(yǎng)的意蜂蜂場(chǎng)中，IAPV、BQCV、DWV和東方蜜蜂微孢子蟲、熊蜂微孢子蟲均普遍存在感染現(xiàn)象，蜜蜂病原物的感染率和腸道共生菌的含量在不同放蜂區(qū)域之間差異顯著，且部分蜜蜂病原物與蜜蜂腸道共生菌間呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。轉(zhuǎn)地放蜂飼養(yǎng)行為對(duì)蜜蜂的健康狀況有一定影響。

References

[1] 李易谷. 轉(zhuǎn)地蜂場(chǎng)蜂群損失分析. 蜜蜂雜志, 2013(11): 33.

Li Y G. Analysis on the loss of bee colony., 2013(11): 33. (in Chinese)

[2] 刁青云, 吳杰, 姜秋玲, 謝文聞.中國蜂業(yè)現(xiàn)狀及存在問題. 世界農(nóng)業(yè), 2008(10): 59-61.

Diao Q Y, Wu J, Jiang Q L, Xie W W. Current situation of Chinese apiculture., 2008(10): 59-61. (in Chinese)

[3] Welch A, Drummond F, Tewari S, Averill A, Burand J P. Presence and prevalence of viruses in local and migratory honeybees () in Massachusetts., 2009, 75(24): 7862-7865.

[4] Moritz R F, Pirk C W, Hepburn H R, Neumann P. Short-sighted evolution of virulence in parasitic honeybee workers (Esch.)., 2008, 95(6): 507-513.

[5] Dillon R J, Vennard C T, Buckling A, Charnley A K. Diversity of locust gut bacteria protects against pathogen invasion., 2005, 8(12): 1291-1298.

[6] Fraune S, Bosch T C. Why bacteria matter in animal development and evolution., 2010, 32(7): 571-580.

[7] Engel P, Martinson V G, Moran N A. Functional diversity within the simple gut microbiota of the honey bee., 2012, 109(27): 11002-11007.

[8] Dainat B, Ken T, Berthoud H, Neumann P. The ectoparasitic mite(Acari, Laelapidae) as a vector of honeybee viruses., 2009, 56(1): 40-43.

[9] Eyer M, Chen Y P, Sch?fer M O, Pettis J, Neumann P. Small hive beetle,, as a potential biological vector of honeybee viruses., 2009, 40(4): 419-428.

[10] Boecking O, Genersch E. Varroosis–the ongoing crisis in bee keeping., 2008, 3(2): 221-228.

[11] Sammataro D, Gerson U, Needham G. Parasitic mites of honey bees: life history, implications, and impact., 2000, 45(1): 519-548.

[12] De Miranda J R, Genersch E. Deformed wing virus., 2010, 103: S48-S61.

[13] Hails R S, Ball B V, Genersch E. Infection strategies of insect viruses//European Commission, 2008: 255-276.

[14] Genersch E, Von Der Ohe W, Kaatz H, Schroeder A, Otten C, Büchler R, Berg S, Ritter W, Mühlen W, Gisder S, Meixner M, Liebig G, Rosenkranz P. The German bee monitoring project: a long term study to understand periodically high winter losses of honey bee colonies., 2010, 41(3): 332-352.

[15] Kwong W K, Moran N A. Gut microbial communities of social bees., 2016, 14(6): 374-384.

[16] Hamdi C, Balloi A, Essanaa J, Crotti E, Gonella E, Raddadi N, Ricci I, Boudabous A, Borin S, Manino A, Bandi C, Alma A, Daffonchio D, Cherif A. Gut microbiome dysbiosis and honeybee health., 2011, 135(7): 524-533.

[17] Martinson V G, Moy J, Moran N A. Establishment of characteristic gut bacteria during development of the honeybee worker., 2012, 78(8): 2830-2840.

[18] Li J, Qin H, Wu J, Sadd B M, Wang X, Evans J D, Peng W, Chen Y. The prevalence of parasites and pathogens in Asian honeybeesin China., 2012, 7(11): e47955.

[19] Ai H, Yan X, Han R. Occurrence and prevalence of seven bee viruses inandapiaries in China., 2012, 109(1): 160-164.

[20] Yang B, Peng G, Li T, Kadowaki T. Molecular and phylogenetic characterization of honey bee viruses,, protozoan parasites, and parasitic mites in China., 2013, 3(2): 298-311.

[21] 賈慧茹, 劉進(jìn)祖, 王星, 吳艷艷, 周婷. 北京地區(qū)六種蜜蜂病毒病的流行病學(xué)研究. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào), 2014, 51(3): 772-780.

Jia H R, Liu J Z, Wang X, Wu Y Y, Zhou T. Occurrence and prevalence of six bee viruses in Beijing., 2014, 51(3): 772-780. (in Chinese)

[22] Benjeddou M, Leat N, Allsopp M, Davison S. Detection of acute bee paralysis virus and black queen cell virus from honeybees by reverse transcriptase PCR., 2001, 67(5): 2384-2387.

[23] Ribière M, Triboulot C, Mathieu L, Aurières C, Faucon J P, Pépin M. Molecular diagnosis of chronic bee paralysis virus infection., 2002, 33(3): 339-351.

[24] Chen Y, Smith I B, Collins A M, Pettis J S, Feldlaufer M F. Detection of deformed wing virus infection in honey bees,L., in the United States., 2004, 144(7): 557-559.

[25] Di Prisco G, Pennacchio F, Caprio E, Boncristiani Jr H F, Evans J D, Chen Y.is an effective vector of Israeli acute paralysis virus in the honeybee,., 2011, 92(1): 151-155.

[26] Stoltz D, Shen X R, Boggis C, Sisson G. Molecular diagnosis of Kashmir bee virus infection., 1995, 34(3): 153-160.

[27] Chen Y, Pettis J S, Feldlaufer M F. Detection of multiple viruses in queens of the honey beeL.., 2005, 90(2): 118-121.

[28] Chen Y, Evans J D, Smith I B, Pettis J S.is a long-present and wide-spread microsporidian infection of the European honey bee () in the United States., 2008, 97(2): 186-188.

[29] Chaimanee V, Chen Y, Pettis J S, Cornman R S, Chantawannakul P. Phylogenetic analysis ofisolated from European and Asian honeybees in Northern Thailand., 2011, 107(3): 229-233.

[30] Tay W T, O’MAHONY E M, Paxton R J. Complete rRNA gene sequences reveal that the microsporidiuminfects diverse bumblebee (spp.) hosts and contains multiple polymorphic sites., 2005, 52(6): 505-513.

[31] Chen Y P, Higgins J A, Feldlaufer M F. Quantitative real-time reverse transcription-PCR analysis of deformed wing virus infection in the honeybee (L.)., 2005, 71(1): 436-441.

[32] 徐龍龍, 吳杰, 郭軍, 李繼蓮.共生菌群在熊蜂生長發(fā)育過程中的動(dòng)態(tài)變化. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 47(10): 2030-2037.

Xu L L, Wu J, Guo J, Li J L. Dynamic variation of symbionts in bumblebees during hosts growth and development., 2014, 47(10): 2030-2037. (in Chinese)

[33] Cox-Foster D L, Conlan S, Holmes E C, Palacios G, Evans J D, Moran N A, Quan P L, Briese T, Hornig M, Geiser D M, Martinson V, vanEngelsdorp D, Kalkstein A L, Drysdale A, Hui J, Zhai J H, Cui L W, Hutchison S K, Simons J F, Egholm M, Pettis J S, Lipkin W I. A metagenomic survey of microbes in honey bee colony collapse disorder., 2007, 318(5848): 283-287.

[34] 李志國. 蜜蜂以色列急性麻痹病毒的分子檢測(cè)、流行傳播及其對(duì)蜜蜂行為的影響[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2014.

Li Z G. Molecular detection, prevalence and transmission of Israeli acute paralysis virus and its effects on honey bee behaviors[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2014. (in Chinese)

[35] Ribière M, Ball B, Aubert M. Natural history and geographical distribution of honey bee viruses//. European Commission, 2008: 15-84.

[36] Allen M, Ball B. The incidence and world distribution of honey bee viruses., 1996, 77(3): 141-162.

[37] Shen M, Yang X, Cox-Foster D, Cui L. The role of varroa mites in infections of Kashmir bee virus (KBV) and deformed wing virus (DWV) in honey bees., 2005, 342(1): 141-149.

[38] Botías C, Martín-Hernández R, Garrido-Bailón E, González-Porto A, Martínez-Salvador A, De La Rúa P, Meana A, Higes M. The growing prevalence ofin honey bees in Spain, an emerging problem for the last decade., 2012, 93(1): 150-155.

[39] Maiolino P, Iafigliola L, Rinaldi L, De Leva G, Restucci B, Martano M. Histopathological findings of the midgut in European honey bee (L.) naturally infected byspp., 2014, 2(1): Article 4.

[40] McIvor C A, Malone L A., a microsporidian pathogen of the bumble bee(L.)., 1995, 22(1): 25-31.

[41] 郭軍. 蜜蜂腸道菌群多樣性及其影響因素研究[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2015.

Guo J. Diversity and influencing factors of gut microbiota in honey bees[D]. Beijing: Chinese academy of agricultural sciences, 2015. (in Chinese)

[42] Koch H, Cisarovsky G, Schmid-Hempel P. Ecological effects on gut bacterial communities in wild bumblebee colonies., 2012, 81(6): 1202-1210.

[43] 吳杰. 蜜蜂學(xué). 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2012.

Wu J.. Beijing: China Agriculture Press, 2012. (in Chinese)

（責(zé)任編輯 岳梅）

The variation of Pathogens, Parasites and symbionts in Migratory honeybees ()

LIU Shan1, WANG LiuHao1, GUO Jun1,2, LI JiLian1, XU LongLong1

(1Key Laboratory of Pollinating Insect Biology of the Ministry of Agriculture, Institute of Apicultural Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093;2College of Life Science, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500)

【Objective】The objectives of this study are to examine the occurrence and prevalence of viruses and parasites in migratory honeybees,, and to analyze the variation of two main symbiotic bacteriaand【Method】The virus and parasite infections were detected by RT-PCR in the same colony ofat different migratory locations. Theinfection rate of virus and parasite in different regions and seasons were analyzed by chi-square test. The honey bee-actin gene was selected as the reference gene, the quantitative real-time PCR (qPCR) was used to explore the quantity variation of symbiotic bacteriaandin the different regions, and the Kendall Rank correlation coefficient was used to analyze the correlation between the rate of pathogen infection and the quantity of symbiotic bacteria.【Result】In the seven regions, three viruses were found:(IAPV),(BQCV), and(DWV). The infection rates of IAPV and BQCV were higher in all regions, and the difference was significant among different regions. DWV infection rate was relatively low, and the infection rate among different regions was extremely significant.was not detected in all the samples.was detected in four regions and the infection rate was extremely significant among different regions.was detected in all regions and the infection rate among different regions was significant. The results showed that the infection rates of IAPVwas not significantly different in different seasons, but the DWV, BQCV,andinfection rates had significant differences in different seasons, and the infection rate in spring and summer was significantly higher than that in autumn and winter. The qPCR result showed that.and.were detected in all migratory beekeeping periods, and the difference of the two symbiotic bacteria in different regions was extremely significant. There was a significant negative correlation between the prevalence ofand IAPV. 【Conclusion】The results showed that IAPV, BQCV, DWV and microsporidia are prevalent in the migratory colonies. The infection rate of bee pathogens and the quantity of symbiotic bacteria are significantly different among different geographical areas; there are negative correlations between the incidence of some pathogens and the quantity of some symbiotic bacteria; migratory beekeeping has negative impacts on worker longevity and colony health.

migratory beekeeping;; pathogens; symbiotic bacteria; quantitative PCR

2016-10-19；接受日期：2016-11-28

國家自然科學(xué)基金（31572338）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CAAS-ASTIP-2016-IAR）、國家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-45）、農(nóng)業(yè)部“948”項(xiàng)目（2015-Z9）

劉珊，E-mail：molige63@163.com。 通信作者李繼蓮，E-mail：bumblebeelil@hotmail.com