16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)篩選牦牛瘤胃細(xì)菌基因組 DNA提取方法及菌群結(jié)構(gòu)

楊琦玥，黃勇，陳亞冰，劉洛川，李鍵，蘭道亮

?

16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)篩選牦牛瘤胃細(xì)菌基因組 DNA提取方法及菌群結(jié)構(gòu)

楊琦玥1，黃勇1，陳亞冰1，劉洛川1，李鍵2，蘭道亮2

（1西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041）

【目的】確定理想的牦牛瘤胃細(xì)菌基因組DNA提取方法及初步分析牦牛瘤胃細(xì)菌的群體結(jié)構(gòu)?！痉椒ā坎捎梦锢矸ǎㄖ槟シā⒎磸?fù)凍融法）、化學(xué)法（CTAB、SDS）及酶解法(溶菌酶、蛋白酶K)三者與瘤胃細(xì)菌特點(diǎn)相結(jié)合的方法，組合生成9種不同方法，即方法1（CTAB+SDS+Lysozyme+無特殊物理處理法）、方法2（CTAB+ SDS+Lysozyme+反復(fù)凍融法）、方法3（CTAB+SDS+Lysozyme+珠磨法）、方法4（CTAB+Lysozyme+無特殊物理處理法）、方法5（CTAB+Lysozyme+反復(fù)凍融法）、方法6（CTAB+Lysozyme+珠磨法）、方法7（SDS+Lysozyme+無特殊物理處理法）、方法8（SDS+Lysozyme+反復(fù)凍融法）、方法9（SDS+Lysozyme+珠磨法），同時(shí)以QIA amp DNA Stool Mini Kit（方法10）為對(duì)照，以這10種方法來提取瘤胃微生物基因組DNA，并通過DNA濃度、純度、DNA電泳圖等基本性質(zhì)及16S rRNA高通量測(cè)序結(jié)果對(duì)其進(jìn)行分析比較，同時(shí)通過測(cè)序結(jié)果初步分析牦牛瘤胃細(xì)菌群體結(jié)構(gòu)?！窘Y(jié)果】不同DNA提取方法效率比對(duì)結(jié)果顯示，同樣的化學(xué)及生物酶裂解條件下，結(jié)合珠磨法及反復(fù)凍融法能夠顯著地增強(qiáng)細(xì)胞裂解效率，提高DNA產(chǎn)量。其中方法3及方法6提取的DNA具有較高的濃度及純度，方法7—10缺乏CTAB陽離子去污劑，提取的DNA量顯著低于其他方法（<0.05），除方法2和8所提取的樣品經(jīng)多次試驗(yàn) ，PCR 產(chǎn)物目的條帶太弱或未檢測(cè)到外，其余8種方法提取的樣品PCR 產(chǎn)物目的條帶大小正確，濃度合適，符合高通量測(cè)序的要求。16S rRNA高通量測(cè)序共生成了191 349條原始數(shù)據(jù)，質(zhì)控后得到有效序列171 231條。稀釋性曲線分析表明，數(shù)據(jù)量合理并達(dá)到飽和，能夠完整反映樣品的菌群種類。OTU聚類數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、分類學(xué)和多樣性指數(shù)分析顯示方法6和10包含的細(xì)菌較豐富。不同提取方法對(duì)革蘭氏陽性菌提取效果比對(duì)結(jié)果表明方法6裂解革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的能力比其他方法相對(duì)較高。綜上，方法6（CTAB-Lysozyme-珠磨）提取的DNA產(chǎn)量、樣品多樣性指數(shù)及革蘭氏陽性菌破壁能力均優(yōu)于其他方法。菌群結(jié)構(gòu)分析表明牦牛瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)包括21門、35綱、75科、112屬，豐度較高的菌群依次是擬桿菌(64%)、厚壁菌（20%）、螺旋體（2.3%）和變形菌（1.8%），纖維桿菌(1.7%)。牦牛瘤胃細(xì)菌群體結(jié)構(gòu)與黃牛相比存在著一定的差異，這可能歸因于飲食及環(huán)境的不同?！窘Y(jié)論】利用16S rRNA高通量測(cè)序篩選出了牦牛瘤胃細(xì)菌基因組DNA理想提取方法，即方法6（CTAB-Lysozyme-珠磨），并初步分析了牦牛瘤胃細(xì)菌群體結(jié)構(gòu)，為研究牦牛瘤胃微生物群體特殊性及挖掘牦牛體內(nèi)的基因資源奠定了基礎(chǔ)。

牦牛；瘤胃微生物；DNA；提取方法；菌群結(jié)構(gòu)

0 引言

【研究意義】牦牛作為青藏高原地區(qū)特有的反芻動(dòng)物，對(duì)高海拔、低氧、低溫等惡劣生活環(huán)境具有良好適應(yīng)能力，能夠?yàn)楫?dāng)?shù)啬撩裉峁┤椤⑷?、皮毛及燃料等不可或缺的生產(chǎn)生活資料[1]，是高原畜牧業(yè)最重要的畜種。作為反芻動(dòng)物，牦牛能夠進(jìn)行反芻再次咀嚼飼草并通過瘤胃內(nèi)微生物菌群發(fā)酵，將難以消化的纖維素轉(zhuǎn)化為可以被小腸吸收的蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、酸類和脂類等[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)棲息著大量微生物，這些微生物在動(dòng)物胃腸道中扮演著重要角色[4]。青藏高原作為全球?yàn)閿?shù)不多的未受大規(guī)模環(huán)境污染的地方之一，生態(tài)環(huán)境仍處于比較原始的狀態(tài)。高原牧區(qū)由于畜牧醫(yī)療技術(shù)的相對(duì)落后及抗生素等藥物的慎用，保證了牦牛瘤胃中的微生物群落是較接近于原始狀態(tài)，未受到人為干擾的。因此，牦牛是研究瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)的理想模式動(dòng)物?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展及成熟，該技術(shù)在探究及鑒定環(huán)境微生物群落中也得到了廣泛的應(yīng)用，這種方法突破了微生物分離培養(yǎng)的限制，能夠全面分析自然界的微生物類群及充分挖掘基因資源[5-8]。然而，對(duì)于這種基于核酸的分子生物學(xué)技術(shù)，DNA提取質(zhì)量的好壞會(huì)直接影響到微生物群落結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果[9-16]。在現(xiàn)有的研究中，李旦等[17]對(duì)瘤胃微生物總DNA提取方法進(jìn)行了比較，但其所提取DNA能否用于高通量測(cè)序并未得到驗(yàn)證。劉薇等[18-19]對(duì)奶牛瘤胃微生物總DNA的提取方法進(jìn)行了研究與優(yōu)化，徐文華等[20]對(duì)秦川牛瘤胃微生物DNA提取方法進(jìn)行了比較。然而關(guān)于牦牛瘤胃微生物的提取方法尚未見相關(guān)報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由于采食環(huán)境的特殊性，與規(guī)模舍飼養(yǎng)殖的牛群相比，牦牛瘤胃內(nèi)往往含有大量的腐殖質(zhì)和泥沙，這些物質(zhì)會(huì)對(duì)DNA提取產(chǎn)生影響并增加基因組提取的難度?！緮M解決的關(guān)鍵問題】因此探索一套適用于牦牛瘤胃內(nèi)容物宏基因組的提取方法對(duì)于牦牛瘤胃微生物群落的鑒定具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

NaCl、KH2PO4、Na2HPO4、KCl、CTAB、SDS及溶菌酶均購自德國(guó)Sigma公司；氯仿、苯酚、異戊醇、異丙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純；QIA amp DNA Stool Mini Kit 購于德國(guó)QIAGEN公司；λ-HindⅢ digested Marker及PCR Taq酶購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 瘤胃內(nèi)容物的采集與處理

牦牛選自海拔3 700 m左右的阿壩州紅原縣（北緯N32°47′35.50″，東經(jīng)E102°32′34.32″）。所選牦牛均為檢驗(yàn)檢疫合格及未飼喂任何精飼料和抗生素的4歲左右公牦牛。于2014年9月在紅原縣高原屠宰場(chǎng)，在目標(biāo)牦牛剛屠宰后取出的瘤胃背部切開一小口，手戴一次性無菌手套，持滅菌的50 mL離心管，探入瘤胃內(nèi)容物中部，打開離心管蓋，隨機(jī)取瘤胃內(nèi)容物裝入離心管，取樣過程中可攪動(dòng)瘤胃內(nèi)容物使樣品更均勻，離心管充滿后立刻蓋嚴(yán)，并迅速取出，做好標(biāo)記和記錄，立即投入干冰中凍存，及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室于-80℃冰箱中保存。

1.3 瘤胃細(xì)菌菌體獲得

向3 g牦牛瘤胃樣品（3頭牦牛瘤胃內(nèi)容物混合物）中加入10 mL經(jīng)4℃預(yù)冷PBS緩沖液，待樣品融化后渦旋振蕩1 min，4℃、1 000 r/min離心5 min，吸取上清液；樣品重復(fù)洗滌3次；將4次所得上清液于4℃、12 000 r/min離心10 min，棄掉離心管上層清液，向每管底部沉淀各加入1.7 mL TE緩沖液，混勻后吸取液體至同一10 mL滅菌離心管中，充分震蕩混勻，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 瘤胃細(xì)菌基因組DNA提取

瘤胃微生物DNA的提取最關(guān)鍵的是如何有效地裂解細(xì)胞，本試驗(yàn)結(jié)合了瘤胃的特點(diǎn)及目前常用的裂解方法，具體為兩種物理方法：珠磨法（bead-beating）、反復(fù)凍融法（freeze-thaw）；兩種化學(xué)方法：表面活性劑十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）提取液、溴化十六烷甲基銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）提取液，兩種酶解法：溶菌酶（lysozyme）、蛋白酶K（proteinase K）；組合生成了9種不同的瘤胃樣品DNA提取方法（表1），即方法1（CTAB+SDS+Lysozyme+無特殊物理處理法）、方法2（CTAB+SDS+Lysozyme+反復(fù)凍融法）、方法3（CTAB+SDS+Lysozyme+珠磨法）、方法4（CTAB+ Lysozyme+無特殊物理處理法）、方法5（CTAB+ Lysozyme+反復(fù)凍融法）、方法6（CTAB+Lysozyme+珠磨法）、方法7（SDS+Lysozyme+無特殊物理處理法）、方法8（SDS+Lysozyme+反復(fù)凍融法）、方法9（SDS+Lysozyme+珠磨法）。同時(shí)以QIA amp DNA Stool Mini Kit（方法10）為對(duì)照，來比較它們的DNA提取效率，每種方法均取樣品600 μL（方法10按說明書進(jìn)行提?。蟹椒ň?jīng)過蛋白酶K處理。每種方法進(jìn)行3次重復(fù)。

樣品經(jīng)上述各方法處理后，分別加入溶菌酶3 mg，混勻后于37℃孵育1 h；加入等體積氯仿：異戊醇（24﹕1），抽提2次，4℃、12 000 r/min離心10 min；收集上清液，加入等體積苯酚﹕氯仿﹕異戊醇（25﹕24﹕1）混勻，4℃、12 000 r/min離心3 min ；吸取上清液，加入等體積異丙醇，室溫放置10 min，12 000 r/min離心10 min。棄上清，沉淀加入70%冰乙醇洗滌2次，自然干燥。加入50 μL DEPC水，-20℃保存。

表1 基因組DNA提取方法匯總表

a細(xì)胞懸液經(jīng)5% CTAB（w/v）溶液處理；b細(xì)胞懸液經(jīng)1%SDS（w/v）溶液處理；c細(xì)胞懸液經(jīng) 0.3 mg·mL-1Proteinase K 處理；d細(xì)胞懸液經(jīng) 0.3 mg·mL-1Lysozyme處理

a5% CTAB(w/v) is added to cell suspension;b1%SDS(w/v) is added to cell suspension;c0.3 mg·mL-1Proteinase K is added to cell suspension;d0.3 mg·mL-1Lysozyme is added to cell suspension

1.5 DNA濃度、純度及片段完整性測(cè)定

采用分度光度計(jì)對(duì)提取的DNA溶液純度、濃度進(jìn)行檢查，以0.8%瓊脂糖凝膠電泳，λDNA作為Marker，電壓為150V，電泳時(shí)間為45 min，對(duì)提取的DNA片段完整性進(jìn)行檢查。

1.6 16S rRNA PCR擴(kuò)增

將每種方法的3個(gè)樣品混合形成1個(gè)DNA pool后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。合成細(xì)菌V3到V4區(qū)帶有barcode的16S rRNA 基因特異性引物：338F（5′-ACTCCT ACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3′）。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)送至深圳華大基因研究院（BGI）進(jìn)行16S rRNA高通量測(cè)序。

1.7 16S rRNA高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)處理

基于Illumina MiSeq PE300(Illumina, USA)測(cè)序平臺(tái)，在保證上樣濃度一致，測(cè)序量相同的基礎(chǔ)上，對(duì)牦牛瘤胃細(xì)菌基因組進(jìn)行16S rRNA高通量測(cè)序。Miseq測(cè)序得到的raw reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾。序列過濾后，將那些具有高度相似性（97%）的序列歸為一個(gè)OTU（Operational Taxonomic Unit），運(yùn)用blast比對(duì)程序在RDP（Ribosomal Database Project）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種分類學(xué)分析。根據(jù)以上分類學(xué)信息，估算出樣品稀釋性曲線（Rarefaction curves）[21-22]、Ace、Chao[22]菌群豐度指數(shù)及Shannon、Simpson[23]菌群多樣性指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 不同DNA提取方法效率比對(duì)

表2是采用不同提取方法得到的牦牛瘤胃細(xì)菌基因組DNA的產(chǎn)量和純度的結(jié)果。結(jié)果表明，方法3及方法6提取的DNA具有較高的濃度及純度，方法7—10缺乏CTAB陽離子去污劑，提取的DNA量顯著低于其他方法（＜0.05）。另外，同樣的化學(xué)及生物酶裂解條件下，結(jié)合珠磨法及反復(fù)凍融法能夠顯著地增強(qiáng)細(xì)胞裂解效率，提高DNA產(chǎn)量。表3可見優(yōu)質(zhì)序列的長(zhǎng)度分布集中于301—400bp，達(dá)到99.48%的比例。從圖1可以看出，DNA產(chǎn)物在23 130 bp左右出現(xiàn)一條較亮條帶，證明提取DNA產(chǎn)物較完整。另外，方法3及方法6的DNA產(chǎn)物的條帶較亮，證明回收的DNA產(chǎn)物濃度較大。16S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，方法2和8所提取的樣品經(jīng)多次試驗(yàn)，PCR產(chǎn)物目的條帶太弱或未檢測(cè)到。其余8種方法提取的樣品PCR產(chǎn)物目的條帶大小正確，濃度合適，符合高通量測(cè)序的要求。

表2 不同提取方法DNA產(chǎn)量及純度

表3 優(yōu)質(zhì)序列的長(zhǎng)度分布

M：λ－HindⅢ digested Marker；1-10：樣品DNA DNA of samples

2.2 16S rRNA高通量測(cè)序

由于高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)DNA產(chǎn)量、純度及片段完整性的要求限制，方法2及方法8不能夠成功地進(jìn)行高通量測(cè)序分析。其余8個(gè)方法中，高通量擴(kuò)增分析大約生成了191 349條原始數(shù)據(jù)。質(zhì)控過濾及去雜后，并根據(jù)序列末端的box序列校正序列方向，然后按照barcode標(biāo)簽序列識(shí)別并區(qū)分樣品得到有效序列171 231條（表4）。可以看出各方法原始測(cè)序序列結(jié)果與各方法DNA產(chǎn)量具有一致性。

表4 不同提取方法DNA產(chǎn)物相關(guān)序列信息

使用97%相似度的OTU，利用mothur做稀釋性曲線分析并作圖（圖2），可知，隨著測(cè)序深度的增加，曲線逐步趨于平坦，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理并達(dá)到飽和，該數(shù)據(jù)量能夠完整反映樣品的菌群種類。

2.3 OTU聚類、分類學(xué)分析、多樣性指數(shù)分析

經(jīng)過OTU聚類數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、分類學(xué)和多樣性指數(shù)分析，評(píng)價(jià)DNA提取方法效率。生成的Ace、Chao指數(shù)通常用于估計(jì)OTU數(shù)目指數(shù)；Shannon、Simpson指數(shù)則用于估計(jì)微生物多樣性，Shannon值越大反映了樣品中微生物多樣性越豐富。從表5中可以看出，方法6和10包含的細(xì)菌較豐富。根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果，可以得知一個(gè)或多個(gè)樣品在各分類水平上的比對(duì)情況。

圖2 16S rRNA高通量測(cè)序稀釋性曲線（97%相似水平）

表5 OTU值及多樣性指數(shù)

Ace、Chao被用來估計(jì)群落中OTU豐度的指數(shù)；Shannon、Simpson指數(shù)被用來估算樣品中微生物多樣性

Ace and Chao was used to calculate the richness of OTU; Shannon and simpson were used to calculate the diversity of bacteria

本試驗(yàn)依據(jù)樣品群落結(jié)構(gòu)分析，生成了不同樣品間細(xì)菌群體結(jié)構(gòu)柱狀圖（圖3），該柱狀圖反映了兩個(gè)信息：樣品中含有何種細(xì)菌；樣品中各細(xì)菌的序列數(shù)，即各細(xì)菌的相對(duì)豐度。分析結(jié)果顯示牦牛瘤胃中豐度較高的細(xì)菌群是擬桿菌Bacteroidtes （64%）、厚壁菌Firmicutes（20%）、螺旋體Spirochaetae（2.3%）和變形菌Proteobacteri（1.8%），纖維桿菌Fibrobacter（1.7%）。同時(shí)，筆者還發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌群體在不同樣品間所占比例存在一定差異，這可能是由于提取方法的不同導(dǎo)致細(xì)菌裂解效率存在一定差異。

圖3 牦牛瘤胃細(xì)菌群體結(jié)構(gòu)圖（在門分類水平上）

樣品生成的菌體群體結(jié)構(gòu)熱點(diǎn)圖（圖4）中，顏色深淺代表數(shù)值大小，根據(jù)顏色變化直接判定DNA提取方法的優(yōu)劣：藍(lán)色條框（較低豐度）越少則反映這種方法提取效率越高。因此，方法6是較理想的DNA提取方法。另外，統(tǒng)觀方法3、6和9，證明了珠磨法在微生物裂解過程中起著重要作用，并且重復(fù)性較好。

2.4 不同提取方法對(duì)革蘭氏陽性菌提取效果比對(duì)

革蘭氏陽性菌一般具有較厚的細(xì)胞壁難以破裂，造成了DNA提取的難度。因此，根據(jù)不同方法對(duì)革蘭氏陽性菌裂解效率來判定DNA提取方法的優(yōu)劣[24]。圖5列出了不同提取方法提取革蘭氏陽性菌效率，從圖5中可以看出，方法6裂解革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的能力比其他方法相對(duì)較高，尤其是對(duì)丁酸弧菌的裂解能力比其他方法好。

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，珠磨法及反復(fù)凍融能夠顯著提高DNA產(chǎn)量，其中珠磨法裂解效果要優(yōu)于凍融法。這是因?yàn)橹槟シㄔ趽舸蚣?xì)菌細(xì)胞壁過程中，能夠?qū)NA及蛋白質(zhì)結(jié)合體打破，從而釋放出更多的DNA。對(duì)于方法8和方法9而言，即便同時(shí)采用了珠磨及反復(fù)凍融法，但提取的DNA量顯著低于其他方法，說明CTAB陽離子去污劑在DNA提取過程中具有重要作用。

利用PCR擴(kuò)增分析微生物群體構(gòu)成的方法，DNA數(shù)量的多少并不是評(píng)價(jià)提取方法優(yōu)劣的關(guān)鍵因素。例如，方法7和方法9 所提取DNA含量較低，但是菌落結(jié)構(gòu)分析顯示他們具有相似的群體結(jié)構(gòu)。值得一提的是方法2提取的DNA含量較高，但其DNA卻不能順利地進(jìn)行高通量測(cè)序分析，推測(cè)可能是由于該方法產(chǎn)生的切割力較強(qiáng)（CTAB+SDS+反復(fù)凍融法），易使樣品微生物DNA斷裂為較小碎片，而這些片段不能作為16S rRNA PCR目標(biāo)區(qū)域的有效擴(kuò)增模板所致。方法8提取的DNA不能進(jìn)行高通量測(cè)序分析，是由于其DNA濃度沒有達(dá)到Illumina MiSeq PE300（Illumina，USA）測(cè)序平臺(tái)的最低濃度標(biāo)準(zhǔn)。16S rRNA測(cè)序后將那些具有高度相似性（97%）的序列歸為一個(gè)OTU（Operational Taxonomic Unit），樣品中OTU數(shù)目及基于OTU值生成的多樣性指數(shù)可以用于評(píng)價(jià)DNA提取方法的優(yōu)劣，通常，OTU值及Shannon多樣性指數(shù)越大，則說明樣品中具有較豐富的微生物群體。

因此，那些采用了珠磨法裂解的方法（方法3和6）具有較理想的裂解能力，它們能夠有效地提取到不同微生物種類的DNA。QIAamp DNA Stool Mini Kit能夠裂解不同微生物的細(xì)胞壁從而提取DNA，但由于后續(xù)純化過程中部分DNA流失，導(dǎo)致了樣品具有較少的OTU，卻具有較大的Shannon多樣性指數(shù)。所以，使用QIAamp DNA Stool Mini Kit提取的DNA生成的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不能真實(shí)反應(yīng)牦牛瘤胃細(xì)菌分布情況。

本試驗(yàn)結(jié)果生成了不同樣品間細(xì)菌群體結(jié)構(gòu)柱狀圖及Heat-map，根據(jù)分析圖可以看出不同提取方法生成的群體結(jié)構(gòu)圖存在著一定的差異，這可能與不同提取方法對(duì)不同細(xì)菌細(xì)胞壁裂解能力的差異性相關(guān)。革蘭氏陽性菌具有較厚的細(xì)胞壁，并往往形成孢子，造成了細(xì)胞壁裂解難度大，如果提取裂解方法不理想，則得到革蘭氏陽性菌的數(shù)量及種類會(huì)很少。因此可根據(jù)鑒定到的革蘭氏陽性菌多少來判斷DNA提取方法的有效性[24]。比較發(fā)現(xiàn)方法6中革蘭氏陽性菌豐度較高，推測(cè)出方法6能夠有效地裂解革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁。另外，由于其他方法的裂解能力較弱，生成的群體結(jié)構(gòu)圖相對(duì)于方法6實(shí)際上低估了革蘭氏陽性菌含量而高估了革蘭氏陰性菌含量。

每個(gè)樣品的豐度前50的細(xì)菌被挑選出來，并比對(duì)它們?cè)诓煌瑯悠分械南鄬?duì)豐度。顏色的深淺代表著每種物種的相對(duì)豐度

圖5 瘤胃豐度較高的8種革蘭氏陽性菌在樣品間的分布

目前，牦牛瘤胃內(nèi)微生物還沒有得到足夠的關(guān)注，關(guān)于牦牛瘤胃微生物的文獻(xiàn)較少，沒有完整的闡述牦牛瘤胃菌群宏基因的提取方法。本試驗(yàn)除了篩選理想的牦牛瘤胃菌群DNA提取方法，另一個(gè)重要目的就是初步鑒定牦牛瘤胃內(nèi)的細(xì)菌群體結(jié)構(gòu)。將測(cè)序結(jié)果運(yùn)用blast程序進(jìn)行比對(duì)分析，歸類結(jié)果顯示：牦牛瘤胃體內(nèi)至少包括21門、35綱、75科、112屬類細(xì)菌。主要細(xì)菌門類包括擬桿菌（64%）和厚壁菌（20%），螺旋體（2.3%），變形菌（1.8%）及纖維桿菌 (1.7%)。Guo等之前的研究中得出牦牛瘤胃菌群主要分為兩個(gè)大類，即厚壁菌（45.9%）和擬桿菌（39.68%），還存在少量的變形菌（4.85%）和螺旋體（2.47%），與本試驗(yàn)的結(jié)果相比，主要菌群的種類一致，在菌群結(jié)構(gòu)上有一定的差異，這說明牦牛之間瘤胃基本微生物菌群結(jié)構(gòu)大體一致，但由于地域不同、牧草種類不同以及采樣季節(jié)不同可能會(huì)造成具體的菌群比例差異[25]。牦牛瘤胃細(xì)菌的種類與黃牛相比存在著較大差異：在門和屬的水平上分別高于黃牛10.5%、105.5%。由于飲食及棲息環(huán)境的顯著差異，牦牛瘤胃內(nèi)可能含有一些特有細(xì)菌物種。然而，牦牛體內(nèi)的主要細(xì)菌門類（擬桿菌、厚壁菌、螺旋體、變形菌、纖維桿菌）和黃牛相似，暗示了這些細(xì)菌在反芻動(dòng)物體內(nèi)代謝中的普遍具有重要功能[26-29]。

纖維桿菌與瘤胃球菌在瘤胃中是主要負(fù)責(zé)分解纖維的菌種。因?yàn)殛笈２墒齿^為粗糙的草料，所以猜測(cè)在牦牛的瘤胃中，分解纖維的菌種數(shù)量更多。本試驗(yàn)的分析結(jié)果顯示，牦牛瘤胃中的纖維桿菌大約占1.7%，與黃牛相似，但瘤胃球菌（0.4%）明顯少于黃牛（5.0%），這一明顯的差異可作為今后研究的重點(diǎn)。

普氏菌屬是一類具有多種功能的菌種，它促進(jìn)最初的蛋白質(zhì)分解并協(xié)同其他分解纖維素的菌種發(fā)揮作用，提高機(jī)體對(duì)纖維素的分解能力。在成年奶用牛和黃牛的瘤胃微生物分析中可見普氏菌屬是一類很重要的菌種，大約占有40%—50%。但是，在本試驗(yàn)中，牦牛瘤胃微生物菌群分析可見，普氏菌屬僅占有15%，與黃牛差異明顯，這可能與日常飲食有關(guān)。奶用牛和黃牛主要飼喂高質(zhì)量的草料和谷物，而牦牛主要飼喂較為粗糙的草料，這提示飲食結(jié)構(gòu)對(duì)瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)有一定的影響。Petri[30]等的研究中也提到，不同的飲食結(jié)構(gòu)，普氏菌屬所占比例有明顯的變化，飼喂草料、混合飼料、高谷物飼料的黃牛，普氏菌屬所占比例分別為8.9%、12.8%和31.6%。

另外，高通量測(cè)序結(jié)果顯示牦牛瘤胃體內(nèi)有大量的未被描述和鑒定的細(xì)菌。例如， RC9_gut_group及BS11_gut_group_norank 菌種分別占整個(gè)微生物菌體的13.12%，10.10%。這些微生物可能在牦牛瘤胃體內(nèi)扮演著重要的生理及生態(tài)角色。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)首次對(duì)牦牛瘤胃細(xì)菌宏基因組提取方法進(jìn)行了比較研究。方法6（CTAB+Lysozyme+ 珠磨法）提取的DNA可用于16S rRNA高通量測(cè)序及其他分子生物學(xué)操作，被證明是較理想的牦牛瘤胃細(xì)菌基因組提取方法，QIAamp DNA Stool Extraction Kit試劑盒提取的瘤胃DNA不適宜用于分析細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)。另外，牦牛瘤胃內(nèi)存在大量未鑒定的微生物，這些微生物將是下一步研究的重點(diǎn)方向。因?yàn)椴煌娘嬍辰Y(jié)構(gòu)，牦牛與黃牛的瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)有著明顯的差異，牦牛瘤胃中有大量的未被描述的細(xì)菌，它們的特殊功能和所扮演的生態(tài)角色仍然是未知的，有待在今后的研究中進(jìn)一步發(fā)掘。

References

[1] Qiu Q, Zhang G J, Ma T, QIAN W B, WANG J Y, YE Z Q, CAO C C, HU QJ, JAEBUM K, DENIS M L, LORETTA A, BORIS C, MA J, HARRIS A L, QIAN X J, LANG Y S, ZHOU R, WANG L Z, WANG K, XIA J Q, LIAO S G, PAN S K, LU X, HOU H L, WANG Y, ZANG X T, YIN Y, MA H, ZHANG J, WANG Z F, ZHANG Y M, ZHANG D W, TAKAHIRO Y, MASAMI H, ZHONG Y, LIU W B, ZHANG Y, HUANG, Z Y, ZHANG S X, LONG R J, YANG H M, WANG J, JOHANNES A L, DAVID N C, WU Y, WANG J, SHI P, WANG J, LIU J Q. The yak genome and adaptation to life at high altitude., 2012, 44(8): 946-949.

[2] ROSS EM, MOATE RJ, BARH CR, DAVIDSON S E, SAWBRIDGE T I, GUTHRIDGE K M, COCKS B G, HAYES B J. High throughput whole rumen metagenome profiling using untargeted massively parallel sequencing., 2012, 13(53): 1-14..

[3] GUAN L L, NKRUMAH J D, BASARAB J A, MOORE S S. Linkage of microbial ecology to the phenotype: correlation of rumen microbial ecology to cattle’s feed efficiency.2008, 288(1): 85-91.

[4] ZHOU M, HERNANDEZ-SANABRIA E, GUAN L L. Characterization of variation in rumen methanogenic communities, as determined by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis analysis., 2010, 76(12): 3766-3786.

[5] ZHANG T, SHAO M F, YE L. 454 Pyrosequencing reveals bacterial diversity of activated sludge from 14 sewage treatment plants.2012, 6(6): 1137-1147.

[6] BIBBY K, VIAU E, PECCIA J. Pyrosequencing of the 16S rRNA gene to reveal bacterial pathogen diversity in biosolids., 2010, 44(14): 4256-4260.

[7] FOUTS D E, SZPAKOWSKI S, PURUSHE J, TORRALBA M, WATERMAN R C, MACNEIL M D, ALEXANDER L J, NELSON K E. Next generation sequencing to define prokaryotic and fungal diversity in the bovine rumen., 2012, 7(11): e48289.

[8] OMONIYI L A, JEWELL K A, ISAH O A, NEUMANN A P, ONWUKA C F I, ONAGBESAN O M, SUEN G. An analysis of the ruminal bacterial microbiota in West African Dwarf sheep fed grass- and tree-based diets., 2014, 116(5): 1094-1095.

[9] BERGMANN I, MUNDT K, SONTAG M, BAUMSTARK, NETTMANN E, KLOCKE M. Influence of DNA isolation on Q-PCR-based quantification of methanogenic Archaea in biogas fermenters., 2010, 33(2): 28-84.

[10] MCORIST A L, JACCKSON M, BIRD A R. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from hman faecal samples., 2002, 50(2): 131-139.

[11] ARIEFDJOHAN M W, SAVAIANO D A, NAKASTSU C H. Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens., 2010, 22: 9-23.

[12] YU Z, MORRISON M. Improved extraction of PCR-quality community DNA from digesta and fecal sample., 2004, 36(5): 808-812.

[13] GABRIELA V R, YEVANI V C, NAPOLEON G S, FLORENTINO A G, ERNESTINA G V, ALEJANDRO A P, MARCOS C J, VICTOR M B A, JUAN J V A. Evaluation of DNA extraction methods of rumen microbial populations., 2013, 29(2): 301-307.

[14] HENDERSON G, COX F, KITTELMANN S, MIRI V H, ZETHOF M, NOEL S J, WAGHORN G C, JANSSEN P H. Effect of DNA extraction methods and sampling techniques on the apparent structure of cow and sheep rumen microbial communitie., 2013, 8(9): e74787.

[15] VANYSACKER L, DECLERCK S A, HELLEMANS B, MEESTER L D, VANKELECON I, DECLERCK P. Bacterial community analysis of activated sludge: an evaluation of four commonly used DNAextraction methods., 2010, 88(1): 299-307.

[16] WEI G, PAN L, DU H, CHEN J Y, ZHAO L P. ERIC-PCR fingerprinting-based community DNA hybridization to pinpoint genome-specific fragments as molecular markers to identify and track populations common to healthy human guts., 2004, 59(1): 91-108.

[17] 李旦, 楊舒黎, 羅淑萍, 王加啟．瘤胃微生物總DNA提取方法的比較. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2006, 22(9): 1-5.

LI D, YANG S L, LUO S P, WANG J Q. Comparison methods of DNA extraction for rumen microbiology., 2006, 22(9): 1-5. (in Chinese)

[18] 劉薇, 方國(guó)慶, 劉立成, 王志博, 王燕, 張永根．奶牛瘤胃微生物DNA提取法的研究與優(yōu)化．中國(guó)畜牧雜志, 2011, 47(13): 71-75.

LIU W, FANG G Q, LIU L C, WANG Z B, WANG Y, ZHANG Y G.Study and optimization of DNA extraction method of rumen microorganisms in cow., 2011, 47(13): 71-75. (in Chinese)

[19] 楊瑞紅, 王加啟, 羅淑萍, 董志揚(yáng).奶牛瘤胃微生物總DNA的提取和純化. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 28(2): 39-42.

YANG R H, WANG J Q, LUO S P, DONG Z Y. Extraction and purification of DNA from environmental rumen samples., 2005, 28(2): 39-42. (in Chinese)

[20] 徐文華, 韓金濤, 蔡濤, 辛小玲, 白延琴, 劉超, 辛亞平. 秦川牛瘤胃微生物DNA提取方法的比較試驗(yàn). 中國(guó)牛業(yè)科學(xué), 2012, 38(6): 41-44.

XU W H, HAN J T, CAI T, XIN X L, BAI Y Q, LIU C, XIN Y P. Comparison of various methods for extracting Qinchuan cattle rumen microbial DNA., 2012, 38(6): 41-44.(in Chinese)

[21] COLWELL R K, CODDINGTON J A. Estimating terrestrial biodiversity through extrapolation., 1994, 345(1311): 101-118.

[22] SCHLOSS P D, HANDELSMAN J. Introducing DOTUR, a computer program for de?ning operational taxonomic units and estimating species richness., 2005, 71(3): 1501-1506.

[23] CHAO A, LEE S M. Estimating the number of classes via sample coverage., 1992, 87(417): 210-217.

[24] NICHOLAS J, GOTEL L. Ecology: Biodiversity in the scales., 2002, 419(6907): 575-576.

[25] GUO W, LI Y, WANG L, WANG J W, XU Q, YAN T H, BAI X. Evaluation of composition and individual variability of rumen microbiota in yaks by 16S rRNA high-throughput sequencing technology, 2015, 34: 74-79.

[26] GUO T, ZHANG T. Biases during DNA extraction of activated sludge samples revealed by high throughput sequencing., 2013, 97(10): 4607-4616.

[27] ZENED A, COMBES S, CAUQUIL L, MARIETTE J, KLOPP C, BOUNCHEZ, MEYNADIER A T, ENJALBERT F. microbial ecology of the rumen evaluated by 454 GS FLX pyrosequencing is affected by starch and oil supplementation., 2013, 83(2): 504-514.

[28] JAMI E, MIZRAHI I. Composition and simility of bovine rumen microbiota across individual animals., 2012, 7(3): e33306.

[29] JAMI E, MIZRAHI I. Similarity of the ruminal bacteria across individual lactating cows., 2012, 18(3): 338-343.

[30] PETRI RM, SCHWAIGER T, PENER G B, BEAUCHEMIN K A, FORSTER R J, MCKINNON J J, MCALLISTER T A. Characterization of the core rumen microbiome in cattle during transition from forage to concentrate as well as during and after acidotic challenge., 2013, 8(12): e83424.

（責(zé)任編輯 林鑒非）

Screening of Optimal DNA Extraction Methods and the Bacterial Community Composition of Yak Rumen Revealed by High 16S rRNA Throughput Sequencing

YANG QiYue1, HUANG Yong1, CHEN YaBing1, LIU LuoChuan1, LI Jian2, LAN DaoLiang2

(1College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041;2College of Tibetan Plateau Research, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041)

【Objective】The objective of this study is to determine the optimal DNA extraction methods for yak rumen bacterial genome and preliminarily identify the bacterial community of yak rumen.【Method】Physical method (bead-beating, freeze-thaw), chemical method(CTAB, SDS) and enzymatic method (lysozyme, protease K) were combined with the characteristics of rumen bacteria, 9 different methods (method 1, CTAB-SDS-Lysozyme; method 2, CTAB-SDS-Lysozyme-freeze-thaw; method 3, CTAB-SDS-Lysozyme-bead-beating; method 4, CTAB-Lysozyme; method 5, CTAB-Lysozyme-freeze-thaw; method 6, CTAB- Lysozyme-bead-beating; method 7, SDS-lysozyme; method 8, SDS-lysozyme- freeze-thaw; method 9, SDS-lysozyme-bead-beating) were generated to extract the rumen bacterial DNA, besides, method 10, QIA amp DNA Stool Mini Kit, was also used as reference. The above 9 methods were compared and analyzed based on DNA concentration, purity, DNA electrophoretogram and 16S rRNA high throughput sequencing results, and the bacterial community of yak rumen was preliminarily identified based on the sequencing results.【Result】The comparison results of different DNA extraction methods efficiency showed that the combined beat-beating and freeze-thaw could significantly increase cell lysis efficiency and DNA yield under the same chemical and enzymatic conditions. Methods 3 and 6 obtained high DNA concentration and purity, methods 7, 8, 9, and 10 had lower volume of DNA than other methods because of the lack of CTAB. In addition to methods 2 and 8 as their PCR products were too weak or not detected, the PCR products of rest methods all had suitable objective strap size and concentration which met the requirements of 16S rRNA high throughput sequencing. After high throughput sequencing, a total of 191 349 raw reads were obtained, and 171 231 clean reads were obtained after quality control. Rare faction curves analysis showed that the amount of reads reached the saturation level, which could completely reflect the bacterial community species of the samples. OTU-based taxology and the diversity index analysis showed that methods 6 and 10 contained more abundant bacteria. The comparison of the effect of different extraction methods on Gram-positive bacteria showed that method 6 presented a comparatively higher capability in lysing cell wall of Gram-positive bacteria. Above all, the DNA yield, OTUs number, bacteria diversity, and excellent cell-breaking capability of method 6 (CTAB-Lysozyme- bead-beating) was better than that with other methods. The bacterial community structure analysis showed that the number of taxa in yak rumen contained approximately 21 phyla, 35 classes, 75 families, 112 genera. The bacteria community of higher abundance included(64%),(20%),(2.3%),(1.8%) and(1.7%). Comparative analysis showed that there are some variation in the bacterial community between yaks and cattle, which may be attributed to different diets and habitats.【Conclusion】This study screened out an optimal DNA extraction method (method 6,CTAB-Lysozyme-Bead-beating) for yak rumen bacterial genome using 16S rRNA high-throughput sequencing, and the bacterial community structure of yak rumen was preliminarily evaluated. Results of the study provide a foundation for identifying the specificity of rumen microbial community and discovering distinct gene resource in yak.

yak; rumen microbe; DNA ; extraction methods; bacteria community structure

2016-04-13；接受日期：2017-01-10

西南民族大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（2015NZYTD01）、西南民族大學(xué)研究生學(xué)位點(diǎn)建設(shè)項(xiàng)目（2014XWD-S0906）、四川省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目（15ZA0386）、西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新型科研項(xiàng)目（CX2016SZ079）

楊琦玥，E-mail：yqy900714@163.com。通信作者李鍵，E-mail：lijian@swun.cn。通信作者蘭道亮，E-mail：landaoliang@163.com