基于宏基因組學(xué)技術(shù)分析不同貯藏條件下 鯰魚片中的菌相變化

朱迎春，王洋，樊曉盼，馬儷珍，王凱麗

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基于宏基因組學(xué)技術(shù)分析不同貯藏條件下 鯰魚片中的菌相變化

朱迎春1，王洋2，樊曉盼3，馬儷珍3，王凱麗1

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷 030801；2天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院/天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；3天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院/天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300384）

【目的】分析鯰魚肉片貯藏過程中微生物多樣性和菌群動(dòng)態(tài)變化，探究天然保鮮劑對(duì)鯰魚肉片菌相及菌落組成的影響。【方法】試驗(yàn)分8組，即新鮮鯰魚片（CK0）；空氣包裝（air-package，AP）鯰魚片低溫貯藏（4±1）℃第4、7天（AP4和AP7）樣品；氣調(diào)包裝（modified atmosphere package，MAP，60% CO2/40% N2）鯰魚片冰溫貯藏（-0.7±0.02℃）第10、30天（MAP10和MAP30）樣品；添加5%天然保鮮液（由殼聚糖、蜂膠、溶菌酶、Nisin和茶多酚復(fù)配而成）MAP鯰魚片冰溫貯藏第10、30和40天（MAPP10、MAPP30和MAPP40）樣品。采用宏基因組學(xué)技術(shù)，測(cè)定并分析不同貯藏方式鯰魚片全部微生物的16S rDNA序列，比較各組菌群的物種組成和豐度信息，通過Alpha多樣性分析和主成分分析，考察包裝方式、貯藏溫度和天然保鮮液對(duì)微生物的抑制作用?！窘Y(jié)果】8組樣品中454焦磷酸測(cè)序共鑒定出25個(gè)門、433個(gè)屬的細(xì)菌。MAP10、MAPP10、MAPP30中的最優(yōu)勢(shì)菌屬和CK0一致，均為；而AP4和AP7中的最優(yōu)勢(shì)菌分別為（70.49%）和（59.01%）。從微生物角度來(lái)看，MAP+冰溫貯藏優(yōu)于AP+冷藏。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，氣調(diào)包裝中的豐度由15.78%（MAP10）急劇上升為82.85%（MAP30）。添加天然保鮮液的MAPP10和MAPP30中幾乎檢測(cè)不到。【結(jié)論】氣調(diào)包裝協(xié)同冰溫貯藏顯著降低了鯰魚片中細(xì)菌菌群的豐度和多樣性，有利于延長(zhǎng)鯰魚肉的保質(zhì)期。天然保鮮液中的茶多酚、Nisin和殼聚糖等能顯著抑制MAP+冰溫貯藏的鯰魚片中的主要腐敗菌屬的生長(zhǎng)繁殖。

鯰魚片；宏基因組學(xué)；菌相變化；天然保鮮液

0 引言

【研究意義】革胡子鯰魚（）肉質(zhì)細(xì)嫩，無(wú)肌間刺，蛋白質(zhì)、脂肪含量高，深受人們喜愛。但宰殺后的鯰魚肉極易因多種微生物的生長(zhǎng)繁殖而腐敗變質(zhì)。對(duì)于食品中微生物的群落組成及變化，常用的傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、片面的缺陷，無(wú)法真正解析微生物的組成、豐度及其變化情況，而省去培養(yǎng)過程的宏基因組學(xué)（metagenomics）技術(shù)直接從樣品中提取基因組DNA后進(jìn)行測(cè)序分析，借助高通量測(cè)序方法，結(jié)合生物信息學(xué)工具，能夠發(fā)現(xiàn)大量過去無(wú)法分離培養(yǎng)的微生物[1-2]。因此，利用宏基因組學(xué)技術(shù)研究和分析冰溫貯藏過程中鯰魚肉菌群構(gòu)成及其演替規(guī)律并研究其控制措施，具有重要的理論意義和潛在的實(shí)用價(jià)值。【前人研究進(jìn)展】目前在食品領(lǐng)域中已將宏基因組學(xué)技術(shù)用于食品中微生物群落動(dòng)態(tài)的追蹤[3-5]，分析了干酪[6]、韓國(guó)泡菜[7-9]等發(fā)酵食品中微生物群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，揭示了發(fā)酵食品釀造過程中微生物的演替變化及其與代謝產(chǎn)物之間的聯(lián)系。在肉制品加工方面，BENSON等[10]研究了不同處理的冷藏豬肉香腸的微生物變化。發(fā)現(xiàn)香腸經(jīng)過乳酸/雙醋酸酯處理對(duì)微生物動(dòng)力學(xué)有顯著影響，導(dǎo)致微生物多樣性發(fā)生改變，而微生物變化與化學(xué)變化緊密相關(guān)。在肉制品貯藏方面，XIAO等[11]利用宏基因組學(xué)技術(shù)，鑒定出真空包裝水晶肴肉含有169個(gè)屬的細(xì)菌，是貯藏0、7和30 d時(shí)的優(yōu)勢(shì)菌群；及是貯藏15、22和30 d時(shí)的優(yōu)勢(shì)菌群；所有樣品在貯藏期內(nèi)微生物多樣性呈增加趨勢(shì)且有不同的群落結(jié)構(gòu)，15 d后群落結(jié)構(gòu)開始發(fā)生變化，30 d后群落結(jié)構(gòu)有顯著性差異。Zhao等[12]考查了真空包裝冷卻豬肉21 d貯藏過程中的菌相變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)新鮮豬肉（0 d）的微生物多樣性高，貯藏0—7 d，豐度急劇下降，而和豐度逐漸上升并在第7天達(dá)到峰值，之后急劇下降至檢測(cè)不出，豐度值持續(xù)上升最終成為優(yōu)勢(shì)菌?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】通過前期試驗(yàn)已經(jīng)獲知鯰魚片進(jìn)行氣調(diào)包裝（modified atmosphere package，MAP，60% CO2/40% N2）后冰溫（-0.7℃）貯藏，比常規(guī)的空氣包裝（air-package，AP）低溫貯藏（4℃）更有利于維持鯰魚片的食用品質(zhì)及理化特性[13]。但是雖然大多數(shù)微生物在此貯藏條件下生長(zhǎng)受到抑制，仍有一些嗜冷性微生物可以生長(zhǎng)繁殖，從而對(duì)鯰魚肉的品質(zhì)及人類健康安全造成威脅，有必要進(jìn)一步開展相關(guān)研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用宏基因組學(xué)技術(shù)對(duì)鯰魚肉片貯藏過程中微生物種群構(gòu)成和演替變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并將筆者實(shí)驗(yàn)室已研究出的天然保鮮劑[14]作用于鯰魚片，考察其對(duì)鯰魚肉片菌相變化規(guī)律及菌落組成的影響，了解不同貯藏條件下鯰魚片的優(yōu)勢(shì)腐敗菌群變化，以針對(duì)性地靶向抑制優(yōu)勢(shì)腐敗菌，提高鯰魚片的微生物安全性。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2014年11月在天津農(nóng)學(xué)院食品加工車間進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料及樣品采集

10條革胡子鯰魚（），平均每條重（1 250±25）g，體長(zhǎng)（30±2）cm，30 min內(nèi)鮮活運(yùn)至天津農(nóng)學(xué)院食品加工車間進(jìn)行宰殺。首先放入（5—7）℃冰水中10 min使其致暈，立即去頭、去皮、去內(nèi)臟，去骨剖片后，用無(wú)菌冰水洗滌，瀝干水分，切成4 cm×3 cm×1 cm魚片，每片重為（20±2）g，將得到的160片鯰魚片充分混合，隨機(jī)分4組：（1）20片魚片用于0 d微生物群落結(jié)構(gòu)的分析，標(biāo)記為CK0；（2）40片魚片空氣包裝（AP）之后冷藏庫(kù)（（4±1）℃）貯藏，在貯藏的4 d（貨架期終點(diǎn)）和7 d（腐敗階段）取樣分析，分別用AP4和AP7表示；（3）40片魚片直接進(jìn)行氣調(diào)包裝（MAP，60% CO2/40% N2）后置于國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心冰溫庫(kù)（（-0.7±0.02）℃）中貯藏，在10 d（新鮮階段）和30 d（腐敗階段）取樣，分別標(biāo)記為MAP10、MAP30；（4）60片魚片加入肉重5%的保鮮液（由0.5%殼聚糖、0.1%蜂膠、0.075%Nisin、0.075%溶菌酶、0.5%茶多酚配制而成），攪拌均勻，再以同樣方式進(jìn)行氣調(diào)包裝（MAP），置于冰溫庫(kù)（（-0.7±0.02）℃）中貯藏，分別在10 d（新鮮階段）、30 d（次新鮮階段）和40 d（貨架期終點(diǎn)）取樣分析，分別標(biāo)記為MAPP10、MAPP30和MAPP40。所取樣品裝入無(wú)菌自封袋中，于-80℃超低溫冰箱保存。將全部8個(gè)樣品（CK0、AP4、AP7、MAPP10、MAPP30、MAPP40、MAP10、MAP30）以冷凍運(yùn)輸方式運(yùn)送到上海派森諾生物科技有限公司，進(jìn)行宏基因組測(cè)序和生物信息學(xué)分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 宏基因組DNA的提取 按照1.1所取的樣品，參照OMEGA Soil DNA Kit試劑盒說明，分別抽提不同鯰魚肉樣品的細(xì)菌基因組DNA。所得DNA采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度，并采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。

1.2.2 16S rDNA PCR擴(kuò)增 以1.2.1獲得的基因組DNA為模板，擴(kuò)增 16S V1—V3區(qū)全長(zhǎng)，引物（F：5′- 454adapter-mid-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-454adapter-TTACCGCGG CTGCTGGCAC-3′）。

PCR反應(yīng)體系為：8.75 μL滅菌超純水；5.00 μL 5×Q5 Buffer，5×GC Enhancer，5.00 μL dNTP（2.5 mmol·L-1）；2.00 μL模板（2 ng·μL-1）；1.00 μL引物F（10 μmol·L-1）；1.00 μL引物R（10 μmol·L-1）；0.25 μL Q5 DNA polymeras。PCR循環(huán)梯度反應(yīng)參數(shù)：98℃預(yù)變性4 min；98℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，27個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，冷卻至4℃。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 焦磷酸測(cè)序 使用AMPure Beads對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，將純化后的PCR產(chǎn)物使用PicoGreen dsDNS Assay Kit在酶標(biāo)儀上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量，然后將PCR純化產(chǎn)物稀釋，等量混合?；旌虾蟮臉颖具M(jìn)行454焦磷酸測(cè)序。454測(cè)序按照標(biāo)準(zhǔn)的454/Roche GS-FLX Titanium方案進(jìn)行，利用GS DNA Library Preparation kit制備成單鏈模板DNA（single-stranded DNA）文庫(kù)，并利用GS emPCR kit 固定在磁珠上，在一個(gè)油包水的體系里進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.4 序列分析

1.2.4.1 原始雙端序列的過濾和連接 采用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。去除準(zhǔn)確率低于99%的以及模糊堿基N；然后利用軟件Flash（http://www. genomics. jhu.edu/software/FLASH/index. shtml）對(duì)通過質(zhì)量過濾的序列進(jìn)行連接，要求read1和read2的overlap≥10 bp，且不容許堿基錯(cuò)配。最后，根據(jù)index信息提取每個(gè)樣品的有效序列（要求Index完全匹配）。

1.2.4.2 優(yōu)質(zhì)序列的獲取及統(tǒng)計(jì) 為了保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，運(yùn)用Qiime軟件[15]（version 1.7.0，http://qiime.org/）進(jìn)行序列過濾，運(yùn)用mothur[16]（version 1.31.2，http://www.mothur.org/）軟件中uchime的方法去除嵌合體序列，得到用于后續(xù)分析的優(yōu)質(zhì)序列。

1.2.4.3 生物信息學(xué)分析 本試驗(yàn)在Qiime中調(diào)用uclust的方法對(duì)優(yōu)質(zhì)序列按相似度0.97進(jìn)行OUT（Operational Taxomomic Units，操作分類單元）聚類分析，選取每個(gè)類最長(zhǎng)的序列為代表序列。在Qiime中采用blast的方法對(duì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)后得到每個(gè)OTU的分類學(xué)信息，并設(shè)置置信區(qū)間為95%，默認(rèn)為cut off=0.03，即序列相似度在3%以下就認(rèn)為“未分類”。使用OUT表，利用Qiime軟件繪制稀釋曲線圖。

群落結(jié)構(gòu)多樣性分析選用Chao-the Chao1 estimator（http://www.mothur.org/wiki/Chao），Ace（abundance based coverage estimator）-the ACE estimator（http: //www.mothur.org/wiki/Ace），Shannon-the Shannon index（http://www.mothur.org/wiki/Shannon），Simpson- the Simpson index（http://www.mothur.org/wiki/ Simpson）等參數(shù)進(jìn)行評(píng)估，根據(jù)OTU列表中的各樣品物種豐度情況，應(yīng)用軟件mothur中的summary.single命令，計(jì)算4種常用的生物多樣性指數(shù)。物種豐度差異分析根據(jù)門和屬兩個(gè)層次上序列數(shù)的統(tǒng)計(jì)信息，將各物種豐度歸一到同數(shù)量級(jí)，應(yīng)用軟件mothur中的metastats（http://metastats. cbcb.umd.edu/）命令，進(jìn)行兩組之間的差異顯著性分析，多組之間采用SPSS進(jìn)行方差分析和LSD多重比較，sig值小于0.05的物種認(rèn)為在組間存在顯著性差異。此外，將所有細(xì)菌按分類學(xué)統(tǒng)計(jì)并利用軟件Qiime進(jìn)行主成分分析（PCA），觀察不同樣本間微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的分類學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 宏基因組DNA的提取

表1為鯰魚微生物基因組DNA的純度檢測(cè)結(jié)果?；蚪MDNA在OD260處具有完整的波峰，證明所提取的微生物基因組DNA純度較好?；蚪M DNA的平均濃度為87.38 ng·μL-1，所提取基因組DNA的總量為4.40 μg，符合瓊脂糖凝膠電泳的基本要求。

表1 鯰魚片細(xì)菌宏基因組質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

圖1為細(xì)菌16S rDNA V1—V3區(qū)片段瓊脂糖凝膠電泳圖譜，可知，以樣品DNA為模板可以擴(kuò)增出細(xì)菌的16S V1—V3區(qū)片段，大小500 bp左右且條帶清晰，大小正確，濃度適當(dāng)，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 優(yōu)質(zhì)序列的獲取與統(tǒng)計(jì)

本試驗(yàn)采用454 FLX+平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序得到的原始序列進(jìn)行篩選，丟棄長(zhǎng)度短于200 bp、含有模糊堿基、引物堿基含2個(gè)以上錯(cuò)配、單堿基重復(fù)超過6個(gè)的序列，得到質(zhì)量較高、符合要求的有效序列。但是高通量測(cè)序建庫(kù)過程中PCR擴(kuò)增會(huì)產(chǎn)生嵌合體序列（chimera sequence），測(cè)序過程中會(huì)產(chǎn)生點(diǎn)突變和同聚物等測(cè)序錯(cuò)誤，隨著測(cè)序長(zhǎng)度的增加，序列末端的質(zhì)量會(huì)降低。為了保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要對(duì)有效序列進(jìn)行過濾和去除嵌合體處理，得到最終用于后續(xù)分析的優(yōu)質(zhì)序列。表2為8個(gè)樣品中有效序列和優(yōu)質(zhì)序列的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，共獲得有效序列40 834個(gè)，優(yōu)質(zhì)序列為29 646個(gè)，優(yōu)質(zhì)序列的平均長(zhǎng)度為458 bp。

M：DL2000 marker，1：CK0；2：AP4；3：AP7；4：MAP10；5：MAP30；6：MAPP10；7：MAPP30；8：MAPP40

表2 樣品序列數(shù)統(tǒng)計(jì)表

2.3 MAP鯰魚片冰溫貯藏過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化

2.3.1 鯰魚片基于門水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分析 圖2是基于門繪制的微生物群落結(jié)構(gòu)變化圖，由圖2可知，所有的樣品細(xì)菌群落可以分為25個(gè)門，其中放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）的微生物占了極大的比例。新鮮鯰魚片（CK0）中Proteobacteria、Actinobacteria和Firmicutes是鯰魚肉樣品的主要微生物，分別占到29.70%、29.35%和22.25%，其次為Bacteroidetes和Cyanobacteria，所占比例為8.97%和7.89%，5種微生物的豐度總和達(dá)到98.06%，其他20種不同門的微生物只占很小比例。隨著包裝方式和貯藏溫度的不同，基于門的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

圖2 基于門的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化

AP鯰魚片4℃貯藏期間Proteobacteria豐度顯著增加，新鮮魚片豐度為29.70%，貯藏4 d上升為82.82%，7 d達(dá)到93.58%，成為優(yōu)勢(shì)腐敗菌；Actinobacteria豐度下降，從29.35%下降到1.31%（4 d），之后略有上升但比例仍然很低（3.69%，7 d）；Firmicutes豐度逐漸下降，從22.25%下降到12.15%（4 d）至1.84%（7 d）。MAP鯰魚片冰溫貯藏4 d與CK0相比，群落結(jié)構(gòu)未發(fā)生顯著變化，貯藏至第30天時(shí)，Proteobacteria和Actinobacteria的豐度分別下降到13.96%和1.59%；Firmicutes的豐度大幅上升為83.01%。添加保鮮液的MAPP鯰魚片Proteobacteria的豐度在31.81%— 50.03%呈現(xiàn)波動(dòng)變化，貯藏第10天、30天和40天時(shí)Actinobacteria豐度下降速率小于其他處理組，最終達(dá)到14.78%（40 d）。Firmiciutes在貯藏期間的豐度分別為20.25%（10 d）、10.45%（30 d）和48.50%（40 d），呈先下降后上升的趨勢(shì)。

擬桿菌門（Bacteroidetes）和藍(lán)藻門（Cyanobacteria）在鯰魚片所有樣品中所占比例較小且變化規(guī)律相同，均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，新鮮鯰魚片Bacteroidetes豐度值為8.97%，至樣品貯藏終點(diǎn)，達(dá)到0.84%—3.53%。Cyanobacteria豐度值則從7.89%下降至0.03%—0.09%。

由此可知，在鯰魚片貯藏過程中，Proteobacteria、Actinobacteria和Firmicutes是優(yōu)勢(shì)菌群。冰溫貯藏及加入天然保鮮液可以抑制Proteobacteria、Cyanobacteria和Bacteroidetes的生長(zhǎng)，但冰溫貯藏結(jié)合保鮮液作用對(duì)Actinobacteria的作用不明顯，而對(duì)Firmicutes無(wú)顯著抑制作用，這可能是由于很多Firmicutes會(huì)產(chǎn)生芽孢，可以抵抗脫水和極端環(huán)境，具有較強(qiáng)抗性的緣故。

2.3.2 基于屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分析 圖3—圖5是基于屬水平繪制的微生物群落結(jié)構(gòu)變化圖，它可以更清楚地表示鯰魚肉在貯藏過程中菌群結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化。本試驗(yàn)共鑒定出433個(gè)屬的細(xì)菌，表明鯰魚片菌落形態(tài)極為豐富。新鮮鯰魚片共含有170個(gè)屬的細(xì)菌，其中豐度大于1%的菌屬共有16個(gè)，豐度總和為96.90%，放線菌（）豐度達(dá)到22.26%，占優(yōu)勢(shì)地位。其他依次為芽孢桿菌屬（）（15.98%），蒼白桿菌屬（）（6.10%）和不動(dòng)桿菌屬（）（4.01%），其余的菌屬雖然豐度不高但數(shù)量眾多。

AP鯰魚片在4℃貯藏4 d 時(shí)菌相和新鮮魚片（CK0）相比有了很大的變化，氣單胞菌屬（）豐度最高，達(dá)到70.49%，成為優(yōu)勢(shì)菌群；乳酸球菌菌屬（）所占比例為11.93%，假單胞菌屬（）為9.95%。貯存至7 d，氣單胞菌屬（）比例下降為5.54%，假單胞菌屬（）成為優(yōu)勢(shì)菌群，豐度達(dá)到59.01%。因此，普通的空氣包裝食品導(dǎo)致其腐敗的主要優(yōu)勢(shì)菌是氣單胞菌屬和假單胞菌屬，為了更好地保持AP包裝鯰魚肉片的品質(zhì)，應(yīng)當(dāng)設(shè)法控制它們的生長(zhǎng)繁殖。

圖3 基于屬水平的鯰魚片微生物群落結(jié)構(gòu)（CK0組及AP組）

圖4 基于屬水平的鯰魚片微生物群落結(jié)構(gòu)（MAP組）

MAP鯰魚片冰溫貯藏10 d時(shí)，微生物群落結(jié)構(gòu)與新鮮鯰魚片（CK0）比較并沒有顯著差異。至貯藏終點(diǎn)（30 d）時(shí)，豐度急劇上升為82.85%，其次為占8.09%，占2.47%，這3種菌屬占總微生物的比例為94%，菌落組成結(jié)構(gòu)逐漸變得單一。成為MAP鯰魚片的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

天然保鮮液作用的MAPP組鯰魚片在冰溫貯藏過程中所占比例逐漸下降，由21.73% （10 d）降低到20.13%（30 d）和12.29%（40 d）。10 d時(shí)的葡萄球菌屬（）（3.72%）、腸球菌屬（）（8.24%）和蒼白桿菌屬（）（5.20%）至貯藏第30、40天時(shí)逐漸下降到較小的比例：（1.51%，0.57%）、（2.18%，0.41%）和（3.26%，1.89%）。而奈瑟菌屬（）的豐度由0.07%（10 d）上升到22.76%（30 d）；在貯藏前期豐度較低，為 2.03%（10 d），而貯藏40 d達(dá)到46.44%；不動(dòng)桿菌屬（）的比例由10.79%（10 d）上升為17.98%（40 d）。所以，和成為MAPP鯰魚片貯藏后期的優(yōu)勢(shì)致腐菌屬。

圖5 基于屬水平的鯰魚片微生物群落結(jié)構(gòu)(MAPP組)

2.4 鯰魚片貯藏過程中細(xì)菌群落的Alpha多樣性分析

表3為鯰魚片微生物Alpha多樣性指數(shù)表。Chao1、ACE、Chao/ACE為群落豐度指數(shù)（community richness），指數(shù)越大，群落豐度越高；Shannon和Simpson代表群落多樣性（Community diversity），Shannon值越大，群落多樣性越高，Simpson指數(shù)值越大，則群落多樣性越低。

由細(xì)菌群落的Alpha多樣性分析表明，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌群落組成發(fā)生較大的變化，新鮮鯰魚片（CK0）Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)均較高，Simpson指數(shù)較低，這表明新鮮鯰魚肉細(xì)菌群落豐富，具有較高的多樣性。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，AP鯰魚片冷藏4 d細(xì)菌的豐度和多樣性逐漸降低，說明低溫對(duì)某些嗜溫性細(xì)菌具有抑制性，導(dǎo)致其生長(zhǎng)受阻。貯藏7 d，進(jìn)入鯰魚片腐敗階段，蛋白質(zhì)和脂肪分解產(chǎn)生一些低分子堿性化合物，肉的pH升高，為某些適于分解蛋白質(zhì)和脂肪的微生物創(chuàng)造了生長(zhǎng)和繁殖的機(jī)會(huì)，細(xì)菌多樣性提高，群落豐度隨之提高。

表3 生物多樣性指數(shù)表

對(duì)冰溫貯藏MAP鯰魚片而言，在貯藏前期，細(xì)菌多樣性和豐度（Chao 1、Ace，Chao/Ace和Shannon、Simpson指數(shù)）與新鮮鯰魚片相比無(wú)較大變化。在貯藏終點(diǎn)，多樣性和豐度仍明顯低于AP冷藏組相同階段（即AP7）。經(jīng)保鮮液作用的MAPP組細(xì)菌多樣性和豐度在貯藏第10天與CK0組無(wú)明顯差異，貯藏30 d高于MAP組，這可能是添加殼聚糖、蜂膠、Nisin等保鮮液后改變了微生態(tài)的內(nèi)環(huán)境所致，但隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌多樣性和豐度逐漸降低，也說明冰溫+氣調(diào)+保鮮液三重作用對(duì)細(xì)菌群落的抑制作用。

2.5 鯰魚片貯藏過程中細(xì)菌群落的主成分分析

由圖6可知，CK0、MAP10、MAPP10、MAPP30和MAPP40樣品的微生物組成較為接近，可認(rèn)為是一個(gè)群體；AP7則和這個(gè)群體的組成有一定的差別；而MAP30、AP4和這個(gè)群體的差別很大。由此可知，冰溫貯藏+氣調(diào)包裝可以很好地維持鯰魚肉的品質(zhì)，使鯰魚肉的微生物菌群結(jié)構(gòu)在整個(gè)貯藏過程中與CK0（即新鮮鯰魚片）相比并沒有發(fā)生顯著的變化，這種保鮮作用在添加保鮮劑的MAPP樣品組貯藏30、40 d的時(shí)候依然有效。而MAP30樣品根據(jù)感官判定已經(jīng)達(dá)到腐敗階段，其中腐敗菌大量繁殖，致病菌活力增強(qiáng)，微生物組成發(fā)生了很大的變化。和氣調(diào)包裝冰溫貯藏的條件不同，空氣包裝的鯰魚片在低溫條件下微生物組成與前者有所差異，部分需氧或兼性厭氧菌如大量繁殖（AP4），進(jìn)而成為腐敗的優(yōu)勢(shì)菌群（AP7），樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有了顯著性的差異。圖6說明冰溫貯藏的樣品在貨架期內(nèi)其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與新鮮樣品差異性小，而空氣包裝樣品在貯藏期間均有不同的細(xì)菌群落分布，與新鮮樣品的差異性大，而添加天然保鮮液的樣品在貯藏期內(nèi)（40 d之內(nèi)）能很好的保持微生物組成不發(fā)生顯著變化。

圖6 鯰魚片細(xì)菌群落貯藏過程中主成分分析

3 討論

新鮮鯰魚片初始微生物數(shù)量不高，但豐度較大，各種微生物相互制衡。無(wú)論采用哪種方式包裝和貯藏，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，部分微生物生長(zhǎng)繁殖，成為優(yōu)勢(shì)腐敗菌，而其他微生物受到抑制，因此微生物豐度急速下降。和成為鯰魚片空氣包裝低溫貯藏的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。是水產(chǎn)品中的常見致腐菌，它與其他腐敗菌協(xié)同作用，水解蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪等，產(chǎn)生的尸胺是腐敗時(shí)不良?xì)馕兜闹苯觼?lái)源[17]。KROVACEK[18]和MANO[19]等研究表明，能夠在-2—10℃的低溫下生存和繁殖，在冷藏的牛肉、烤牛肉和豬肉中都發(fā)現(xiàn)過該菌。李苗云等[20]也發(fā)現(xiàn)是冷卻豬肉貯藏過程中主要的優(yōu)勢(shì)腐敗菌之一。是冷鏈流通中高蛋白水產(chǎn)品腐敗的主要原因[21-22]。DAINTY[23]研究表明，肉品的腐敗在很大程度上取決于肉品初期的數(shù)量和該菌在菌系中所占的比例。本試驗(yàn)中，AP鯰魚片貯藏4 d以后，豐度大大超過成為冷藏條件下有氧包裝的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，這是因?yàn)閷俸醚蹙瑢偌嫘詤捬蹙?，所以在有氧包裝條件下，逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌并使魚肉發(fā)黏、變色，產(chǎn)生NH3和H2S等散發(fā)出刺鼻的臭味，使魚肉在感官上難以接受，這與許多研究報(bào)道一致[24-26]。

包裝方式和貯藏溫度的不同帶來(lái)微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，與AP鯰魚片相比，MAP鯰魚片菌相構(gòu)成不及前者豐富，體現(xiàn)了氣調(diào)包裝對(duì)細(xì)菌菌群的抑制作用。氣調(diào)包裝中高濃度CO2通過改變微生物細(xì)胞內(nèi)酶結(jié)構(gòu)或影響細(xì)胞膜功能等方式來(lái)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝[27]，特別是對(duì)等需氧菌的抑制。貯藏終點(diǎn)，豐度降低為0.14%。成為MAP鯰魚片冰溫貯藏后期的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，豐度值高達(dá)82.85%。勵(lì)建榮等[28]研究發(fā)現(xiàn)冷藏（（3±0.5）℃）的氣調(diào)包裝（75% CO2/25% N2及50% CO2/50% N2）魚丸中為優(yōu)勢(shì)腐敗菌。STAMATIS[29]也發(fā)現(xiàn)是氣調(diào)包裝（75% CO2/25% N2及50% CO2/50% N2）鯖魚在3℃或6℃下微生物最多的種群之一。

本研究中并未成為MAPP鯰魚片的優(yōu)勢(shì)菌屬，貯藏過程中豐度在0.12%—1.42%，MAP鯰魚片中豐度較高的在MAPP鯰魚片中豐度值始終小于0.10%，豐度也逐漸降低，至貯藏40 d為0.41%，試驗(yàn)說明天然保鮮液抑制其生長(zhǎng)，改變了鯰魚片菌群結(jié)構(gòu)。這是因?yàn)楸驹囼?yàn)所用的復(fù)合保鮮液由溶菌酶、殼聚糖、蜂膠和Nisin等按比例配合而成。Nisin和溶菌酶等對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌作用強(qiáng)；蜂膠對(duì)革蘭氏陰性菌作用強(qiáng)；茶多酚既有抑菌作用又有抗氧化作用；殼聚糖則對(duì)腸桿菌、沙門氏菌及葡萄球菌等多種微生物都有較強(qiáng)的抑制作用[30]，研究報(bào)道殼聚糖還可以有效抑制三甲胺生成和脂肪氧化，降低生物胺生成量，使尸胺被完全抑制，組胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于50 mg·kg-1[31]。抑菌劑不同，抑菌譜亦不同。試驗(yàn)說明5種天然抑菌劑按照一定比例復(fù)配起來(lái)可以拓寬抑菌譜，起到明顯的抑菌作用。

MAPP組鯰魚片貯藏后期、奈瑟菌屬（）和的豐度較高。為革蘭氏陽(yáng)性菌，其芽孢位于菌體內(nèi)，具有厚而含水量低的多層結(jié)構(gòu)和高含量吡啶二羧酸，所以對(duì)熱、干燥、輻射、化學(xué)消毒劑和其他理化因素有較強(qiáng)的抵抗力，對(duì)保鮮液有比較強(qiáng)的抵抗性，保鮮液并不能將其很好抑制，當(dāng)保鮮液發(fā)揮抑菌效能，將其他細(xì)菌抑制之后，它的豐度相應(yīng)提高。專性需氧，本不是MAP貯藏的優(yōu)勢(shì)菌，但隨著包裝袋內(nèi)CO2的逐步消耗及外界O2通過包裝袋的滲透改變了鯰魚片貯藏的內(nèi)環(huán)境，為奈瑟菌屬（）的生長(zhǎng)繁殖創(chuàng)造了條件。此外，也成為MAPP組鯰魚片貯藏后期的優(yōu)勢(shì)菌群之一。孫麗霞[32]對(duì)氣調(diào)包裝結(jié)合茶多酚、Nisin和殼聚糖涂膜保鮮后的大黃魚貨架期終點(diǎn)（20 d）的菌落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，也得出為主要致腐菌的結(jié)論。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在新鮮（CK0）及氣調(diào)包裝鯰魚片（MAP10、MAPP10、MAPP30、MAPP40）中一直存在并占較大比例，說明也是貯藏過程中的主要污染微生物之一，應(yīng)該引起足夠重視。無(wú)芽孢、無(wú)運(yùn)動(dòng)性、呈分枝狀或棍棒狀，厭氧或兼性厭氧菌，二氧化碳能促進(jìn)其生長(zhǎng)。在其他文獻(xiàn)中，極少報(bào)道，也未見在水產(chǎn)品中的生物學(xué)特性的研究報(bào)道，而本試驗(yàn)中成為鯰魚片冰溫貯藏的優(yōu)勢(shì)腐敗菌之一，因此有必要在以后的研究中對(duì)其做進(jìn)一步的深入研究。據(jù)報(bào)道，是厭氧包裝的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，但是本試驗(yàn)中，的豐度較低，與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)的結(jié)果一致，可能與原料魚的品種、飼養(yǎng)環(huán)境等有關(guān)。

本試驗(yàn)采用以454 FLX+平臺(tái)高通量測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的宏基因組學(xué)技術(shù)全面研究了鯰魚片貯藏過程中微生物的物種組成及豐度信息，這為充分認(rèn)識(shí)不可培養(yǎng)微生物并從完整的群落水平上研究微生物活動(dòng)提供了可能，對(duì)于解析貯藏過程中微生物的動(dòng)態(tài)變化以及貯藏過程的質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)具有重要的意義和應(yīng)用價(jià)值。

然而，任何一種微生物的研究手段都有其自身的優(yōu)勢(shì)和局限性。高通量測(cè)序技術(shù)涵蓋的信息量巨大，某些未知序列因沒有足夠的參照標(biāo)準(zhǔn)，使得海量信息的歸類整合相對(duì)模糊。同時(shí)高通量測(cè)序技術(shù)是以微生物DNA作為檢測(cè)基礎(chǔ)，無(wú)法判別菌體的存活狀態(tài)[33]。傳統(tǒng)純培養(yǎng)鑒定方法盡管只能進(jìn)行一般的表性特征描述，但其具有成本低、分離出的菌體純度高等特點(diǎn)，在水產(chǎn)品貯藏保鮮研究中仍占有重要地位，可以作為高通量測(cè)序技術(shù)的有益補(bǔ)充。

4 結(jié)論

采用宏基因組學(xué)方法分析了鯰魚片貯藏過程中細(xì)菌群落的組成及其豐度變化，考察了天然保鮮劑對(duì)貯藏過程中菌相變化規(guī)律及菌落結(jié)構(gòu)的影響，共鑒定出25個(gè)門、433個(gè)屬的細(xì)菌?；陂T水平，Proteobacteria、Actinobacteria和Firmicutes是優(yōu)勢(shì)菌群?；趯偎?，新鮮鯰魚肉初始菌群主要是和，空氣包裝鯰魚片低溫貯藏過程中優(yōu)勢(shì)菌為和，氣調(diào)包裝鯰魚片在冰溫貯藏過程中逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌群。添加天然保鮮液后，豐度降低。茶多酚、Nisin和殼聚糖等天然保鮮液能顯著抑制鯰魚片中等菌屬的生長(zhǎng)繁殖，降低了鯰魚片細(xì)菌菌群的豐度和多樣性。

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（責(zé)任編輯趙伶俐）

Metagenomic Analysis of Bacterial Phases of Catfish Fillets under Different Storage Conditions

ZHU YingChun1, Wang Yang2, Fan XiaoPan3, MA LiZhen3, Wang KaiLi1

(1College of Food Science and Engineering, Shanxi Agriculture University, Taigu 030801, Shanxi;2The Department of Aquaculture Science of Tianjin Agriculture University/Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture, Tianjin 300384;3The Department of Food Science and Biological Engineering of Tianjin Agriculture University/Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing, Tianjin 300384)

【Objective】The objective of this experiment is to analyze the dynamic changes of bacterial phase of catfish fillet stored under different storage conditions, evaluate the effect of natural preservative on the special spoilage bacteria. 【Method】There were 8 groups in this experiment including fresh catfish () fillets (CK0), AP (air-package) catfish fillets stored at (4±1)℃ for 4 and 7 d (AP4, AP7)，MAP (modified atmosphere package, 60%CO2/40%N2) catfish fillets stored at controlled freezing-point temperature (0.7±0.02)℃ for 10 and 30 d(MAP10,MAP30), MAP catfish fillets added with 5% natural preservative stored at controlled freezing-point temperature (0.7±0.02)℃ for 10, 30 and 40 d (MAPP10, MAPP30 and MAPP40). The natural preservative consists of 0.5% chitosan, 0.1% propolis, 0.075% lysozyme, 0.075% Nisin and 0.5% tea polyphenol. Microbial16S rDNA of different samples were sequenced in metagenomics analysis, bacterial composition and abundance of these groups were compared. Alpha diversity and principal component analysis were carried out to investigate the effect of the natural preservative, package and storage temperature on bacterial phase changing.【Result】Totally 25 phylum, 433 genuses of bacteria were identified in 8 sample groups. The same as CK0, the principal genus in MAP10, MAPP10, MAPP30 was, while it was(70.49%) and(59.01%) in AP4 and AP7, respectively. From the respect of microbiology, MAP + controlled freezing-point temperature was better than AP + low temperature storage. During the storage, the abundance ofincreased sharply from 15.78% (MAP10) to 82.85% (MAP30), while in the MAPP group (MAPP10 and MAPP30) which supplemented with natural preservativesrarely could be detected. 【Conclusion】MAP + controlled freezing-point storage significantly lowered the bacterial abundance and diversity, therefore is useful to prolong the shelf life of catfish fillets. The components of tea polyphenol, Nisin and chitosan in the natural preservative used in this study markedly inhibited the growth and the multiplication ofwhich is the special spoilage bacteria in the MAP fillets stored at controlled freezing point. This is important for improving the security of catfish meat against microbial contamination through precise target inhibition.

catfish fillet; metagenomics; bacteria phase changes; natural preservative

2016-08-01；接受日期：2017-01-05

天津市水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目、山西農(nóng)業(yè)大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金（2015ZZ06）

朱迎春，Tel：13835487476；E-mail：yingchun0417@163.com。 通信作者馬儷珍，Tel：18622200780；E-mail：Malizhen-6329@163.com