核糖體失活蛋白（α-MC）亞細(xì)胞定位及對(duì)TMV的抑制作用

魏周玲，彭浩然，潘琪，張永至，蒲運(yùn)丹，吳根土，青玲，孫現(xiàn)超

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核糖體失活蛋白（-MC）亞細(xì)胞定位及對(duì)TMV的抑制作用

魏周玲，彭浩然，潘琪，張永至，蒲運(yùn)丹，吳根土，青玲，孫現(xiàn)超

（西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，重慶 400716）

【目的】克隆獲得苦瓜、商陸，在煙草中異源表達(dá)觀察兩個(gè)蛋白在細(xì)胞中的定位情況。研究-MC對(duì)煙草花葉病毒（，TMV）的抑制作用及其引起的抗性防御反應(yīng)?！痉椒ā扛鶕?jù)已報(bào)道的商陸抗病毒蛋白基因全序列和苦瓜素基因全序列，設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增和基因全長(zhǎng)引物，通過RT-PCR及基因克隆方法，從苦瓜和商陸春葉克隆得到苦瓜、商陸；用WolfPSORT預(yù)測(cè)蛋白定位，將苦瓜-MC、商陸PAP分別融合在GFP和DsRed2的N端，構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體，采用GFP和DsRed2標(biāo)記進(jìn)行亞細(xì)胞定位，驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果；通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)在本氏煙中瞬時(shí)表達(dá)-MC，再接種煙草花葉病毒，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分別檢測(cè)病毒在接種葉片的蛋白積累量和RNA表達(dá)量，分析瞬時(shí)表達(dá)-MC的抗病毒效果。利用qRT-PCR分析植物防衛(wèi)相關(guān)基因的表達(dá)，探究其抗病毒機(jī)理。【結(jié)果】克隆得到基因和全長(zhǎng)，分別為861和939 bp。Wolf PSORT預(yù)測(cè)顯示-MC和PAP主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜上。共聚焦熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，分別用GFP和DsRed2標(biāo)記的-MC和PAP均定位在本氏煙葉片表皮細(xì)胞質(zhì)膜上，與Wolf PSORT預(yù)測(cè)的-MC和PAP定位結(jié)果相一致。異源表達(dá)的PAP對(duì)植物細(xì)胞毒性作用強(qiáng)，導(dǎo)致表達(dá)部位細(xì)胞壞死，異源表達(dá)-MC的植物細(xì)胞無(wú)明顯毒性，表達(dá)部位細(xì)胞完整。在本氏煙中異源表達(dá)-MC后，再接種TMV-GFP，在紫外燈下觀察發(fā)現(xiàn)-MC處理后的本氏煙在接種TMV-GFP 48 h后沒有出現(xiàn)綠色熒光，而對(duì)照組出現(xiàn)熒光。72 h后處理組出現(xiàn)零星熒光，但對(duì)照組的綠色熒光開始擴(kuò)散，連續(xù)觀察，處理組幾乎沒有變化，接種TMV-GFP 6 d后，發(fā)現(xiàn)處理組的綠色熒光幾乎沒有擴(kuò)大的趨勢(shì)，而對(duì)照組的綠色熒光已擴(kuò)散至心葉；ELISA檢測(cè)表明，在接種TMV-GFP 6 d后的葉片中，對(duì)照組與健康植物的OD492比值幾乎已達(dá)到處理組的10倍以上；qRT-PCR檢測(cè)TMV RNA的含量，結(jié)果顯示對(duì)照組TMV RNA表達(dá)量是處理組的149倍左右，表明-MC對(duì)TMV復(fù)制和移動(dòng)均有明顯抑制；qRT-PCR結(jié)果分析顯示，在只注射TMV、單獨(dú)表達(dá)-MC以及表達(dá)-MC后注射TMV的本氏煙中均被誘導(dǎo)表達(dá)，但后者的表達(dá)量是前兩個(gè)處理的約2.5倍左右，在只接種-MC和表達(dá)-MC后注射TMV的本氏煙中均檢測(cè)到，但后者的表達(dá)量顯著高出前者5—7倍，表明異源表達(dá)-MC可誘導(dǎo)植物中防衛(wèi)相關(guān)基因的表達(dá)，從而引起更強(qiáng)的防御反應(yīng)?！窘Y(jié)論】異源表達(dá)-MC顯著抑制TMV，能夠激活植物防衛(wèi)反應(yīng)，且對(duì)植物細(xì)胞無(wú)明顯毒性。研究結(jié)果為利用異源表達(dá)-MC方法開發(fā)控制植物病毒新產(chǎn)品提供了參考依據(jù)。

核糖體失活蛋白；-MC；煙草花葉病毒；異源表達(dá)；亞細(xì)胞定位；防衛(wèi)相關(guān)基因

0 引言

【研究意義】核糖體失活蛋白（ribosome- inactivating proteins，RIPs）是一類在植物中廣泛存在的毒蛋白，大部分核糖體失活蛋白都來(lái)自于高等植物，也有少部分的幾種來(lái)自于真菌、細(xì)菌以及藻類等[1]。RIPs作用于核糖體大亞基RNA的3′端莖環(huán)結(jié)構(gòu)中一個(gè)高度保守的核苷酸區(qū)域sarcin/ricin結(jié)構(gòu)域，破壞核糖體大亞基RNA的結(jié)構(gòu)，使核糖體失活。RIPs發(fā)揮功能主要通過兩方面，一是RNA N-糖苷酶活性，具有脫嘌呤作用，從而抑制蛋白質(zhì)合成[2]；二是RNA水解酶的活性，研究發(fā)現(xiàn)從巨曲霉（）中分離出來(lái)的-sarcin蛋白是一種RNase，幾乎可以水解所有生物來(lái)源的核糖體，導(dǎo)致核糖體失活[3]。近幾年的研究已經(jīng)證實(shí)，植物基因編碼的RIPs在體外實(shí)驗(yàn)以及轉(zhuǎn)基因植物中對(duì)病害都具有一定的抗性，包括廣譜性的抗病毒、抗真菌以及對(duì)昆蟲也有一定的抗性等[4-7]。因此，選擇核糖體失活蛋白苦瓜素-MC，研究異源表達(dá)-MC的抗病毒功能對(duì)于防治植物病毒病有重要的理論和實(shí)踐意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，可以將核糖體失活蛋白分為3類[8]，第1類是I型RIPs，由分子量約為30 kD的單肽鏈蛋白組成；第2類是II型RIPs，由一個(gè)類似I型RIPs的酶活性A鏈和一個(gè)稍大的凝聚素B鏈組成[9]；第3類是III型RIPs，但此類并不常見，僅在玉米和大麥中發(fā)現(xiàn)[10]。商陸抗病毒蛋白PAP和苦瓜素-MC均是I型RIPs，分子量約為29 kD。目前認(rèn)為PAP是一種廣譜性的抗病毒蛋白，可以抗多種植物病毒，如TMV、黃瓜花葉病毒（）、苜蓿花葉病毒（）、非洲木薯花葉病毒（）以及花椰菜花葉病毒（）等[11]。對(duì)動(dòng)物病毒如巨細(xì)胞病毒（）、流感病毒（）、脊髓灰質(zhì)炎病毒（）、皰疹病毒（）、人體免疫缺損病毒（）也有一定的抑制作用[12-13]。但早前就有研究證明，全長(zhǎng)的PAP對(duì)植物細(xì)胞具有一定的毒性，將克隆的PAP導(dǎo)入煙草，轉(zhuǎn)基因煙草出現(xiàn)明顯的生理變化，表現(xiàn)為矮化，葉片斑點(diǎn)及不育[14]。-MC生物學(xué)活性包括rRNA N-糖苷酶活性、RNA水解酶活性、DNA水解酶活性、抗腫瘤活性以及抗病毒活性等[15-16]。植物被病原物入侵時(shí)，能夠通過植物抗性基因產(chǎn)物和病原菌無(wú)毒基因的互作識(shí)別病原菌，同時(shí)激活局部和系統(tǒng)抗性反應(yīng)[17]。RIPs可能參與植物這一防御反應(yīng)的過程，從而對(duì)植物病毒具有一定的抗性。例如，已報(bào)道的在轉(zhuǎn)基因植物中商路抗病毒蛋白能夠引起PR蛋白的表達(dá)[18]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】Zhu等[19]研究發(fā)現(xiàn)從苦瓜籽提純的-苦瓜素在濃度為0.5 mg·mL-1時(shí)對(duì)植物病毒具有明顯的抑制作用，對(duì)玉米、小麥上的病原真菌也有潛在的抗性，提純的苦瓜素可作為一種農(nóng)作物保護(hù)藥物抵抗植物病害。但若將苦瓜素開發(fā)成農(nóng)藥，僅從苦瓜籽中提取苦瓜素，明顯無(wú)法滿足生產(chǎn)需求，轉(zhuǎn)基因異源表達(dá)-MC可以提供豐富的-MC，而目前對(duì)于異源表達(dá)-MC對(duì)TMV的抗性效果和機(jī)制尚不明確，且-MC在植物中的細(xì)胞定位及其表達(dá)后對(duì)植物細(xì)胞的影響還不確定?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在本氏煙中異源表達(dá)-MC、PAP，明確二者亞細(xì)胞定位情況，并觀察異源表達(dá)-MC是否與PAP一樣引起植物的細(xì)胞死亡；分析在本氏煙中異源表達(dá)的-MC是否具有抗病毒作用，并明確其抗病毒機(jī)理，為更好地開發(fā)利用核糖體失活蛋白控制植物病毒病提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015—2016年在西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病毒研究室完成。

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 供試大腸桿菌DH5購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；根癌土壤農(nóng)桿菌株EHA105由筆者實(shí)驗(yàn)室保存；植物表達(dá)載體pPZP- RCS1、中間載體pSAT6-DsRed2-N1由美國(guó)紐約州立大學(xué)石溪分校Vitaly教授贈(zèng)送；植物表達(dá)載體pCV-mGFP-C1由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院陳劍平研究員實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；煙草花葉病毒熒光標(biāo)記載體TMV-GFP（pSPDK661）由清華大學(xué)劉玉樂教授實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；供試本氏煙，在溫室育苗盆中播種，培養(yǎng)至4—6葉期備用。

1.1.2 試劑與引物 植物總RNA提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；DNA純化回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真TaqTMDNA聚合酶、T4DNA連接酶購(gòu)自大連寶生物工程公司；T-載體試劑盒購(gòu)自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR獲得目的基因 利用植物總RNA提取試劑盒，從美洲商陸葉片和苦瓜葉肉提取總RNA，根據(jù)已報(bào)道的商陸抗病毒蛋白基因全序列（登錄號(hào)X55383）和苦瓜素基因全序列（登錄號(hào)X57682.1），設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增和基因全序列引物，引物序列如表1，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一條鏈，進(jìn)行PCR反應(yīng)：95℃預(yù)變性4 min，進(jìn)入循環(huán)94℃ 30 s，58℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 1.5 min，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，16℃結(jié)束反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA純化回收試劑盒純化后連接T載體克隆，挑取陽(yáng)性單菌落測(cè)序分析。

表1 RT-PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因序列引物

1.2.2 植物表達(dá)載體構(gòu)建 提取測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶II、I和HI、I雙酶切后割膠回收基因組片段，將酶切后的片段插入經(jīng)II和I雙酶切的pSAT6-DsRed2-N1載體中，酶切后的片段插入經(jīng)H I、I雙酶切的pCV-mGFP-C1的載體中。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證并測(cè)序，試劑盒提取質(zhì)粒得到pSAT6-PAP-DsRed2和pCV--MC-mGFP重組質(zhì)粒。測(cè)序成功的重組質(zhì)粒pSAT6-PAP-DsRed2用單酶切酶I切下表達(dá)框，插入經(jīng)I酶切并去磷酸化后的植物表達(dá)載體pPZP- RCS1上，克隆后PCR鑒定并提取質(zhì)粒酶切鑒定是否構(gòu)建成功，由此構(gòu)建植物表達(dá)載體pPZP-PAP-DsRed2。

1.2.3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 從-80℃冰箱取出保存的EHA105菌株，劃線平板，挑選單菌落接種于無(wú)抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中搖菌12—16 h，CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞。參考劉兆明等[20]方法，將pPZP-PAP-DsRed2和pCV--MC-mGFP以熱擊法轉(zhuǎn)化到根癌土壤桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，將含有pPZP-PAP-DsRed2的農(nóng)桿菌菌液均勻涂布于含有100 μg·mL-1壯觀霉素和50 μg·mL-1利福平的YEP固體培養(yǎng)基上，將含有pCV--MC-mGFP的農(nóng)桿菌菌液涂布于含有卡那霉素和利福平的YEP固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。挑取陽(yáng)性單菌落進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.4 PAP和-MC蛋白的定位觀察 參考Li等[21]方法，采用根癌土壤桿菌滲入法將含pPZP-PAP-DsRed2和pCV--MC-mGFP的菌體用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染液懸浮并將OD600調(diào)到1.0—1.2左右，用重懸液分別浸潤(rùn)四葉期本氏煙，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次。浸潤(rùn)48—72 h即可在Zeiss LSM780共聚焦熒光顯微鏡下觀察浸潤(rùn)的組織熒光。

1.2.5-MC對(duì)TMV的抗性檢測(cè) 先用含有pCV-- MC-mGFP的重懸液浸潤(rùn)本氏煙，進(jìn)行預(yù)處理，48 h后再于原接種葉注射含有TMV-GFP的重懸液，以含GFP空表達(dá)載體的農(nóng)桿菌重懸液預(yù)處理植物再接種TMV-GFP為陽(yáng)性對(duì)照，空表達(dá)載體重懸液處理作為空白對(duì)照。注射TMV-GFP 48 h后，在紫外燈下觀察TMV-GFP的移動(dòng)情況，拍照記錄并收集接種葉片，連續(xù)觀察。利用間接ELISA法檢測(cè)病毒的含量，包被液研磨葉片，離心，取上清加入ELISA板包被，洗滌后依次加入一抗、二抗，分別在37℃孵育2 h，最后加入含有鄰苯二胺的底物緩沖液在37℃恒溫箱避光顯色，顯色結(jié)束用濃硫酸終止反應(yīng)。底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析[22-23]。用酶標(biāo)儀（BIO-Tek；USA）測(cè)定OD492，當(dāng)OD492處理組與健康植株對(duì)照相對(duì)比值＞2時(shí)，待測(cè)樣品為陽(yáng)性，且OD492大小與顏色深淺直接正相關(guān)從而進(jìn)行定量分析。

1.2.6 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 本氏煙中異源表達(dá)-MC再接種TMV-GFP，72 h后收集接種葉片，用植物總RNA提取試劑盒提取植物葉片總RNA，RNA濃度通過酶標(biāo)儀（Biotek，USA）測(cè)定，并用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。用Prime ScriptTMRT reagent Kit（TaKaRa，Japan）試劑盒提供的方法將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用QuantinovaTMSYBR Green PCR Kit（QIAGEN，GER）擴(kuò)增，內(nèi)參基因選用，實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物列見表2，每個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列檢測(cè)基因的表達(dá)

2 結(jié)果

2.1和目的基因的克隆

用設(shè)計(jì)的和特異引物，以美洲商陸葉子和苦瓜葉肉的總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示均擴(kuò)增出與目的基因大小一致的條帶。回收目的片段，連接至pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序，序列分析顯示所得基因分別為和，為939 bp，為861 bp。將目的基因和載體分別用相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切后連接，構(gòu)建分別與DsRed2和GFP融合表達(dá)的植物表達(dá)重組載體。用載體通用引物測(cè)序，結(jié)果表明目的基因成功構(gòu)建入植物表達(dá)載體分別命名為pPZP-PAP-DsRed2和pCV--MC-mGFP。

2.2 PAP和-MC蛋白的亞細(xì)胞定位

2.2.1 PAP和-MC蛋白的亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè) 確定蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布是揭示蛋白功能的重要環(huán)節(jié)，為了解PAP和-MC蛋白的亞細(xì)胞定位，利用Wolf PSORT對(duì)其進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明PAP和-MC均有68.5%的機(jī)率定位在細(xì)胞質(zhì)膜上，還可能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔有少量分布（表3）。

2.2.2 PAP和-MC蛋白的亞細(xì)胞定位的驗(yàn)證 為驗(yàn)

證核糖體失活蛋白PAP和-MC在細(xì)胞中的定位預(yù)測(cè)，將成功構(gòu)建的pPZP-PAP-DsRed2和pCV--MC-mGFP用熱擊法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)方法使其在本氏煙葉片中表達(dá)，48—72 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，融合PAP- DsRed2和-MC-GFP融合蛋白的熒光均于細(xì)胞膜上分布，PAP-DsRed2在細(xì)胞質(zhì)中也有少量分布（圖1），說(shuō)明核糖體失活蛋白PAP和-MC在細(xì)胞中主要定位在細(xì)胞膜上，與預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。在本氏煙中表達(dá)PAP 48 h后，蛋白表達(dá)部位葉片大部分壞死（圖2），在共聚焦顯微鏡下雖可以觀察到紅色熒光，但只有極少數(shù)細(xì)胞完整。72 h后，表達(dá)蛋白部位葉片全部壞死，共聚焦顯微鏡下看不到完整表皮細(xì)胞，說(shuō)明全長(zhǎng)PAP對(duì)植物細(xì)胞具有明顯毒性。在本氏煙葉片中表達(dá)-MC 48 h后，蛋白表達(dá)部位顏色與周邊出現(xiàn)差異，共聚焦顯微鏡下可以觀察到完整的葉片表皮細(xì)胞；72 h后，葉片蛋白表達(dá)部位顏色沒有進(jìn)一步改變，仍然沒有細(xì)胞崩解，表明全長(zhǎng)-MC對(duì)本氏煙葉片細(xì)胞沒有可見毒性（圖2）。因此，后續(xù)試驗(yàn)中可以用異源表達(dá)-MC分析其對(duì)TMV的抑制作用。

圖1 PAP和α-MC在本氏煙中的亞細(xì)胞定位

圖2 瞬時(shí)表達(dá)PAP和α-MC 48 h本氏煙的癥狀

表3 PAP和α-MC蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

2.3 異源表達(dá)-MC蛋白在本氏煙中對(duì)TMV的抑制作用

為明確在本氏煙中異源表達(dá)-MC蛋白是否對(duì)TMV有抑制作用，先對(duì)本氏煙進(jìn)行預(yù)處理，將-MC瞬時(shí)表達(dá)48 h后，再接種TMV-GFP，在紫外燈下觀察TMV-GFP的移動(dòng)情況。結(jié)果顯示，先注射-MC處理后的本氏煙在接種TMV-GFP 48 h后沒有任何熒光出現(xiàn)，而對(duì)照組出現(xiàn)綠色熒光。72 h后處理組開始出現(xiàn)零星熒光，而對(duì)照組的綠色熒光開始擴(kuò)散，連續(xù)觀察，處理組幾乎沒有變化，在接種6 d后，處理組的零星熒光有略微的擴(kuò)大，而對(duì)照組的綠色熒光已經(jīng)擴(kuò)散至心葉（圖3-A），表明異源表達(dá)-MC蛋白對(duì)TMV具有抑制作用。為確定處理組和對(duì)照組中病毒的含量，分別采集48、72、144 h后的接種葉用間接ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，注射TMV-GFP 48 h后，處理組與健康植物的OD492比值＜2，表明沒有檢測(cè)到病毒，而對(duì)照組的OD492比值已經(jīng)達(dá)到5；72 h后，處理組才檢測(cè)到病毒，而對(duì)照組與健康植物的OD492比值幾乎是處理組的5倍左右；144 h后，對(duì)照組的OD492比值是處理組的10倍以上（圖3-B），空白對(duì)照健康植株的OD492比值均在1左右，說(shuō)明-MC瞬時(shí)表達(dá)對(duì)TMV侵染有明顯的抑制作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證-MC的表達(dá)是否影響了病毒RNA的積累，采集接種TMV-GFP 72 h后的接種葉提取RNA，利用qRT-PCR檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組TMV-GFP表達(dá)量是處理組的149倍左右，達(dá)到顯著水平（＜0.05），空白對(duì)照健康植株中沒有檢測(cè)到TMV-GFP（圖3-C），說(shuō)明-MC表達(dá)后會(huì)影響病毒RNA的積累。

2.4 防衛(wèi)相關(guān)基因的表達(dá)

已有報(bào)道稱轉(zhuǎn)基因植物中商陸抗病毒蛋白PAP可以誘導(dǎo)PR蛋白的表達(dá)[18]，-MC也是I型核糖體失活蛋白。因此本試驗(yàn)中，為評(píng)估異源表達(dá)的-MC與防衛(wèi)相關(guān)基因之間的關(guān)系，選用3個(gè)基因，檢測(cè)接種TMV-GFP 72 h后的本氏煙中3個(gè)基因的表達(dá)量。收集接種葉，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在只注射TMV、單獨(dú)表達(dá)-MC以及表達(dá)-MC后注射TMV的本氏煙中都被誘導(dǎo)表達(dá)，但后者的表達(dá)量是前兩個(gè)處理的約2.5倍左右，達(dá)到顯著水平（＜0.05）（圖4）。在只接種-MC和表達(dá)-MC后注射TMV的本氏煙中檢測(cè)到，但后者的表達(dá)量顯著高出前者5—7倍，達(dá)到顯著水平（＜0.05）。與對(duì)照組相比，單獨(dú)注射TMV的植物中也檢測(cè)到兩個(gè)基因的表達(dá)量增加。

A：表達(dá)α-MC本氏煙中TMV的侵染移動(dòng)情況Symptoms of TMV-GFP infected N. benthamiana expressed α-MC under the UV light；B：ELISA檢測(cè)不同處理本氏煙中TMV含量Analysis of the accumulation levels of TMV inN. benthamiana expressed α-MC by enzyme-linked immunosorbent assay；C：qRT-PCR檢測(cè)不同處理TMV RNA的表達(dá)量Analysis of the expression levels ofTMV-GFPRNA inN. benthamiana expressed α-MC by qRT-PCR

圖4 qRT-PCR檢測(cè)α-MC預(yù)處理的本氏煙植物中NPR1、PR1、PR2的表達(dá)量

3 討論

苦瓜核糖體失活蛋白包括苦瓜凝集素、map30、-苦瓜素、-苦瓜素、-苦瓜素等，其中-苦瓜素和-苦瓜素都從苦瓜籽中分離出來(lái)，具有相似的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性[24-25]。研究表明，-苦瓜素具有抗HIV、抗HSV的特性并對(duì)尖鐮孢和瓜果腐霉均有抗性[4]。在本試驗(yàn)中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將-MC在本氏煙中異源表達(dá)，接種TMV-GFP后，在紫外燈下觀察TMV-GFP的移動(dòng)情況，結(jié)果顯示，異源表達(dá)-MC能夠抑制TMV的復(fù)制，表明可以進(jìn)一步利用基因工程異源表達(dá)-MC來(lái)滿足開發(fā)利用所需。

現(xiàn)有的研究認(rèn)為苦瓜RIPs可能是通過3種機(jī)制來(lái)發(fā)揮抗病毒作用的。一是使受感染細(xì)胞自身的核糖體失活而阻止蛋白質(zhì)合成引起細(xì)胞死亡，進(jìn)而抑制病毒的繁殖；二是直接作用于病毒的DNA和RNA，使其喪失轉(zhuǎn)運(yùn)和復(fù)制功能；三是抑制與病毒復(fù)制有關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶的活性[26]。在本氏煙葉片中瞬時(shí)表達(dá)-MC和PAP，發(fā)現(xiàn)PAP表現(xiàn)出強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性，與前人所報(bào)道一致[14]。而-MC對(duì)本氏煙葉片細(xì)胞沒有毒性，因而-MC應(yīng)該不是通過引起細(xì)胞死亡來(lái)抑制病毒繁殖。在共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)-MC定位在細(xì)胞質(zhì)膜，而TMV運(yùn)動(dòng)蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜跨膜蛋白，可與病毒核酸結(jié)合形成膜-運(yùn)動(dòng)蛋白-病毒核酸復(fù)合體，在細(xì)胞壁附近介導(dǎo)病毒核酸通過細(xì)胞胞間連絲[27-29]，因此，-MC抗病毒機(jī)制可能與Vandenbussche等[30]觀點(diǎn)類似，其在細(xì)胞膜上作用于病毒的這一復(fù)合體中的病毒核酸，抑制病毒移動(dòng)。還有報(bào)道認(rèn)為RIP可能作用于受侵染植物細(xì)胞的核糖體，從而抑制病毒蛋白的合成[31]。筆者在ELISA和qRT-PCR檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)-MC處理的植株病毒和病毒RNA含量都非常低，這說(shuō)明異源表達(dá)-MC不但能夠抑制病毒TMV蛋白質(zhì)合成，也抑制RNA的復(fù)制積累。

核糖體失活蛋白也被認(rèn)為是一種具有誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性的多功能蛋白[7]。系統(tǒng)獲得性抗性的特點(diǎn)是活性氧的迸發(fā)、水楊酸的積累以及病程相關(guān)基因例如和的表達(dá)等[32]。有研究表明，核糖體失活蛋白MAP30可通過調(diào)節(jié)病毒和腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)而發(fā)揮作用，上調(diào)與細(xì)胞程序化死亡直接相關(guān)的的表達(dá)，以干擾病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞程序化死亡的抑制[33]。Zhu等[19]研究發(fā)現(xiàn)自苦瓜籽中提純的苦瓜素噴灑本氏煙，再接種植物病毒，也會(huì)誘導(dǎo)防衛(wèi)相關(guān)基因的表達(dá)。本試驗(yàn)中，在異源表達(dá)-MC的本氏煙接種葉片中檢測(cè)到、和的表達(dá)，且表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)照組，說(shuō)明異源表達(dá)-MC在抑制TMV的同時(shí)也激活了植物的系統(tǒng)性抗性，這一系統(tǒng)抗性是否也抗其他植物病原的侵染有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

-MC和PAP一樣均定位于植物細(xì)胞質(zhì)膜。本氏煙中異源瞬時(shí)表達(dá)-MC具有抑制TMV侵染移動(dòng)的作用，同時(shí)也可誘導(dǎo)本氏煙產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Subcellular localization of the ribosome-inactivating protein-MC and Its antiviral effect on TMV

WEI ZhouLing, PENG HaoRan, PAN Qi, ZHANG YongZhi, PU YunDan, WU GenTu, QING Ling, SUN XianChao

(College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400716)

【Objective】The objective of this study is to obtainthe alpha-momorcharin () and pokeweed antiviral protein () by cloning, observe the cellular localization of which inby heterologous expression, and to evaluate the effects of-MC on inhibiting(TMV) and the resistance defense response of.【Method】Based on the published sequences of-and, primer pairs for cloningandwere designed. RT-PCR and gene cloning were used to obtain the target genesandfrom the leaves ofand, respectively. First, subcellular localization of theMCandPAP was predicted through Wolf PSORT, then the fusion protein vectors for verifying the subcellular localization were constructed by fusing the-MC and PAP to the N-terminal of the GFP and DsRed2, respectively. The-MC was transiently expressed in theleavesby agro-infiltration, and the-MC expressed leaves were inoculated with TMV-GFP. The accumulation of the virions and viral RNA were detected by indirect ELISA and real-time quantitative PCR (qRT-PCR). In order to understand the antiviral mechanism of the-MC, the expression of plant defense-related genes including non-expressor of pathogenesis-related genes(,,) were evaluated by qRT-PCR. 【Result】The length of genesandobtained by RT-PCR were 861 and 939 bp, respectively. The subcellular localization showed that the coding proteins of-MC and PAP were predicted by Wolf PSORT to distribute on the plasma membrane. Under the confocal laser scanning microscope, the fusion proteins-MC-GFP and PAP-DsRed2 also distributed on the plasma membrane of the leaf epidermis cell of, which is consistent with the predicted results. It was observed that the heterologously expressed PAP produced strong toxic effects on tobacco leaf cells, which led to necrosis of the cells, while the heterologously expressed-MCshowed no obvious toxic effect on tobacco leaf cells, which were kept intact. Additionally, following the heterologous expression of-MC in, TMV-GFP was inoculated. After 48 hours, there was no green fluorescence observed in the-MC expressed leaves under UV light, but the green fluorescence could be observed in the control group. After 72 hours, sporadic green fluorescence was observed in the treatment group and the fluorescence in the control group started to spread. After 6 days, the green fluorescence spread to the spear leaf of the control group, while no obvious change was found in that of the treatment group. ELISA assay results showed that after 6 days of TMV-GFP inoculation, the value of OD492in the control group was over 10 times more than the value of samples under treatment. qRT-PCR data showed that the expression level of TMV in control group was 149 times than that of the level in group after treatment. Those data indicate that-MC has a significant impact on both replication and movement of TMV. The expression levels of several defense-related genes inleaves expressing-MC with or without TMV were tested through qRT-PCR. Data showed thatwas induced in both cases while the expression level was 2.5 times in plant with TMV injection than the one without injection. As toand, the expression of these two genes was 5-7 times higher in plants with TMV injection. Combining all those data together, it was suggested that the resistance effect of heterologously expressed-MC on plant viruses could induce the expression of responsive defense-related genes including,and, resulting in much stronger plant defense response. 【Conclusion】The heterologously expressed-MC significantly inhibited TMV, activated the plant defense response, enhanced the defense response of, and produced few toxicity to the plant cells. Therefore, the results will provide a reference for the development of new products for the control of plant viruses based on heterologous expression of-MC.

ribosome-inactivating proteins;-momorcharin;(TMV); heterologous expression; subcellular localization; defense-related genes

2016-11-01；接受日期：2016-11-30

國(guó)家自然科學(xué)基金（31670148）、重慶市社會(huì)事業(yè)與民生保障創(chuàng)新專項(xiàng)（cstc2015shms-ztzx80012）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（XDJK2016A009，2362015xk04）

魏周玲，E-mail：13618216564@163.com。 通信作者孫現(xiàn)超，E-mail：sunxianchao@163.com