云南萬壽菊葉斑病病菌生物學(xué)特性及其抑菌藥劑研究

魯海菊+徐聰梅+李河

摘要：以萬壽菊葉斑病病菌WY1為供試菌株，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定不同培養(yǎng)基、碳源、氮源、溫度、酸堿度、光照和濕度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響，并在室內(nèi)篩選有效抑菌藥劑。結(jié)果表明：該病原菌最佳培養(yǎng)條件為玉米瓊脂培養(yǎng)基，以葡萄糖為碳源，甘氨酸為氮源，最適溫度為25 ℃，最佳pH值為10，全光照，最適濕度范圍為50%～60%。58%甲霜·錳鋅可濕性粉劑和50%異菌脲可濕性粉劑抑菌效果較好，抑制率達(dá)100%。此結(jié)論可為云南萬壽菊葉斑病的防治提供一定的科學(xué)理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：萬壽菊；葉斑病；生物學(xué)特性；藥劑篩選；生長(zhǎng)速率法

中圖分類號(hào)： S436.8+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）11-0157-03

萬壽菊（Tagetes erecta）是一種適應(yīng)性廣的草本花卉，花中的天然色素可廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥等領(lǐng)域[1]。萬壽菊原產(chǎn)于墨西哥[1]，現(xiàn)已廣泛種植于世界各地。在我國(guó)的北京、吉林、甘肅、湖北、云南等地均已有大面積栽種，但各產(chǎn)區(qū)都受到萬壽菊葉斑病的嚴(yán)重危害。據(jù)報(bào)道，萬壽菊葉斑病病原菌共有6種：百日菊細(xì)極鏈格孢（Alternaria zinniae）[2]、萬壽菊鏈格孢（A. tagetica）[3-6]、蕓臺(tái)鏈格孢（A. brassicae）[7]、鏈格孢（A. alternata）[8]、石竹鏈格孢（A. gypsophilae）[9]、細(xì)極鏈格孢（A. tenuissima）[10]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，云南省萬壽菊葉斑病是由蕓薹生鏈格孢（A. brassicicola）引起[11]，其病原菌與其他地區(qū)的報(bào)道均不一致，有必要對(duì)其生物學(xué)特性及殺菌劑進(jìn)行系統(tǒng)研究，進(jìn)而為有效防治此病害提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

從云南省蒙自市鳴鷲鎮(zhèn)萬壽菊種植基地采集癥狀典型的萬壽菊葉斑病病葉，采用常規(guī)組織分離和單孢分離法進(jìn)行分離純化[12]，獲得的菌株（WY1）于斜面培養(yǎng)基上低溫（4 ℃）保存。

1.2 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖16 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 000 mL；馬鈴薯蔗糖（PSA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、蔗糖16 g、瓊脂粉 20 g、蒸餾水1 000 mL；玉米瓊脂（MA）培養(yǎng)基：玉米30 g、瓊脂粉17 g、蒸餾水1 000 mL；小麥瓊脂（WA）培養(yǎng)基：小麥30 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水 1 000 mL；胡蘿卜瓊脂（CA）培養(yǎng)基：胡蘿卜200 g、瓊脂粉 20 g、蒸餾水1 000 mL；察氏（CM）培養(yǎng)基：硝酸鈉2 g、磷酸二氫鉀1 g、氯化鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸鐵0.01 g、蔗糖 30 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 000 mL。上述培養(yǎng)基配制好后均于121 ℃高壓滅菌25 min。

1.3 試劑

碳源（可溶性淀粉、α-乳糖、麥芽糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖醇、D-甘露醇）、氮源（硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸、尿素），0.1% HCl、0.1% NaOH溶液。試劑均為分析純。

1.4 供試殺菌劑

58%甲霜·錳鋅可濕性粉劑、50%多菌靈可濕性粉劑、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑、75%百菌清可濕性粉劑、50%異菌脲可濕性粉劑、6%春雷霉素可濕性粉劑，上述材料均購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)及試劑公司。

1.5 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

將其病菌在PDA平板培養(yǎng)基中，25 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)7 d，在培養(yǎng)基同一半徑周圍用打孔器取直徑為5 mm的菌塊，同時(shí)接種于PDA、CM、MA、WA、CA 5種培養(yǎng)基平板中央，設(shè)3次重復(fù)，在25 ℃下恒溫培養(yǎng)7 d，十字交叉法測(cè)定菌落直徑[10]。

1.6 不同碳源、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

以察氏（Czapek-Dox Medium）培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用相等質(zhì)量分?jǐn)?shù)的碳（可溶性淀粉、α-乳糖、麥芽糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖醇、D-甘露醇）和氮（硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸、尿素）替換蔗糖和硝酸鈉，設(shè)不加碳、氮為對(duì)照[10]，接種及測(cè)量方法同“1.5”節(jié)。

1.7 不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

以PDA為供試培養(yǎng)基，接種后分別在10、15、20、25、30、35、40 ℃下恒溫培養(yǎng)[10]，接種及測(cè)量方法同“1.5”節(jié)。

1.8 不同pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

以PDA為供試培養(yǎng)基，分別用0.1%鹽酸及0.1%氫氧化鈉溶液將pH值調(diào)至3、4、5、6、7、8、9、10[10]，接種及測(cè)量方法同“1.5”節(jié)。

1.9 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

以PDA為供試培養(yǎng)基，接種后分別在光暗交替（12 h-12 h）、全黑暗和全光照3種光處理下培養(yǎng)[10]，接種及測(cè)量方法同“1.5”節(jié)。

1.10 不同濕度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

用步驟“1.5”的方法將其病菌接種于PDA培養(yǎng)基平板中央，分別在濕度為50%、60%、70%、80%、90%、100%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d[10]，測(cè)量方法同“1.5”節(jié)。

1.11 藥敏性測(cè)定

將58%甲霜·錳鋅、50%多菌靈、70%甲基硫菌靈、75%百菌清、50%異菌脲、6%春雷霉素6種可濕性粉劑殺菌劑按照使用說明上的濃度配成PDA含藥營(yíng)養(yǎng)液后，倒平板，將葉斑病菌菌塊接種于平板中央，設(shè)不加藥液的PDA平板為對(duì)照，培養(yǎng)7 d后，測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算6種藥劑對(duì)菌落生長(zhǎng)的抑制率[13]，接種及測(cè)量方法同“1.5”節(jié)。

抑制率=[（dCK-dB）/dCK]×100%。

式中：dCK、dB分別表示對(duì)照、處理病原菌菌落直徑（mm）。

1.12 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，處理間的差異顯著性采用Duncans多重比較法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

由表1可知，供試菌株WY1在5種培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，且具有較強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)適應(yīng)性，說明供試菌株對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件的要求并不是很嚴(yán)格，但對(duì)5種培養(yǎng)基的利用效果有所差異。經(jīng)Duncans多重比較，供試菌株在5種培養(yǎng)基上的菌落直徑差異極顯著，其中，在玉米瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢；在其余3種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)由強(qiáng)到弱順序?yàn)椋汉}卜瓊脂培養(yǎng)基>小麥瓊脂培養(yǎng)基>察氏培養(yǎng)基。

2.2 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

由表2可知，供試菌株WY1在7種不同碳源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，菌落直徑均大于無碳對(duì)照。經(jīng)Duncans多重比較，可溶性淀粉和木糖醇2個(gè)處理間的菌落直徑差異不顯著，D-甘露醇和α-乳糖2個(gè)處理間的菌落直徑差異也不顯著，說明在可溶性淀粉和木糖醇2種碳源中菌絲生長(zhǎng)一致，在 D-甘露醇和α-乳糖2種碳源中菌絲生長(zhǎng)也一致。其余各碳源處理之間菌落直徑差異極顯著。其中，葡萄糖最佳，麥芽糖最差；在其余碳源培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)由強(qiáng)到弱順序?yàn)椋菏罄钐?gt;可溶性淀粉=木糖醇>D-甘露醇=α-乳糖。

2.3 不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

由表3可知，供試菌株WY1在3種無機(jī)氮源和5種有機(jī)氮源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，但對(duì)8種氮源的利用效果不同。經(jīng)Duncans多重比較， 在甘氨酸和蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落直徑均極顯著高于無氮對(duì)照，對(duì)供試菌株具有促生長(zhǎng)的作用，而且促進(jìn)作用前者高于后者。尿素、牛肉膏及無氮對(duì)照三者間的菌落直徑差異不顯著，說明尿素和牛肉膏的加入對(duì)菌落生長(zhǎng)無顯著影響。其余4種氮源與無氮對(duì)照差異極顯著，且四者對(duì)菌落的生長(zhǎng)均有抑制作用，抑制順序由強(qiáng)到弱為：磷酸二氫銨>硫酸銨>硝酸銨>酵母膏。

2.4 不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

由表4可知，供試菌株WY1在10～35 ℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)。經(jīng)Duncans多重比較，各溫度處理間的菌落直徑差異極顯著。在10～25 ℃范圍內(nèi)，溫度越高菌落直徑越大，25 ℃ 時(shí)菌落直徑達(dá)到最大值，30、35 ℃菌落直徑小于25 ℃，40 ℃時(shí)菌落直徑為0.00 mm，說明25 ℃為供試菌株生長(zhǎng)最佳溫度。

2.5 不同pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

由表5可知，供試菌株WY1在pH值3～10范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)。pH值為10時(shí)與其余處理間菌落直徑差異極顯著，且菌落直徑最大，說明pH值=10為最佳酸堿度值。pH值=6、8、9等3個(gè)處理間菌落直徑差異均不顯著，其余處理間菌落直徑差異極顯著，說明偏堿環(huán)境有利于供試菌株生長(zhǎng)。

2.6 不同光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

由表6可知，供試菌株WY1在3種光照條件下均能生長(zhǎng)。經(jīng)Duncans多重比較，全光照與其余2種處理間菌落直徑差異極顯著，且菌落直徑最大，說明全光照有利于其生長(zhǎng)。光暗交替與全黑暗處理差異不顯著，二者菌落直徑較一致。

2.7 不同濕度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

由表7可知，供試菌株WY1在濕度50%～100%范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)。經(jīng)Duncans多重比較，在濕度50%、60%的2個(gè)處理間菌落直徑差異不顯著，但與其余處理差異極顯著，且菌落直徑最大。說明供試菌株最適合的濕度范圍在50%～60%，超出此范圍，病原菌的生長(zhǎng)受到抑制。

2.8 萬壽菊葉斑病菌的藥敏性

由表8、圖1可知，6種藥劑對(duì)供試菌株WY1的抑制作用不同。在58%甲霜·錳鋅可濕性粉劑和50%異菌脲可濕性粉劑的培養(yǎng)基中菌落直徑差異不顯著，但與其余處理間差異極顯著，病原菌均不能生長(zhǎng)，抑制率達(dá)到100%。50%多菌靈可濕性粉劑、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑和6%春雷霉素3種藥劑之間菌落直徑差異不顯著，但與其余處理間差異顯著，抑制率在16%左右。75%百菌清可濕性粉劑中菌落直徑與其余5種藥劑差異極顯著，抑制率為60.82%。說明抑菌效果較好的藥劑為58%甲霜·錳鋅和50%異菌脲可濕性粉劑。

3 討論

該病原菌WY1菌株生物學(xué)特性研究表明，最適培養(yǎng)基為玉米粉，最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為甘氨酸，最適溫度為 25 ℃，最佳pH值為10，全光照，最適濕度范圍為50%～60%。這與吳新穎等研究報(bào)道有一致的地方，也有不一致之處[9，13，10]。導(dǎo)致生物學(xué)特性差異的最主要原因是病原菌所屬的種不同。供試菌株WY1為蕓薹生鏈格孢（A. brassicicola）[11]，吳新穎報(bào)道的為石竹鏈格孢（A. gypsophilae）[9]，王婷等報(bào)道的為細(xì)極鏈格孢（A. tenuissima）[10]。3個(gè)種生物學(xué)特性一致之處是25 ℃為最適生長(zhǎng)溫度，25 ℃～30 ℃范圍內(nèi)適宜菌絲生長(zhǎng)。吳新穎報(bào)道麥芽糖為最佳碳源[9]，而我們的結(jié)論是麥芽糖利用最差。王婷等對(duì)碳源和氮源沒有進(jìn)行研究[10]。吳新穎報(bào)道pH值6.27～7.00最適宜生長(zhǎng)及產(chǎn)孢[9]，王婷等報(bào)道pH值4.96～7.00最適宜生長(zhǎng)，pH值6.04～8.01最適宜產(chǎn)孢[10]。本試驗(yàn)研究的WY1菌株菌絲生長(zhǎng)最適合pH值為10，很難在培養(yǎng)第7天產(chǎn)孢。該菌株最適合的產(chǎn)孢條件有待進(jìn)一步研究。

另外，在室內(nèi)藥劑篩選方面，50%異菌脲可濕性粉劑對(duì)WY1菌株抑制效果最好，抑制率達(dá)100%，75%百菌清可濕性粉劑效果較好，抑制率為60.82%，這與吳新穎等的研究結(jié)果[9，13]一致。58%甲霜·錳鋅可濕性粉劑對(duì)WY1菌株抑制效果也最好，抑制率達(dá)100%，這與王龍的研究結(jié)果[13]不一致。出現(xiàn)差異的最主要原因是病原菌所屬的種不同，其次是各地區(qū)病原菌的抗藥性不同。說明鏈格孢屬不同種引起的萬壽菊葉斑病，選用的防治藥劑應(yīng)有所不同。6—7月是萬壽菊鮮花成熟期，也剛好是云南高溫高濕期，因此，提前做好預(yù)防措施是很有必要的，盡量少施或不施含甘氨酸的化肥，可施其他對(duì)該病原菌有抑制作用的化肥（如磷酸二氫銨類化肥），發(fā)病高峰期施用58%甲霜·錳鋅和50%異菌脲可濕性粉劑，為了避免抗藥性的產(chǎn)生，可選用75%百菌清可濕性粉劑混配使用。本研究?jī)H做了室內(nèi)藥劑篩選試驗(yàn)，今后還應(yīng)結(jié)合田間試驗(yàn)示范來制定相應(yīng)的防治措施。

參考文獻(xiàn)：

[1]宮 力. 萬壽菊的經(jīng)濟(jì)用途[J]. 中國(guó)花卉園藝，2001（23）：31.

[2]Edward J C. Leaf and infloreseenees blight of Tagetes erectal（Marigold）caused by Alternaria zinnia[J]. Sicence and Culturation，1957，22：683-684.

[3]Shome S K，Mustafce T P. Alternaria tagetica sp. nov. causing blight of Marigold（Tagetes sp.）[J]. Current Science，1966，35（14）：370-371.

[4]Tomioka K，Toyozo S，Koganezawa H. Marigold leaf spot caused by Alternaria tagetica new to Japan[J]. Journal of General Plant Pathology，2000，66（4）：294-298.

[5]Singh P J，Singh P，Dhindsa G S，et al. Efficacy of systemic and non-systemic fungicides against leaf spot（Alternaria tagetica）of Marigold[J]. Indian Phytopathology，2006，59（1）：118-119.

[6]高 山，王孟飛，胡 平，等. 基于ITS序列對(duì)萬壽菊葉斑病病原菌的分子鑒定[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（9）：2074-2076.

[7]Mukadam D S，Deshpande K B. Role of light and temperature on growth sporulation and subsequent spore germinatility of Alternaria brassicae（Berk）Sacc[J]. Science and Culture，1979，45：244-246.

[8]Li Y，Shen J，Pan B H，et al. First report of leaf spot caused by Alternaria alternata on marigold（Tagetes erecta）in Beijing，China[J]. Plant Disease，2014，98（8）：1153.

[9]吳新穎. 萬壽菊鏈格孢葉斑病研究[D]. 長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

[10]王 婷，王 龍，王生榮. 萬壽菊葉斑病病原鑒定及其生物學(xué)特性研究[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45（3）：66-68.

[11]魯海菊，潘柳君，李 河，等. 云南萬壽菊葉斑病病原菌的鑒定與ITS序列分析[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，24（6）：116-119.

[12]方中達(dá). 植病研究法[M]. 3版. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998：57-125.

[13]王 龍. 萬壽菊葉斑病病原鑒定及藥劑防治研究[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.