核輸出蛋白在流感病毒感染與傳播中的作用

方迪　郭潮潭

[摘要] 核輸出蛋白（NEP）是一個由甲型流感病毒第8段基因編碼的約為14 kD的蛋白。NEP最初被認為參與病毒核糖核蛋白復合體的出核。相對于流感病毒的其他幾個蛋白，關(guān)于NEP的研究很少被報道。近年來，隨著蛋白立體結(jié)構(gòu)的確定、研究的不斷深入，NEP在流感病毒活動中很多意想不到的作用不斷被發(fā)現(xiàn)。這些研究顯示NEP參與病毒的轉(zhuǎn)錄和復制，促進H5N1禽流感病毒在哺乳動物體內(nèi)的適應以及參與病毒的出芽。本文系統(tǒng)總結(jié)了NEP的功能，包括參與病毒核糖核蛋白復合體的出核的過程、調(diào)節(jié)病毒聚合酶的活性以及幫助H5N1禽流感病毒實現(xiàn)跨種間傳播等，為進一步研究NEP奠定基礎。

[關(guān)鍵詞] 流感病毒；核輸出蛋白；蛋白結(jié)構(gòu)；生物特性

[中圖分類號] R511.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）01（c）-0035-05

[Abstract] Nuclear export protein （NEP） is a protein encoded by segment eight of influenza A virus， about 14 kD. NEP was originally implicated in mediating the nuclear export of viral ribonucleoprotein complexes. In contrast to other influenza virus proteins， NEP studies are rarely reported. Since then， with the determination of protein structure and the deepening of research， many unexpected roles for NEP during the influenza virus life cycle have begun to be discovered. These recent studies have shown NEP to be involved in regulating viral transcription and replication， facilitating the adaptive processes of avian H5N1 influenza viruses in the mammalian hosts and efficiently releasing budding virions. The paper reviews the function of NEP that mediating the nuclear export of viral ribonucleoprotein complexes， regulating the viral polymerase activity and facilitating the inter-species transmissions of avian H5N1 influenza viruses etc.， which provides a basis to further study.

[Key words] Influenza virus； Nuclear export protein； Protein structure； Biological properties

流感病毒屬于正黏病毒科，是引起世界流感大流行的主要病原體，可以引起人畜共患的疾病。甲型流感病毒可以通過抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換，不斷地進行變異來逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，且目前使用的抗流感藥物和疫苗都具有局限性，無法從根本上來解決問題。隨著對流感病毒新靶點的尋找，核輸出蛋白（NEP）越來越被人們所了解和重視。本文主要對NEP的研究進行歸納和總結(jié)，希望能對流感病毒本身和抗流感病毒的研究提供幫助。

1 NEP的概況

甲型流感病毒的基因組是由8段負鏈RNA組成，一般可以編碼17種不同的病毒蛋白，某些毒株可能存在18種不同的病毒蛋白[1]。NEP是流感病毒NS基因編碼的4種蛋白之一[1-2]。NEP是前體mRNA剪接后的翻譯產(chǎn)物，只有121個氨基酸組成，主要參與新生病毒核糖核蛋白（viral ribonucleoproteins，vRNPs）復合體的出核。NEP最初被認為只存在被感染的細胞中，結(jié)構(gòu)也沒有確定，故命名為NS2（non-structural protein 2），直到1991年Richardson等[3]在純化的病毒顆粒中找到了NS2蛋白，被證明是一種病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，而后O'Neill等[4]發(fā)現(xiàn)在細胞核內(nèi)新合成的vRNPs在出核的過程中NS2蛋白起到了關(guān)鍵性作用，所以重新命名為NEP（nuclear export protein）。NEP與宿主之間存在著緊密的聯(lián)系，通過酵母雙雜交實驗已經(jīng)證明至少存在39種與NEP存在相互作用的宿主蛋白[5-6]。宿主通過自身蛋白與NEP的直接作用來影響流感病毒的生命周期，同時病毒也可以通過NEP與宿主蛋白的作用來影響細胞的生長發(fā)育、代謝等生命活動。

2 NEP的蛋白結(jié)構(gòu)

如圖1所示，NS基因是流感病毒的第8段基因，全長約890個核苷酸，主要負責編碼NEP和NS1蛋白，某些病毒株還能編碼NSP和NS3蛋白[7-8]。流感病毒的轉(zhuǎn)錄在細胞核中進行，在轉(zhuǎn)錄過程中利用細胞的pre-mRNA的5'帽子結(jié)構(gòu)來作為病毒轉(zhuǎn)錄的引物[9]，然后病毒mRNA進入胞質(zhì)借助細胞的翻譯系統(tǒng)來合成病毒蛋白。NS基因可直接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生NS1 mRNA，NS1 mRNA上存在著剪接供位和剪接受位，在真核細胞內(nèi)經(jīng)RED-SMU1剪接體作用后切去一段472個核苷酸長度的內(nèi)含子生成NEP-mRNA[10-11]，接著進入胞質(zhì)合成NEP。

NEP由121個氨基酸組成（圖2）。人為條件下用蛋白酶對NEP進行水解，NEP可分為對蛋白酶敏感的N端（第1～53位氨基酸殘基）和對蛋白酶耐受的C端（第54～121位氨基酸殘基）[12]。C端由兩個α螺旋組成，即C1（第64～85位氨基酸殘基）和C2（第94～115位氨基酸殘基），中間由小彎鏈接，形成反向平行的螺旋發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這個結(jié)構(gòu)使得C末端具備了既親水又疏水的兩性特征[12]。第78位存在著一個色氨酸殘基，周圍圍繞著多個谷氨酸殘基，這些谷氨酸殘基可以和M1蛋白的核定位信號（nuclear localization signal，NLS）序列產(chǎn)生靜電作用，對于NEP參與vRNPs的出核活動非常重要[13]。雖然對N端的結(jié)構(gòu)還不是很清楚，通過其他實驗已經(jīng)證明蛋白的出核信號（nuclear export signal，NES）序列存在于蛋白的N端[14-15]。近年來，NEP的翻譯后修飾也越來越被人們所重視，如包括NEP在內(nèi)的多種病毒蛋白都會受到細胞的類泛素化修飾；NEP可以通過磷酸化來調(diào)節(jié)自身的功能等[16-17]。

3 NEP的生物特性

3.1 NEP促進vRNPs的出核

如圖3所示，促進vRNPs的出核是NEP的主要生物功能。流感病毒的RNA以vRNPs復合體的形式存在，vRNPs復合體由病毒RNA、NP蛋白和三種病毒聚合酶（PB1、PB2和PA）共同組成，vRNP的分子量很大，不能直接通過細胞核的核孔[18]，需要在NEP、M1和宿主蛋白的共同作用下運輸?shù)桨|(zhì)。類似于NEP的功能，首先見于對HIV-1的Rev蛋白的研究，Rev蛋白主要負責介導病毒mRNA的出核[19]。Rev蛋白上有NES序列[19]，它能被出核受體蛋白Crm1蛋白（chromosome region maintenance 1 protein）所識別[20]。Crm1蛋白屬于karyopherin-β（Kapβ）受體家族，是細胞內(nèi)最主要的出核受體蛋白，負責核質(zhì)之間的蛋白和RNA的轉(zhuǎn)運，Crm1蛋白能特異地識別靶蛋白上的NES序列并與其結(jié)合，由它負責轉(zhuǎn)運的蛋白多達數(shù)百種[21]。不過與Rev蛋白相比，NEP的NES序列的發(fā)現(xiàn)經(jīng)歷了一個相對漫長的過程，第一個序列被證明距第二個序列被證明相差了十多年，NES1序列為12ILLRMSKMQL21（A/PR8/34）[4]，NES2序列為31MIT QFESLKL40（A/PR8/34）[15]，這兩個NES序列都位于蛋白的N端，NEP通過N端的NES序列與Crm1蛋白相結(jié)合。HIV-1的mRNA存在一段Revresponseelement序列可以和Rev蛋白相結(jié)合，形成Crm1-Rev-mRNA三聚體，HIV-1的mRNA組成復合體從胞核運輸?shù)桨|(zhì)[22]，在胞質(zhì)中合成病毒蛋白。與Rev蛋白不同的是，NEP運輸vRNPs并不是直接和vRNA作用，這中間還有M1蛋白的參與。M1蛋白的C端可以直接和vRNP中的NP蛋白和vRNA相互作用[22]，N端存在NLS序列，101RKLKR105，在與NEP的結(jié)合中起到關(guān)鍵作用，對其中的4個氨基酸進行突變后會大大減弱與NEP的結(jié)合力[9]。NEP的C端除了與M1蛋白結(jié)合外還存在PB1和PB2蛋白的結(jié)合位點，NEP與病毒聚合酶的作用增加了這個復合體的穩(wěn)定性，所以vRNP-M1-NEP-Crm1復合體并不是一個簡單的串聯(lián)體[23]。當vRNP-M1-NEP-Crm1出核復合體到達核周時，Crm1蛋白可以和核孔復合物上的多種核孔蛋白相互作用，通過出核復合體和核孔蛋白的作用將vRNP-M1-NEP復合體從核質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)，完成vRNPs的出核[24-25]。當然要順利完成vRNPs出核還需要其他細胞因子的參與，如RanGAP1、RanGTP、RanBP3等[26]。宿主蛋白AIMP2在vRNPs的出核過程中與NEP也存在著相互作用，AIMP2是一種腫瘤抑制因子，NEP可以保護AIMP2逃避泛素介導的蛋白降解，而AIMP2又可使M1蛋白的泛素化修飾轉(zhuǎn)為類泛素化修飾，讓M1蛋白變得更加穩(wěn)定[27]，NEP通過與AIMP2的作用保護了M1蛋白，促進了vRNPs的出核。Hu等[28]還發(fā)現(xiàn)NEP通過NES1序列與CHD3（Chromodomain helicase-DNA-binding protein 3）相互作用來促進vRNP的出核。隨著NEP相關(guān)研究的逐漸進展，會有越來越多有關(guān)vRNPs出核的宿主因子被發(fā)現(xiàn)。

3.2 NEP調(diào)節(jié)病毒的轉(zhuǎn)錄和復制

多個研究報道提示NEP也參與病毒的轉(zhuǎn)錄和復制。NEP除了在介導vRNPs出核中充當適配器的作用外，同時也是病毒聚合酶輔因子。NEP的C端存在著能與PB1和PB2蛋白結(jié)合的位點，NEP通過與PB1和PB2蛋白的相互作用參與調(diào)節(jié)病毒的轉(zhuǎn)錄和復制[23]。在人感染H5N1禽流感病毒中，NEP第16位氨基酸變異（M16I），使得禽流感病毒能適合人感染，提示NEP也參與禽流感跨種間傳播和感染[29]。禽流感病毒的某些基因（如PB2-E627K）發(fā)生突變使得禽流感病毒在哺乳動物細胞內(nèi)也具有較高的復制能力，從而打破種間屏障傳播感染人類[30]。Mnz等[29]發(fā)現(xiàn)存在一部分人源性H5N1流感病毒仍然保留了第627位的谷氨酸（PB2-E627），而它的NEP一般會有相應的適應性突變，如M16I，突變后的NEP能更有效地提高聚合酶活性來補償PB2蛋白，以此來滿足H5N1流感病毒在哺乳動物細胞內(nèi)進行復制的要求。后面，Reuther等[31]通過實驗證明突變（M16I）后的NEP的分子結(jié)構(gòu)更適合流感病毒在哺乳動物細胞內(nèi)進行復制。NEP一般可以通過N端與C端的相互作用形成一個折疊狀態(tài)的分子，并且這種分子內(nèi)的折疊又與溫度有關(guān)，一般在較低溫度下NEP更傾向于折疊且折疊狀態(tài)會更加穩(wěn)定[31]。流感病毒在人類的感染部位以上呼吸道為主，而禽鳥以消化腸道為主，人類上呼吸道溫度較低（32～34℃），而禽類消化道的溫度較高（39～41℃）。突變（M16I）后的NEP在低溫環(huán)境中更耐受，使得不那么容易形成折疊狀態(tài)。在未折疊的狀態(tài)下，蛋白的C端可以用來和PB1、PB2蛋白相互作用，刺激病毒聚合酶，提高病毒的復制能力，使得流感病毒可以在哺乳動物細胞內(nèi)進行復制，破除種間屏障[31]。不過NEP提高病毒聚合酶活性的特性也不是絕對的，低濃度的NEP雖然可以刺激病毒聚合酶的活性，但高濃度的NEP也會反過來抑制病毒的復制[29-32]。對NEP功能的研究還只是處于起步階段，闡明NEP調(diào)節(jié)病毒轉(zhuǎn)錄和復制的機制還需要更多的實驗來證明。

3.3 NEP參與病毒的出芽

NEP參與病毒出芽也是NEP的主要功能之一[33]。NEP可以同宿主蛋白相互作用來影響流感病毒的出芽。NEP和細胞膜上F1Fo-ATPase的β亞基存在著作用，而F1Fo-ATPase的ATP酶活性在流感病毒出芽的過程中起到了很重要的作用[33]。王朝霞等[34]利用反向遺傳技術(shù)獲得的NEPE67SPR8突變病毒株在雞胚增殖后，不論是病毒的效價還是HA的表達量都有明顯的提升。另一個研究發(fā)現(xiàn)PR8毒株的NEPK86R突變同樣可以加速病毒顆粒的形成，突變后的NEP并不改變vRNPs的出核及病毒的轉(zhuǎn)錄和復制[35]，其機制可能與突變后的NEP與宿主的F1Fo-ATPase、FoB和F1β這三個因子的相互作用增強有關(guān)，從而促進了病毒顆粒的形成。

3.4 NEP參與細胞信號轉(zhuǎn)導

流感病毒被發(fā)現(xiàn)與細胞內(nèi)的多條信號通路有關(guān)系，其中被研究的最多的是Raf/MEK/ERK信號通路[36-38]。當細胞感染流感病毒以后會激發(fā)細胞內(nèi)的Raf/MEK/ERK信號通路，Raf/MEK/ERK信號通路的激發(fā)會引起很多效應，如TNF-α的大量表達，TNF-α被認為是一種具有抗流感病毒作用的細胞因子[36]。流感病毒感染會激發(fā)細胞內(nèi)的Raf/MEK/ERK信號通路，反過來抑制Raf/MEK/ERK信號通路會導致NEP失去功能，vRNPs在核內(nèi)大量滯留[37]。轉(zhuǎn)染了NEP的細胞TNF-α的mRNA和蛋白表達水平有很明顯的提升，可能與NEP涉及Raf/MEK/ERK信號通路有關(guān)[38]。NEP與Raf/MEK/ERK信號通路的具體關(guān)系到目前還不是很清楚。

4 展望

甲型流感病毒流行一百余年，至今尚未徹底征服，且每年冬春都會流行，奪去數(shù)以萬計的生命。流感的預防還是以接種疫苗為主，治療以M1離子通道抑制劑（金剛胺類）和NA抑制劑（達菲類）藥物為主。然后因流感病毒容易變異使得疫苗預防沒有達到應有的作用，藥物也出現(xiàn)耐藥，治療效果不理想。也有報道藥物出現(xiàn)副作用，如達菲（奧司他韋）是目前最廣泛使用的抗流感藥物，但服用達菲有時會出現(xiàn)一些精神方面的癥狀[39]，而且病毒抗藥性的出現(xiàn)也使得傳統(tǒng)抗流感藥物的作用越來越有限[40]。隨著NEP生物特性的不斷呈現(xiàn)，NEP作為抗病毒藥物的靶點也越來越受到重視。如上面提到流感病毒在細胞內(nèi)的活動和細胞的信號通路有關(guān)，Haasbach等[41]聯(lián)合奧司他韋和MEK抑制劑在抗甲型流感病毒的體外實驗中取得了不錯的效果。NEP在流感病毒中扮演著重要的角色，同時也和細胞的信號通路有著密切聯(lián)系，發(fā)明一種以NEP為新靶點的新型抗流感藥物來對付一部分耐藥的流感病毒具有很大的潛力。又如對NEP的改造[31，34-35]，使得病毒對穩(wěn)定敏感，得到低溫培養(yǎng)毒株，或是對改良流感疫苗的開發(fā)，也有啟明作用。

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（收稿日期：2016-11-01 本文編輯：張瑜杰）