經(jīng)血寧膠囊凝血作用的藥效學(xué)研究

唐耀輝　楊捷　謝金鮮

[摘要] 目的 探討經(jīng)血寧膠囊的凝血作用及其機制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。 方法 采用隨機數(shù)字表法將60只實驗小鼠及30只新西蘭兔隨機分為5組，即空白組、陽性組、經(jīng)血寧膠囊高劑量組（JXN-H組）、中劑量組（JXN-M組）、低劑量組（JXN-L組），連續(xù)灌胃給藥1周，每天給藥1次。末次給藥后1 h，測定實驗小鼠凝血時間（CT）、新西蘭兔凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）、纖維蛋白原（FIB）和血漿復(fù)鈣時間（PRT）。 結(jié)果 經(jīng)血寧膠囊能顯著縮短小鼠凝血時間，JXN-H組、JXN-M組與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；經(jīng)血寧膠囊各給藥組顯著縮短家兔PT、APTT、TT、PRT，提高血漿FIB含量，與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 經(jīng)血寧膠囊具有顯著的凝血作用。

[關(guān)鍵詞] 經(jīng)血寧膠囊；凝血作用；藥效學(xué)

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）01（c）-0008-04

[Abstract] Objective To investigate the coagulation function and mechanism of Jingxuening Capsules， and to provide scientific basis for its clinical utility. Methods Sixty experimental mice and 30 New Zealand rabbits were randomly divided into five groups by random number table， namely blank control group， positive control group， high dose of Jingxuening Capsules group （JXN-H group）， middle dose group （JXN-M group） and low dose group （JXN-L group）. Intragastric administration for one weeks， one hour after the last administration， clotting time （CT）， prothrombin time （PT）， activated partial thromboplastin time （APTT）， thrombin time （TT）， fibrinogen （FIB） and plasma recalcification time （PRT） of each group were tested. Results Jingxuening Capsules could significantly shorten the clotting time in mice， compared with blank group， JXN-H group and JXN-M group showed significant differences （P < 0.05）. All medication administration groups of Jingxuening Capsules could shorten CT， PT， APTT， TT， PRT in New Zealand rabbits， and increase the content of FIB significantly （P < 0.05 or P < 0.01） compared with the blank group. Conclusion Jingxuening Capsules have marked coagulation function in vivo.

[Key words] Jingxuening Capsules； Coagulation function； Pharmacodynamics

經(jīng)血寧膠囊是由白背葉和扶芳藤的提取成分組成。白背葉（Mallotus apelta）為大戟科野桐屬植物的干燥葉，其性平、微苦、澀，歸肝、脾經(jīng)，具清熱解毒、祛濕止血之功，可用于慢性肝炎、白帶、濕疹、跌打損傷、外傷出血等[1]。扶芳藤（Enonymus fortunei）系衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬植物，文獻記載其具有緩解腰肌勞損、補腎強筋、安胎、止血消癖等功效[2]。本研究通過觀察小鼠凝血時間、家兔凝血四項及血漿復(fù)鈣時間在經(jīng)血寧膠囊干預(yù)后的變化，研究經(jīng)血寧膠囊的凝血作用，并探討其可能的作用機制，為其進一步開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

經(jīng)血寧膠囊由廣西中醫(yī)學(xué)院制藥廠科研所提供（批號：20110402），所需藥材白背葉及扶芳藤由廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院苑敏教授鑒定，經(jīng)鑒定分別為大戟科野桐屬植物白背葉[Mallotus apelta（Lour.）Muell.-Arg.]的葉和衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬常綠藤本灌木扶芳藤[Euonymus fortunei（Turcz.）Hand.-Mazz]的帶葉莖枝，藥材性狀均符合2015年版《中國藥典》一部規(guī)定。

1.2 試劑

凝血酶原試劑盒（北京萊博生物實驗材料研究所，批號20105090）；活化部分凝血活酶時間（APTT）試劑盒（北京萊博生物實驗材料研究所，批號20111021）；凝血酶時間（TT）試劑盒（北京萊博生物實驗材料研究所，批號20111027）；纖維蛋白原（FIB）試劑盒（北京萊博生物實驗材料研究所，批號20110131）；氯化鈣（北京萊博生物實驗材料研究所，批號20111013）；枸櫞酸鈉（廣東達濠精細化學(xué)品公司，批號20110323）；云南白藥（云南白藥集團股份有限公司，批號20110629）；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 實驗動物

SPF級5周齡昆明種小鼠60只，雌雄不拘，體重18～22 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，使用許可證號：SCXK（桂）2011-0002；4月齡新西蘭兔30只，雌雄不拘，體重1.7～2.0 kg，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，使用許可證號SYXK（桂）2003-0001；實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，自由攝食飲水，動物房溫度（24±2）℃，相對濕度（50±10）%，光照循環(huán)為12 h明/12 h暗。

1.4 實驗儀器

Sysn ECA-150型全自動血液凝固儀（日本東亞醫(yī)用電子儀器有限公司）；Sysnex KX-21型血細胞分析儀（日本東亞醫(yī)用電子儀器有限公司）；TU-1901型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；萬分之一電子天平，型號EL-204，（梅特勒-托利多儀器有限公司）；80-2臺式低速離心機（上海手術(shù)器械廠）；微量移液器（大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 經(jīng)血寧膠囊對凝血時間（CT）的影響（毛細血管法）[3] 將60只健康昆明種實驗小鼠隨機分為空白組、陽性組、經(jīng)血寧膠囊高劑量組（JXN-H組）、經(jīng)血寧膠囊中劑量組（JXN-M組）和經(jīng)血寧膠囊低劑量組（JXN-L組）5個組，每組12只。空白組給予等容積生理鹽水，陽性組給予云南白藥1 g/kg，JXN-H組、JXN-M組、JXN-L組劑量分別為18、9、4.5 g/kg，灌胃給藥，給藥容量為0.2 mL/10 g。連續(xù)給藥1周，每天給藥1次。末次給藥后1 h測定CT。各組小鼠分別于用藥后1 h測定CT。實驗時取內(nèi)徑為8 mm毛細玻璃管，刺入小鼠眼內(nèi)眥球后靜脈叢采血，自血液進入毛細玻璃管開始計時，30 s折斷玻璃管1次，觀察折斷玻璃管處有無血絲出現(xiàn)，以后每隔15 s折斷玻璃管1次，直至玻璃管內(nèi)出現(xiàn)血絲即為CT。

1.5.2 經(jīng)血寧膠囊對家兔凝血四項的影響 將30只健康新西蘭兔隨機分為空白組、陽性組、JXN-H組、JXN-M組和JXN-L組5個組，每組6只。空白組給予等容積生理鹽水，陽性組給予云南白藥3 g/kg，JXN-H組、JXN-M組、JXN-L組劑量分別為18、9、4.5 g/kg，灌胃給藥，給藥容量為10 mL/kg。連續(xù)給藥1周，每天給藥1次。末次給藥后1 h，用一次性采血針穿刺兔耳中動脈，采血置于含有枸櫞酸鈉抗凝劑的負壓試管中，以3000 r/min（離心半徑5 cm），離心15 min去除血小板，分離血漿，采用全自動血液凝固儀檢測凝血酶原時間（PT）、APTT、TT、FIB含量。

1.5.3 經(jīng)血寧膠囊對新西蘭兔血漿復(fù)鈣時間（PRT）的影響 動物給藥及分組同實驗“1.5.2”。①血漿制備：用一次性采血針穿刺兔耳中動脈，采血置于含有0.2 mL 109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝劑的負壓試管中，混勻后以1000 r/min（離心半徑5 cm），離心10 min，分離血漿備用。②PRT測定：取試管3支，每管加入混合血漿和生理鹽水各0.1 mL，混勻后，置入37℃水浴中預(yù)熱1 min。然后加入0.1 mL已溫育至37℃的氯化鈣溶液?；靹蚝笤俜湃?7℃水浴中，立即啟動秒表計時并不停地在水浴箱中傾斜試管混合，見有纖維蛋白絲出現(xiàn)，準確記錄3管凝固時間均值，即為PRT。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 17.0進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，多組間比較采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 經(jīng)血寧膠囊對凝血時間的影響

云南白藥與經(jīng)血寧膠囊均能縮短小鼠CT，陽性組、JXN-H組、JXN-M組與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；且經(jīng)血寧膠囊凝血作用隨劑量的增加而加強，呈現(xiàn)明顯的量-效依賴關(guān)系。見表1。

2.2 經(jīng)血寧膠囊對家兔凝血四項的影響

與空白組比較，JXN-H組、JXN-M組、JXN-L組和陽性組家兔PT、APTT和TT明顯縮短，血漿FIB明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見表2。

2.3 經(jīng)血寧膠囊對家兔血漿復(fù)鈣時間的影響

與空白組比較，JXN-H組、JXN-M組、JXN-L組和陽性組均能明顯縮短家兔血漿復(fù)鈣時間，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見表3。

3 討論

止血是血液重要的生理功能之一，血液存在功能對立的凝血系統(tǒng)和抗凝系統(tǒng)，他們通過各種凝血因子（因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ等）的調(diào)節(jié)保持著動態(tài)平衡[4-6]。受損血管的局部凝血過程分為4個短暫而又相互交疊的階段。首先，由于神經(jīng)源性作用及內(nèi)皮源性收縮因子（如內(nèi)皮素）的分泌，導(dǎo)致局部血管收縮，這被稱為初級凝血[7]。在這一階段，血小板活化，黏附到暴露的內(nèi)皮下基質(zhì)上，并聚集其他的血小板，從而使更多的血小板黏附到內(nèi)皮下基質(zhì)上，這一階段以最終形成初級凝血栓子而告終[8-10]。次級止血過程中，也就是所謂的凝血級聯(lián)反應(yīng)，活化的內(nèi)皮細胞及其周邊細胞表達了一種膜結(jié)合的促凝因子，它能與凝血因子Ⅶ形成復(fù)合體，以啟動后繼的凝血級聯(lián)反應(yīng)，這一反應(yīng)的最終目的是激活關(guān)鍵酶——凝血酶[11]。凝血酶在凝血過程中發(fā)揮兩個重要作用：①使可溶性FIB轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄岳w維蛋白多聚體，從而形成血液栓塊；②誘導(dǎo)聚集更多的血小板并將其活化。目前有研究表明，次級止血過程中纖維蛋白多聚體的形成與初級凝血過程中血小板栓塊的形成是相互促進的，而且存在短暫的交疊過程。最后一個階段，血小板聚集與纖維蛋白多聚體最終形成了牢固而永久的栓塊[12]。

血液離體后與異物表面接觸，凝血過程啟動，參與凝血的因子被激活，最后使FIB轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白而血液凝固，其中所需時間被稱為CT，絕大多數(shù)情況下指的是內(nèi)源性凝血活酶生成所需的時間，凝血因子Ⅷ、Ⅳ、Ⅺ對CT長短發(fā)揮著重要作用[13-15]；凝血過程第2階段，在活化的因子Ⅴ、Ⅹ、PF3及鈣等參與下，凝血酶原（因子Ⅱ）轉(zhuǎn)變?yōu)槟福ㄒ蜃英騛）。在被檢血漿中加入適量的鈣，測定血漿凝固即為PT，是用于篩選檢測外源凝血系統(tǒng)因子Ⅶ、Ⅴ、Ⅹ和相關(guān)因子的抑制物的試驗[16-17]；APTT的測定反映了Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ等內(nèi)源凝血途徑因子的活性，是內(nèi)源性凝血系統(tǒng)較敏感和常用的篩選方法[18]；而無論是外源性途徑還是內(nèi)源性途徑最終都匯集在Ⅹ因子的活化反應(yīng)上，活化的Ⅹ因子聯(lián)合Ⅴ因子，將凝血酶原（因子Ⅱ）水解切割成凝血酶，凝血酶再將可溶性血漿纖FIB轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，從而形成不可溶的纖維多聚體，故TT的測定是檢測凝血、抗凝及纖維蛋白溶解系統(tǒng)功能的一個重要步驟[19]；FIB由α、β、γ三對不同多肽鏈所組成，凝血酶水解后激活FIB，α鏈與β鏈分別釋放出A肽與B肽，使之轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白單體。在此過程中，由于釋放了酸性多肽，負電性降低，單體易于聚合成纖維蛋白多聚體。進一步在Ca2+與活化的Ⅷ因子作用下，單體之間以共價鍵相連，則變成穩(wěn)定的不溶性纖維蛋白凝塊，完成凝血過程[20-21]。

經(jīng)血寧膠囊中的兩種藥材是傳統(tǒng)的止血中藥，藥用歷史悠久，歷代本草對它的功效均有論述?，F(xiàn)已知有兩條凝血通路。APTT時間延長而PT正常時，認為是內(nèi)源性凝血通路障礙。因為APTT試驗的內(nèi)容物（除白陶土以外）對于血漿來說均是內(nèi)源性的；而PT延長，APTT正常的話，認為是外源性凝血通路障礙，因為凝血激酶對于血漿來說是外源性物質(zhì)[22]。本實驗通過初步的凝血研究，從小鼠CT測定結(jié)果來看，經(jīng)血寧膠囊高、中、低劑量均可不同程度地縮短小鼠CT，體現(xiàn)其具有良好的凝血作用，且其作用隨劑量的增加而加強，呈現(xiàn)明顯的量-效依賴關(guān)系。從家兔凝血四項測定結(jié)果來看，經(jīng)血寧膠囊高、中、低劑量均能有效縮短家兔APPT、PT、TT，體現(xiàn)本品參與了凝血的各個階段，同時影響內(nèi)源性和外源性凝血系統(tǒng)而起到促凝作用，而使FIB含量增加則提示其凝血作用可能與影響纖維蛋白溶解系統(tǒng)有關(guān)。

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（收稿日期：2016-10-11 本文編輯：張瑜杰）