瓠瓜類型砧木遺傳作圖群體雙親多態(tài)性分析

宋慧+王毓洪+張香琴

摘要：以耐濕澇瓠瓜類型砧木材料JZS與不耐濕澇材料T2002為遺傳作圖雙親，利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplification polymorphic DNA，簡(jiǎn)稱RAPD）法與瓠瓜及其他近源瓜類簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱SSR）進(jìn)行多態(tài)性分析。從供試1 678個(gè)RAPD、SSR標(biāo)記中共篩選到26個(gè)多態(tài)性引物，其中包括14個(gè)RAPD、4個(gè)瓠瓜SSR、2個(gè)甜瓜SSR、5個(gè)黃瓜SSR、1個(gè)南瓜SSR，擴(kuò)增出28個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。幾種標(biāo)記多態(tài)性檢測(cè)效率不同，瓠瓜SSR引物揭示，雙親多態(tài)性比例最高（0.47%），其次是RAPD（0.38%），近源瓜類SSR選擇效率最低，僅有0.14%～0.15%。結(jié)果表明，盡管瓠瓜作圖親本表型差異大，但分子標(biāo)記結(jié)果顯示親本遺傳背景相近；甜瓜、黃瓜和南瓜與瓠瓜親緣關(guān)系遠(yuǎn)，具有種屬特異性的SSR引物在瓠瓜親本JZS、T2002多態(tài)性分析中通用性不高。為了提高分子標(biāo)記多態(tài)性分析效率，繪制高密度遺傳圖譜，下一步應(yīng)盡快開(kāi)展基于基因組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，簡(jiǎn)稱SNP）位點(diǎn)的研究。

關(guān)鍵詞：瓠瓜；砧木；多態(tài)性分析；耐濕澇

中圖分類號(hào)： S184 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）11-0048-03

我國(guó)約有2/3的國(guó)土面積存在不同程度的濕澇脅迫，嚴(yán)重影響黃瓜、西瓜和甜瓜等瓜類作物種植生產(chǎn)[1]。瓠瓜[Lagenaria siceraria （Molina） Standl.]根部發(fā)達(dá)，用作瓜類嫁接砧木，能夠增強(qiáng)接穗耐逆性，提高產(chǎn)量[2]。耐濕澇瓠瓜砧木的選育已成為瓠瓜育種的重要目標(biāo)之一。

瓠瓜耐濕澇特性是由多基因控制的數(shù)量遺傳性狀[3]。前期筆者通過(guò)集團(tuán)混合分離分析法（bulked segregation analysis，簡(jiǎn)稱BSA），以不定根數(shù)作為鑒定指標(biāo)，篩選到簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱SSR）引物S87/88與瓠瓜耐濕澇性狀相關(guān)性為0.78，這與瓠瓜耐濕澇特性目的基因尚存在較大遺傳距離[4]，影響分子輔助選擇的正確性，亟須通過(guò)遺傳圖譜構(gòu)建和耐濕澇數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus，簡(jiǎn)稱QTL）定位等手段為瓠瓜耐濕澇分子育種提供緊密連鎖分子標(biāo)記。

SSR引物具有種屬特異性，瓠瓜基因組研究相對(duì)于黃瓜、西瓜和甜瓜等瓜類作物相對(duì)薄弱，僅有浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院李國(guó)景研究員所在課題組的相關(guān)報(bào)道[5]，瓠瓜SSR開(kāi)發(fā)數(shù)目有限。為此，筆者所在課題組利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplification polymorphic DNA，簡(jiǎn)稱RAPD）、瓠瓜SSR及其他近源瓜類SSR，對(duì)瓠瓜類型砧木遺傳作圖雙親（耐濕澇材料JZS與不耐濕澇材料T2002）進(jìn)行多態(tài)性分子標(biāo)記分析，以期為瓠瓜遺傳圖譜構(gòu)建和耐濕澇QTL定位研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用材料為瓠瓜類型砧木耐濕澇材料JZS、不耐濕澇材料T2002及其F1代。將種子播種于32孔穴盤中，按常規(guī)方法進(jìn)行田間管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 材料播種后，待植株長(zhǎng)至5～6張真葉時(shí)，每份樣品各取10張單株的混合葉片，每株采集1 g嫩葉，于-80 ℃保存。參照CTAB法，提取新鮮葉片總基因組DNA。

1.2.2 分子標(biāo)記分析 甜瓜SSR引物序列由美國(guó)威斯康星大學(xué)園藝系翁益群教授提供，瓠瓜SSR引物序列由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所李國(guó)景研究員提供。RAPD、SSR的混樣體系為20μL，包括3.24 μL dNTP（1.25 mmol/L）、1.5 μL 10×buffer、2.43 μL MgCl2（25 mmol/L）、1.35 μL引物（5 mmol/L）、5 μL DNA（10 ng/μL）、0.05 μL Taq DNA聚合酶（1 U）。RAPD、SSR的PCR產(chǎn)物分別用2%瓊脂糖凝膠和高分辨率MS-6瓊脂糖凝膠（TaKaRa，上海）水平電泳檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)記錄與連鎖分析

根據(jù)相同遷移率位置表現(xiàn)出的差異帶型，確定在雙親中顯示差異的分子標(biāo)記，用于多態(tài)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD引物在雙親中的擴(kuò)增和多態(tài)性篩選

600對(duì)RAPD引物分別在雙親JZS、T2002中擴(kuò)增出4 188、4 197個(gè)條帶，平均每個(gè)引物產(chǎn)生6.99個(gè)條帶（表1）。篩選到14個(gè)RAPD引物（分別編號(hào)為P21、P38、P77、P79、P80、P86、P184、P214、P237、P284、P289、P366、P421、P589），共擴(kuò)增出16個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)（圖1）。RAPD引物揭示雙親的多態(tài)性比例為0.38%。

2.2 瓠瓜SSR在雙親中的擴(kuò)增和多態(tài)性篩選

100對(duì)瓠瓜SSR引物分別在雙親JZS、T2002中擴(kuò)增出852、854個(gè)條帶，平均每個(gè)引物產(chǎn)生8.53個(gè)條帶（表1）。篩選到4對(duì)引物（分別為S35/36、S45/46、S49/50、S87/88），共擴(kuò)增出4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)（圖2）。瓠瓜SSR引物擴(kuò)增結(jié)果顯示，親本材料的多態(tài)性比例為0.47%，高于RAPD揭示的多態(tài)性比例（0.38%）。

2.3 甜瓜SSR、黃瓜SSR和南瓜SSR在雙親中的擴(kuò)增和多態(tài)性篩選

分別使用251對(duì)甜瓜SSR、595對(duì)黃瓜SSR和132對(duì)南瓜SSR對(duì)雙親JZS、T2002進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果篩選到2對(duì)甜瓜SSR（T35/36、T193/194）、5對(duì)黃瓜SSR（H37/38、H41/42、H49/50、H61/62、H241/242）和1對(duì)南瓜SSR（N15/16）（圖3），3種SSR引物揭示雙親多態(tài)性比例分別為0.14%、0.15%、0.14%，低于RAPD引物（0.38%）、瓠瓜SSR（0.47%）揭示的多態(tài)性比例。

3 討論

作物耐濕澇特性是較為復(fù)雜的數(shù)量性狀，國(guó)內(nèi)外有關(guān)耐濕澇的研究多集中在小麥[6]、大麥[7]、玉米[8]等大田經(jīng)濟(jì)作物，葫蘆科作物中除了模式作物黃瓜有少量報(bào)道[9]以外，鮮有報(bào)道提及其他瓜類作物的耐濕澇研究。瓠瓜根系發(fā)達(dá)，耐濕澇特性突出，是瓜類作物耐濕澇性狀改良的重要基因庫(kù)。盡管眾多葫蘆科作物很早就被用來(lái)開(kāi)展利用分子遺傳圖譜定位重要農(nóng)藝性狀的研究[10-11]，但是針對(duì)瓠瓜耐濕澇特性QTL定位的研究未見(jiàn)開(kāi)展，從而制約了進(jìn)一步利用分子手段改良瓜類作物耐濕澇特性的研究進(jìn)程。

瓠瓜表型變異大，但從分子標(biāo)記研究結(jié)果來(lái)看，瓠瓜遺傳背景狹窄。在本研究中，幾種標(biāo)記多態(tài)性檢測(cè)效率不同，瓠瓜SSR、RAPD揭示耐濕澇親本JZS和不耐濕澇親本T2002的多態(tài)性比例分別只有0.47%、0.38%，而選用的近源瓜類SSR選擇效率更低，多態(tài)性比例僅為0.14%～0.15%，一方面表明作圖親本JZS和T2002親緣關(guān)系近，另一方面表明甜瓜、黃瓜、南瓜與瓠瓜親緣關(guān)系遠(yuǎn)，基于種屬特異性的SSR引物在JZS、T2002多態(tài)性分析中通用性不高。

Neuhausen認(rèn)為，葫蘆科作物的基因組變化主要源于點(diǎn)突變[12]，因此RAPD、SSR這類基于擴(kuò)增片段多態(tài)性的分子標(biāo)記能夠檢測(cè)的多態(tài)性較低，有必要進(jìn)一步開(kāi)展基于測(cè)序技術(shù)檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP）的多態(tài)性研究，提高分子標(biāo)記分辨率，為繪制高密度遺傳圖譜奠定良好基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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