響應(yīng)面法優(yōu)化限制性酶解花生濃縮蛋白制備工藝研究

于麗娜，杜德紅，彭婭萍，孫 杰，畢 潔，張初署，王明清

(1. 山東省花生研究所，山東 青島 266100； 2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109)

花生是豆科花生屬草本植物，籽仁含油量高達(dá)50%，蛋白質(zhì)含量25%～36%[1]?；ㄉビ秃蟮幕ㄉ炂珊?0%左右的蛋白質(zhì)，除了直接超微粉碎用于乳粉、肉制品等食品添加劑外，還可以將其生產(chǎn)出花生分離蛋白、花生濃縮蛋白、磷酸化改性花生蛋白、糖基化改性花生蛋白、限制性水解花生蛋白、各種功能活性的花生蛋白肽等產(chǎn)品，增加其附加值，豐富蛋白產(chǎn)品種類和用途[2-10]。其中，限制性水解花生蛋白由于蛋白分子輕微水解，使得蛋白分子變小，并含有少量功能性多肽，使其溶解性、乳化性、起泡性、持水性、吸油性等功能性質(zhì)優(yōu)于花生蛋白，且具有較好的抗氧化活性，更適合作為高端蛋白添加劑[11-13]。

本研究以低溫冷榨花生蛋白粉為原料，用乙醇洗滌法得到花生濃縮蛋白，再經(jīng)過超聲波輔助蛋白酶解法制備限制性酶解花生濃縮蛋白，利用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了工藝條件，并研究了限制性酶解花生濃縮蛋白的功能特性和抗氧化活性，旨在為擴(kuò)大花生濃縮蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫冷榨花生蛋白粉：青島長(zhǎng)壽食品有限公司；鹽酸、無水乙醇、氫氧化鈉，均為分析純?cè)噭荷虾?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Alcalase(2.4L FG，標(biāo)稱酶活2.4AU-A/g)：諾維信(中國(guó))生物醫(yī)藥有限公司；十二烷基硫酸鈉、DPPH：Sigma公司。

1.2 超聲波輔助制備限制性酶解花生濃縮蛋白工藝

稱取一定量花生蛋白粉倒入50mL塑料離心管中，加入一定量的70%乙醇溶液，旋渦混合器混合均勻；在超聲波清洗器中以一定的超聲波頻率，超聲波功率和溫度，超聲處理一定時(shí)間；在4000r/min轉(zhuǎn)速下離心10min，棄去上清液；加入一定量水，旋渦混合器混合均勻，調(diào)節(jié)pH值，加入Alcalase(堿性蛋白酶)；在超聲波清洗器中，以一定的超聲波頻率，超聲波功率和溫度，超聲波輔助酶解一定時(shí)間；酶解結(jié)束后，在85℃水浴滅酶5min；滅酶結(jié)束后立即冷卻，把反應(yīng)體系倒入表面皿，冰箱冷凍，之后用冷凍干燥機(jī)干燥，粉碎，待測(cè)。 1.3 超聲波輔助制備限制性酶解花生濃縮蛋白試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 單因素試驗(yàn)

以底物濃度、pH值、加酶量、超聲波頻率、超聲波功率、溫度、時(shí)間作為試驗(yàn)因素，以溶解度和持水性作為考察指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每組試驗(yàn)進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，取平均值作為試驗(yàn)結(jié)果。單因素基本試驗(yàn)條件為：底物濃度、pH值、加酶量、超聲波頻率、超聲波功率、溫度、時(shí)間。單因素試驗(yàn)的因素水平表見表1。

表1 單因素試驗(yàn)因素水平表

1.3.2 響應(yīng)面(Response surface method, RSM)設(shè)計(jì)試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，固定：pH值9.0、超聲波功率150w、超聲波頻率45kHz，以底物濃度(X1)、加酶量(X2，mL/g底物)、溫度(X3，℃)和時(shí)間(X4，min)4個(gè)因素為自變量，運(yùn)用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以乳化活性指數(shù)溶解度和持水性作為響應(yīng)變量(Y和Y')。各因素的編碼和水平范圍是：底物濃度(X1)，8%、10%、12%，加酶量(X2)12.50、23.75、35.00μL/g，溫度(X3)50、56、62℃和時(shí)間(X4) 20、40、60min。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 功能性質(zhì)的測(cè)定方法

等電點(diǎn)、溶解度、乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性、持水能力以及吸油性等功能性質(zhì)測(cè)定方法按照Yu等[14]的方法進(jìn)行。

1.4.2 抗氧化活性測(cè)定方法

清除DPPH自由基、清除羥自由基、清除超氧陰離子自由基、鐵還原力、鉬還原力、銅離子螯合力、鐵離子螯合力、抑制脂質(zhì)體過氧化等抗氧化活性測(cè)定方法按照Yu等[15]的方法進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

單因素與響應(yīng)面試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析采用Design-expert 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 底物濃度對(duì)溶解度和持水性的影響

圖1所示，隨著底物濃度增加，溶解度先緩慢增大再減小，在底物濃度為12%出現(xiàn)最大值；持水性先增大再緩慢減小，最后趨于恒定，在底物濃度為6%出現(xiàn)最大值。底物濃度在4%～12%范圍內(nèi)，蛋白酶水解產(chǎn)生的小分子蛋白和多肽逐漸增加，溶解度增大；當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?2%時(shí)，一定量的蛋白酶不足以水解這些底物，生成的小分子蛋白和多肽有所減少，因此溶解度減小。當(dāng)?shù)孜餄舛仍?%～6%范圍內(nèi)，水解產(chǎn)物中的小分子蛋白、多肽和未水解蛋白的混合物有利于持水性的增大；當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?%時(shí)，由于溶解度增大，使得持水性減小。綜合考察溶解度和持水性的變化，選擇底物濃度8%～12%作為響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平。

2.1.2 pH值對(duì)溶解度和持水性的影響

pH值對(duì)蛋白酶的水解具有一定的影響。隨著pH值的增大，溶解度逐漸增大；持水性先增大后減小再增大；最大值均在pH9.0處(圖2)。通常情況下，Alcalase的適合pH值為6.5～9.0。由于花生蛋白的90%為鹽溶性蛋白，pH值升高，有利于蛋白本身的溶解，使得蛋白酶解位點(diǎn)暴露出來，有利于小分子蛋白和多肽的生成，使溶解度逐漸增大。持水性在pH值為6.5～7.5范圍內(nèi)增大；當(dāng)pH值大于7.5時(shí)，隨著酶解產(chǎn)物中小分子蛋白和多肽的增多，持水性又減小。因此，選擇pH值9.0作為響應(yīng)面試驗(yàn)固定因素水平。

圖1 底物濃度對(duì)限制性酶解花生濃縮蛋白溶解度和持水性的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on solubility and water holding capacity of limited enzymatic hydrolysis peanut protein concentrate圖2 pH值對(duì)限制性酶解花生濃縮蛋白溶解度和持水性的影響Fig.2 Effect of pH value on solubility and water holding capacity of limited enzymatic hydrolysis peanut protein concentrate

2.1.3 加酶量對(duì)溶解度和持水性的影響

隨加酶量的增加，溶解度和持水性的變化趨勢(shì)相似，都是先快速減小再緩慢增大而后又減小，兩者最大值分別在加酶量12.5μL/g和27.5μL/g時(shí)(圖3)。當(dāng)加酶量為12.5μl/g時(shí)，蛋白酶與蛋白充分接觸，水解得到的小分子蛋白和多肽較多，溶解度較大；當(dāng)加酶量增大時(shí)，蛋白的酶促位點(diǎn)逐漸與增大的加酶量相吻合，產(chǎn)物中小分子蛋白和多肽逐漸增多，溶解度逐漸增大；當(dāng)加酶量大于35μL/g時(shí)，加酶量趨于飽和，蛋白沒有更多的酶促位點(diǎn)與蛋白酶結(jié)合，則產(chǎn)物中小分子蛋白和多肽減少，溶解度減小。因此，選擇加酶量12.5～35.0μL/g作為響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平。

2.1.4 超聲波頻率對(duì)限制性酶解花生濃縮蛋白溶解度和持水性的影響

隨著超聲波頻率的升高，溶解度和持水性都呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，在超聲波頻率為45kHz時(shí)出現(xiàn)最大值(圖4)。當(dāng)超聲波在介質(zhì)中傳播時(shí)，由于超聲波與介質(zhì)的相互作用，使介質(zhì)發(fā)生物理的和化學(xué)的變化，從而產(chǎn)生一系列力學(xué)的、熱學(xué)的、電磁學(xué)的和化學(xué)的超聲效應(yīng)。超聲波可以使蛋白分子結(jié)構(gòu)變得松散，從而有利于酶解反應(yīng)進(jìn)行。因此，將超聲波頻率45kHz作為響應(yīng)面固定試驗(yàn)因素水平。

2.1.5 超聲波功率對(duì)限制性酶解花生濃縮蛋白溶解度和持水性的影響

超聲波功率大小影響蛋白的分子結(jié)構(gòu)變化，從而影響蛋白與酶分子的結(jié)合。隨著超聲波功率的增大，溶解度和持水性都呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)，分別在超聲波功率240W和210W出現(xiàn)最小值(圖5)。所以將超聲波功率150W作為響應(yīng)面試驗(yàn)固定因素水平。

圖3 加酶量對(duì)限制性酶解花生濃縮 蛋白溶解度和持水性的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on solubility water holding capacity of limited enzymatic and hydrolysis peanut protein concentrate圖4 超聲波頻率對(duì)限制性酶解花生 濃縮蛋白溶解度和持水性的影響Fig.4 Effect of ultrasonic frequency on solubility and water holding capacity of limited enzymatic hydrolysis peanut protein concentrate圖5 超聲波功率對(duì)限制性酶解花生 濃縮蛋白溶解度和持水性的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on solubility and water holding capacity of limited enzymatic hydrolysis peanut protein concentrate

2.1.6 溫度對(duì)限制性酶解花生濃縮蛋白溶解度和持水性的影響

溫度對(duì)酶解反應(yīng)有一定的影響，蛋白酶只有在適合的溫度下才具有較高的水解活力。圖6所示，隨著溫度升高，溶解度和持水性都先減小后緩慢增大再緩慢減小，蛋白酶活性增大，水解產(chǎn)物中小分子蛋白和多肽增多，溶解度增加；當(dāng)溫度超過62℃時(shí)，花生蛋白開始變性，分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，酶促位點(diǎn)減少，水解產(chǎn)物中小分子蛋白和多肽減少，溶解度開始下降。因此，選擇溫度50～62℃作為響應(yīng)面的試驗(yàn)因素水平。

2.1.7 時(shí)間對(duì)限制性酶解花生濃縮蛋白溶解度和持水性的影響

酶解反應(yīng)需要一定的時(shí)間才能完成，圖7所示，溶解度和持水性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)先增大后減小最后再增大。超聲波處理酶解反應(yīng)體系時(shí)，蛋白大分子的氫鍵斷裂，空間構(gòu)象改變，增大了蛋白酶與底物分子的接觸幾率，酶解的小分子產(chǎn)物增多，溶解度逐漸增大。選擇20～60min作為響應(yīng)面時(shí)間因素的水平范圍。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 模型的建立與顯著性分析

根據(jù)RSM設(shè)計(jì)，選取29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，表2為RSM設(shè)計(jì)及溶解度和持水性試驗(yàn)值。對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，獲得了預(yù)測(cè)相應(yīng)值與底物濃度(X1)、加酶量(X2)、溫度(X3)和時(shí)間(X4)的二次回歸方程，如下：

溶解度=56.45+2.81X1+1.2X2-0.22X3+2.88X4+1.97X1X2+4.27X1X3+4.1X1X4+0.67X2X3+2.55X2X4+1.8X3X4+5.72X12+0.0042X22+5.47X32+4.68X42

持水性=6.73-0.35X1-0.32X2-0.32X3+0.0049X4+1.3X1X2+0.53X1X3+1.58X1X4+0.46X2X3+2.53X2X4+1.06X3X4-1.77X12-1.35X22-1.27X32-0.74X42

圖6 溫度對(duì)限制性酶解花生濃縮蛋白溶解度和持水性的影響Fig.6 Effect of temperature on solubility and water holding capacity of limited enzymatic hydrolysis peanut protein concentrate圖7 時(shí)間對(duì)限制性酶解花生濃縮蛋白溶解度和持水性的影響Fig.7 Effect of time on solubility and water holding capacity of limited enzymatic hydrolysis peanut protein concentrate

對(duì)兩個(gè)模型方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。溶解度模型顯著(P<0.05)，持水性模型高度顯著(P<0.01)，表明兩個(gè)方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的擬合情況較好，因此可用回歸方程對(duì)試驗(yàn)真實(shí)值進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。兩個(gè)模型的校正決定系數(shù)(Adjusted coefficient of determination,RAdj2)分別為0.555和0.6979，表明兩個(gè)方程約有55%的溶解度和69%的持水性變異分布在所研究的4個(gè)相關(guān)因素中，其總變異度僅有45%和31%不能用模型解釋。兩模型的相關(guān)系數(shù)(Correlation coefficient，R)分別為0.8818和0.9214，表明溶解度和持水性的預(yù)測(cè)值和試驗(yàn)值之間具有高度的相關(guān)性。失擬項(xiàng)P為0.8893和0.7437，它們都大于

表2 RSM設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

注：P≤0.05，影響顯著；P≤0.01，影響高度顯著；P≤0.001，影響極顯著；P>0.05，影響不顯著。

Note:P≤0.05,P≤0.01,P≤0.001 andP>0.05 represent the influence of significant, high significant, extremely significant and insignificant level, respectively.

0.05，表明方程的擬合不足檢驗(yàn)不顯著，二次響應(yīng)面回歸方程能很好地?cái)M合本試驗(yàn)所得的結(jié)果，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，該模型可用于溶解度和持水性的理論預(yù)測(cè)。模型的變異系數(shù)(Coefficient of variation, CV)分別為6.58%和22.48%，也表明方程擬合度較好。

二次模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)見表4。溶解度模型中，因素X1和X4對(duì)溶解度的線性效應(yīng)顯著；因素X22對(duì)溶解度的曲面效應(yīng)極顯著；持水性模型中，X2X4對(duì)持水性的交互影響極顯著，X1X4對(duì)持水性的交互影響高度顯著，X1X2對(duì)持水性的交互影響顯著；因素X12對(duì)持水性的曲面效應(yīng)極顯著，因素X22和X32對(duì)持水性的曲面效應(yīng)高度顯著；表明試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值也有很大的關(guān)系，交互項(xiàng)影響也顯著。

由溶解度響應(yīng)面模型回歸方程可以分析出，在影響溶解度的因素中，底物濃度、加酶量和時(shí)間與溶解度呈正相關(guān)，溫度與溶解度呈負(fù)相關(guān)。由持水性響應(yīng)面模型回歸方程可以分析出，在影響持水性的因素中，時(shí)間與持水性呈正相關(guān)，底物濃度、加酶量和溫度與持水性呈負(fù)相關(guān)。比較響應(yīng)面模型二次多項(xiàng)式方程中一次項(xiàng)的方差的大小，可以判斷影響因素的主次順序。各因素對(duì)溶解度影響程度大小為X4>X1>X2>X3，對(duì)持水性影響程度大小為X1>X2>X3>X4。

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

注：P≤0.05，影響顯著；P≤0.01，影響高度顯著；P≤0.001，影響極顯著；P>0.05，影響不顯著。

Note:P≤0.05,P≤0.01,P≤0.001 andP>0.05 represent the influence of significant, high significant, extremely significant and insignificant level, respectively.

2.2.2 模型的建立與顯著性分析

對(duì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行典型性分析，獲得超聲波輔助制備限制性酶解花生濃縮蛋白的最優(yōu)條件為底物濃度8.04%，加酶量12.5μL/g，溫度50.75℃，時(shí)間20.99min，溶解度和持水性理論值分別為77.63%和9.77mL/g。為檢驗(yàn)響應(yīng)面方法的可行性，并綜合考慮實(shí)際操作的便利性，將工藝參數(shù)修正為：底物濃度8.1%，加酶量12.5μL/g，溫度51℃，時(shí)間21min進(jìn)行超聲波輔助制備限制性酶解花生濃縮蛋白的試驗(yàn)。3次平行試驗(yàn)得到的平均溶解度和持水性分別為78.89±0.53%和9.58±0.26mL/g，溶解度和持水性值與理論值分別相差1.62%和1.94%，差值都在2%以內(nèi)，說明模型與實(shí)際情況擬合較好，驗(yàn)證了所預(yù)測(cè)模型的正確性。因此，響應(yīng)面法對(duì)超聲波輔助制備限制性酶解花生濃縮蛋白工藝條件參數(shù)優(yōu)化是可行的，得到的工藝條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.3 限制性酶解花生濃縮蛋白的功能性質(zhì)研究

2.3.1 等電點(diǎn)

隨著pH值的升高，限制性酶解花生濃縮蛋白的吸光值先減小再增大，在pH值為4.0時(shí)出現(xiàn)最小值，即等電點(diǎn)在pH4.0(圖8)?；ㄉ鞍椎牡入婞c(diǎn)在pH4.5，限制性酶解花生濃縮蛋白的等電點(diǎn)小于花生蛋白。其主要原因是，花生蛋白經(jīng)過蛋白酶水解后，有小分子蛋白和多肽生成，這些都是兩性物質(zhì)，疏水基團(tuán)增加，使得等電點(diǎn)降低。限制性酶解花生濃縮蛋白的等電點(diǎn)減小，有利于其在食品加工中的應(yīng)用。

2.3.2 溶解度

隨著pH值的升高，溶解度先減小再增大，pH 4.0出現(xiàn)最小值，與等電點(diǎn)的變化趨勢(shì)一致(圖9)。當(dāng)pH值大于6.0時(shí)，溶解度就大于60%，有利于將精制水解花生蛋白應(yīng)用于蛋白飲品中，提高蛋白飲品的蛋白含量和質(zhì)量。

圖8 限制性酶解花生濃縮蛋白的等電點(diǎn)Fig.8 Isoelectric point of limited enzymatic hydrolysis peanut protein concentrate圖9 限制性酶解花生濃縮蛋白的溶解度Fig.9 Solubility of limited enzymatic hydrolysis peanut protein concentrate

2.3.3 乳化活性

pH 2～9范圍內(nèi)，乳化活性指數(shù)先減小后緩慢增大；當(dāng)pH值大于10.0時(shí)，乳化活性指數(shù)快速增大；乳化穩(wěn)定性指數(shù)先減小再增大；兩者都在pH值為4.0時(shí)出現(xiàn)最小值，與等電點(diǎn)的變化趨勢(shì)一致(圖10)。這些功能特性非常有利于限制性酶解花生濃縮蛋白的加工特性。

2.3.4 起泡性

由圖11可看出，隨著pH值的升高，起泡性先減小后緩慢增大，pH 4.0時(shí)出現(xiàn)最小值，與等電點(diǎn)的變化趨勢(shì)一致；泡沫穩(wěn)定性逐漸增大。限制性酶解花生濃縮蛋白的起泡性在各個(gè)pH值很小，主要因?yàn)榛ㄉ鞍捉?jīng)過水解，有小分子蛋白和多肽生成，破壞了蛋白的表面張力作用，導(dǎo)致起泡性較小。

2.3.5 持水性

圖12所示，隨著蛋白濃度增大，持水性逐漸減

圖10 限制性酶解花生濃縮蛋白的乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)Fig.10 Emulsifying activity index and emulsion stability index of limited enzymatic hydrolysis peanut protein concentrate圖11 限制性酶解花生濃縮蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性Fig.11 Foaming ability and stability of limited enzymatic hydrolysis peanut protein concentrate

圖12 限制性酶解花生濃縮蛋白的持水性Fig.12 Water binding capacity of limited enzymatic

hydrolysis peanut protein concentrate

圖13 限制性酶解花生濃縮蛋白的吸油性

Fig.13 Oil absorption of limited enzymatic

hydrolysis peanut protein concentrate

小，與蛋白濃度呈二次項(xiàng)關(guān)系，二次回歸方程為y= 0.1197x2-1.2598x+ 4.5883，R2= 0.9807。

2.3.6 吸油性

圖13表明，隨著蛋白濃度增大，吸油性逐漸減小，與蛋白濃度呈二次項(xiàng)關(guān)系，二次回歸方程為y= 0.976x2-9.5231x+ 25.523，R2=0.9793。

2.4 抗氧化活性研究

表5表明，限制性酶解花生濃縮蛋白的抗氧化活性的IC50值都很小，抗氧化活性很高?；ㄉ鞍捉?jīng)過蛋白酶水解后，生成小分子多肽，具有清除自由基、還原力、金屬離子螯合力和抑制脂質(zhì)過氧化的抗氧化活性。限制性酶解花生濃縮蛋白具有這四大類抗氧化活性，說明限制性酶解花生濃縮蛋白作為食品原料添加到食品中，除了提供食品必要的蛋白、氨基酸營(yíng)養(yǎng)成分外，還可以起到天然抗氧化劑的作用。

表5 限制性酶解花生濃縮蛋白的抗氧化活性

3 結(jié) 論

通過采用超聲波輔助堿性蛋白酶酶解方法，得到限制性酶解花生濃縮蛋白的最佳制備工藝；同時(shí)研究了限制性酶解花生濃縮蛋白的功能特性和抗氧化活性。本研究得到的限制性酶解花生濃縮蛋白產(chǎn)品具有較好的溶解性、乳化性等功能特性；并且，由于蛋白酶的輕度水解，酶解產(chǎn)物中含有花生多肽，使得限制性酶解花生濃縮蛋白還具有較好的清除自由基活性、還原力、金屬離子螯合力和抑制脂質(zhì)過氧化活性。限制性酶解花生濃縮蛋白可以進(jìn)一步開發(fā)為乳制品、肉制品、焙烤制品等食品專用蛋白基料，為冷榨花生粕的高值化利用提供新途徑。

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