肛周尖銳濕疣組織HPV檢測與型別分析

許召杰 鄧業(yè)巍 李瑞

450000 鄭州，南方醫(yī)科大學(xué)附屬鄭州人民醫(yī)院肛腸外科(許召杰、鄧業(yè)巍)；450053 鄭州市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科(李瑞)

·論著·

肛周尖銳濕疣組織HPV檢測與型別分析

許召杰 鄧業(yè)巍 李瑞

450000 鄭州，南方醫(yī)科大學(xué)附屬鄭州人民醫(yī)院肛腸外科(許召杰、鄧業(yè)巍)；450053 鄭州市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科(李瑞)

目的 了解肛周尖銳濕疣人乳頭瘤病毒(HPV)感染狀況及其型別分布，探討HPV感染與年齡和性別的相關(guān)性，評價(jià)PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測HPV的方法學(xué)性能。方法 對316例確診或疑似肛周尖銳濕疣(CA)患者的石蠟標(biāo)本進(jìn)行HPV基因分型檢測，其中58例進(jìn)行HPV DNA測序。結(jié)果 316例受檢患者中HPV總感染率為81.6%，單一HPV型別感染排名前5位分別為HPV11、6、18、16和33；混合感染中型別以HPV6+11、6+11+16和6+18多見。35歲以下男性感染率最高。以測序法為金標(biāo)準(zhǔn)，PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測HPV的敏感度為92.31%，特異度為89.47%，準(zhǔn)確度為91.38%。結(jié)論 年輕男性肛周感染HPV比例較高，感染型別以HPV 11、6、18、16和33為主，PCR-反向點(diǎn)雜交法能滿足臨床診斷HPV的需求。

肛周尖銳濕疣(Condyloma acuminata,CA)是由人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染所引起的肛周增生性疾病。HPV在自然界廣泛存在，具有多種型別，不同型別感染對宮頸上皮的致病力也不同。宮頸癌是高危型HPV持續(xù)感染所引起的主要疾病之一，其已成為全世界女性第3大惡性腫瘤[1]。低危型HPV感染主要引起宿主組織疣狀病變。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，基因診斷技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在 HPV 感染的定性、定位、分型及定量診斷，為臨床治療進(jìn)一步提供了客觀、準(zhǔn)確、科學(xué)的依據(jù)[2]。本研究采用PCR-反向點(diǎn)雜交法(PCR-reverse dot blot，PCR-RDB))對316例疑似肛周尖銳濕疣患者的石蠟樣本進(jìn)行HPV基因分型檢測，旨在探討肛周尖銳濕疣與HPV感染的關(guān)系并對PCR-RDB法進(jìn)行性能評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 對象 收集2008年11月至2015年11月在鄭州人民醫(yī)院就診的疑似肛周CA患者316例，其中男性179例、女性137例，年齡16-79歲(其中11例年齡不詳)，患者以10歲為年齡段進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。標(biāo)本是將患者的肛周及肛管的CA病灶手術(shù)切除后制作成的石蠟組織。所有患者均簽署標(biāo)本采集知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑 美國 Gene Amp 2400 PCR擴(kuò)增儀；韓國Combi-H12分子雜交儀；美國ABI 測序儀；深圳亞能生物技術(shù)有限公司HPV分型DNA雜交技術(shù)檢測試劑盒。

1.3 研究方法

1.3.1 HPV基因分型檢測：采用常規(guī)堿裂解法對石蠟組織進(jìn)行 DNA抽提、PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物通過DNA芯片進(jìn)行基因分型檢測，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2 方法學(xué)比較：隨機(jī)選取其中58例石蠟組織樣本進(jìn)行HPV 結(jié)果驗(yàn)證。對結(jié)果為陽性的標(biāo)本采用型別對應(yīng)的引物進(jìn)行擴(kuò)增后測序驗(yàn)證。對結(jié)果為陰性的標(biāo)本采用國際通用的引物MY[3]擴(kuò)增，擴(kuò)增無產(chǎn)物者定為陰性；擴(kuò)增有產(chǎn)物者再測序，若測序不成功者亦定為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用例(百分比)表示，采用χ2檢驗(yàn)，性能評價(jià)用四格表資料的診斷性試驗(yàn)分析，方法的一致性采用Kappa分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV感染及型別分布 316例患者石蠟樣本中檢出HPV陽性258例，陽性率為81.6%。23種型別共檢出10種，其中低危型檢出HPV6和11型，檢出例次數(shù)分別為137例次和132例次；高危型檢出HPV16、18、33、66、53、73、52和56型，分別檢出47、43、7、2、2、1、1和1例次(圖1)。

圖1 258例HPV感染陽性型別分布Fig.1 Distribution of HPV infection type in 258 cases

2.2 HPV感染的年齡分布 316例患者中有305例有年齡記錄，11例無年齡記錄。因此將有年齡記錄的305例患者分為16-25，>25-35，>35-45，>45-55和>55-79歲(由于>55歲組只有5例，因此將>55-79歸為一組)，各組例數(shù)分別為82、118、67、33和5例(表1)。

表1 305例患者年齡組及性別HPV感染率比較[%]

注：“—”.無相關(guān)數(shù)據(jù)

Note: "—" No relevant data

2.3 PCR-反向點(diǎn)雜交法與測序法檢測結(jié)果比較 用PCR-反向點(diǎn)雜交法和測序法同時(shí)檢測58份石蠟組織樣本，PCR-反向點(diǎn)雜交法檢出38例為陽性，測序法檢出39例陽性。兩者檢測均陰性的標(biāo)本17例，兩者檢測均陽性的標(biāo)本36例，兩種方法檢測結(jié)果具有良好的一致性(χ2=37.822，P>0.05，Kappa=0.807)(表2)。以測序法為金標(biāo)準(zhǔn)，PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測肛周尖銳濕疣患者HPV 基因型別的敏感度92.31%、特異度89.47%、準(zhǔn)確度91.38%、陽性預(yù)測值94.74%、陰性預(yù)測值85.00%。

3 討論

肛周尖銳濕疣又名生殖器疣或性病疣，主要通過性接觸、間接接觸和母嬰傳播等方式傳染。HPV是一種小DNA雙鏈病毒，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有200 多個(gè)型別、亞型及變異體，目前已鑒定出一百多種亞型中有近40種入侵生殖器官[4]。HPV是尖銳濕疣的病原體，在自然界廣泛存在，其反復(fù)難治可能與患者機(jī)體免疫功能低下或免疫調(diào)節(jié)紊亂導(dǎo)致免疫失衡有關(guān)[5]。本研究采用PCR-RDB技術(shù)對316例疑似肛周CA患者石蠟標(biāo)本進(jìn)行HPV基因分型，結(jié)果顯示： HPV總感染率為81.6%，與黃澤棋等[6]報(bào)道結(jié)果基本一致。HPV11是單一型別感染中最高的型別，其次是HPV6。二重和三重混合感染中型別以HPV6+11、6+11+16和6+18多見，這與國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[7-9]。與其他文獻(xiàn)報(bào)道不一致的原因可能與檢測方法及研究對象等不同有關(guān)。本文共檢出10種HPV基因型別，其他型別尚未檢出，可能這幾種HPV型別的感染率及試劑敏感度較低等相關(guān)。

表2 58份石蠟組織樣本 PCR-反向點(diǎn)雜交法與測序法結(jié)果比較

年齡是HPV感染的相關(guān)因素。HPV感染可發(fā)生于各種年齡，并有明顯的年齡分布特點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示：肛周CA患者HPV感染率在16-25歲年齡組最高，>25-35歲年齡組次之，與國內(nèi)學(xué)者報(bào)道結(jié)果[10]相符。在16-25和>25-35歲組男性HPV感染率大于女性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.968和13.418，P<0.05)，且男性在16-25歲組感染率大于其他年齡組，女性在>35-45歲組感染率大于其他年齡組(χ2=33.921和13.622)。其原因一方面由于青年男性和中年女性性生活相對頻繁，增加了HPV入侵的機(jī)會(huì)。另一方面由于男同性戀者人群肛交較普遍。由于肛管直腸的解剖結(jié)構(gòu)不同于陰道，肛交時(shí)彈性低，表皮易于受到損傷，造成病毒入侵。

測序法是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法中確定DNA靶序列的最可靠方法，成為HPV DNA檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其操作繁瑣、設(shè)備昂貴，特別是在多型別混合感染的情況下，必須在通用引物確定HPV感染后，再次采用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增后測序確定，且存在失敗的可能性，因此在臨床上難以大規(guī)模普及[3]。

目前臨床上HPV檢測方法有血清學(xué)方法、PCR法、原位雜交法及DNA印跡法等，這些方法存在靈敏度低、操作費(fèi)時(shí)、費(fèi)用高等缺點(diǎn)從而降低了其臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究采用PCR-反向點(diǎn)雜交法這一高通量、高特異的基因檢測技術(shù)，通過一次擴(kuò)增雜交可同時(shí)檢測23種HPV型別感染，不僅可以判斷標(biāo)本中是否存在HPV感染，而且還能判斷具體感染的HPV型別，具有較強(qiáng)針對性，對判斷多重型別感染更是一目了然。從HPV基因芯片試驗(yàn)的方法學(xué)來看，以測序法為金標(biāo)準(zhǔn)，對兩種方法的符合性進(jìn)行比較，兩種檢測方法具有良好的一致性(Kappa=0.807)，充分說明PCR-反向點(diǎn)雜交法具有較高的可信度，適用于大規(guī)模臨床篩查及推廣。

綜上所述，河南地區(qū)肛周CA患者HPV感染好發(fā)于16-25歲的年輕男性，以單一感染為主，HPV 11和HPV 6為最常見的感染型別。PCR-反向點(diǎn)雜交法可以準(zhǔn)確、快速地診斷肛周CA患者的HPV感染型別，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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Typing analysis and detection of HPV for condyloma acuminata tissues of perianal

XuZhaojie,DengYewei,LiRui

DepartmentofColorectal,ZhengzhouPeople＇sHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity,Zhengzhou450000,China(XuZJ,DengYW)；ClinicalLaboratory,ZhengzhouChildren＇sHospital,Zhengzhou450053,China(LiR)Correspondingauthor:DengYewei,Email: 13623847966@163.com

Objective To learn the prevalence of HPV infection and its genotypes distribution in perianal warts, discuss the association between HPV infection and age and gender, and assess the methodology performance of PCR-reverse dot blot(PCR-RDB) to detect HPV. Methods HPV genotypes were detected in 316 paraffin specimens of confirmed or suspected perianal condyloma acuminata(CA) patients, including 58 cases for HPV DNA sequencing. Results The HPV infection rate in 316 patients was 81.6%. The first fifth genotypes of single HPV infection were HPV11, 6, 18, 16 and 33. HPV6+11, HPV6+11+16 and HPV6+18 were more common in mixed infection. The highest HPV infection rate was from the males aged below 35 years. Regarding the sequencing result as a gold standard, the sensitivity, specificity and accuracy of PCR-RDB in HPV were 92.31%, 89.47% and 91.38% respectively. Conclusions The proportion of HPV crissum infection in young male was quite high, the major pathogenic types were HPV 11, 6, 18, 16 and 33. The PCR-RDB method can meet the needs of clinical diagnosis of HPV.

Papillomavirus human; Genotyping; Condyloma Acuminata

鄧業(yè)巍，13623847966@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.01.007

乳頭狀瘤病毒，人；基因分型；尖銳濕疣

2016-04-01)