HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA Real-time PCR檢測方法比較

曹經(jīng)琳 竇劍 周文亭 任貴軍

050051 石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院肝膽外科(曹經(jīng)琳、竇劍、任貴軍)；102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(周文亭)

·技術(shù)方法·

HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA Real-time PCR檢測方法比較

曹經(jīng)琳 竇劍 周文亭 任貴軍

050051 石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院肝膽外科(曹經(jīng)琳、竇劍、任貴軍)；102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(周文亭)

目的 比較HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(Covalently closed circular DNA, cccDNA) Real-time PCR檢測方法。方法 選擇文獻(xiàn)中常用的普通Taq-Man探針及Taq-Man MGB探針兩種檢測方法，合成引物及探針，制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，提取乙肝患者血清及肝組織標(biāo)本HBV DNA，分別用質(zhì)粒安全ATP依賴的DNA酶(Plasmid-safe ATP-dependent DNase, PSAD)酶切，進(jìn)行敏感性、特異性及重復(fù)性檢測驗(yàn)證。結(jié)果 兩種檢測方法擴(kuò)增質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品均有良好線性關(guān)系(R20.989和0.976)，重復(fù)性良好(CV<4%)；檢測PSAD酶切前后質(zhì)粒、血清及肝組織HBV cccDNA均有良好特異性；檢測相同濃度樣品時(shí)普通Taq-Man探針Ct值較Taq-Man MGB探針略低。結(jié)論 兩種方法均可用于HBV cccDNA檢測，本實(shí)驗(yàn)所用的普通Taq-Man探針較Taq-Man MGB探針敏感性略高；MGB探針本底更低。實(shí)際工作中可根據(jù)需求選擇適宜的探針。

HBV屬于嗜肝DNA病毒科，成熟病毒基因組由部分雙鏈松弛環(huán)狀DNA(Relaxed circular DNA，rcDNA)構(gòu)成，在病毒感染細(xì)胞后rcDNA進(jìn)入宿主細(xì)胞核形成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(Cdovalently closed circular DNA，cccDNA)，與組蛋白結(jié)合形成游離的微小染色體存在于宿主細(xì)胞核中，作為HBV基因組轉(zhuǎn)錄復(fù)制的模板[1-2]。由于現(xiàn)有抗病毒藥物不能有效清除HBV cccDNA，HBV持續(xù)感染與cccDNA的長期存在密切相關(guān)。因此選擇適宜方法檢測肝細(xì)胞中HBV cccDNA，有利于了解其在肝組織中的含量及分布特性，以及乙肝治療現(xiàn)狀及預(yù)后判斷[3，4]。

目前對于HBV cccDNA檢測有多種方法[3-6]并沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，Real-time PCR方法主要根據(jù)HBV rcDNA及cccDNA結(jié)構(gòu)差異，設(shè)計(jì)跨rcDNA缺口的引物及探針，并用質(zhì)粒安全ATP依賴的DNA酶(PSAD)酶切，去除非特異反應(yīng)，選擇性擴(kuò)增HBV cccDNA。本研究選擇國內(nèi)文獻(xiàn)常用的兩種Real-time PCR方法進(jìn)行了比較[5，6]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及標(biāo)本 質(zhì)粒提取試劑盒、肝組織DNA提取試劑盒購自美國Omega公司；血清HBV DNA提取試劑盒QIAamp DNA Blood Mini Kit購自德國Qiagen公司；克隆用pMD 20質(zhì)粒、Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)熒光定量PCR試劑盒、樣品RNA/DNA保存試劑(Sample Protector for RNA/DNA)購自日本TaKaRa公司；質(zhì)粒安全ATP依賴DNA酶 (plasmid-safe ATP-dependent DNase) PSAD酶購自美國Epicentre 公司。

乙肝患者血清及肝癌組織標(biāo)本來源于河北醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院臨床標(biāo)本，放-70℃冰箱保存，肝組織標(biāo)本運(yùn)輸按樣品RNA/DNA保存試劑說明書進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)用引物及探針：跨HBV rcDNA缺口引物及探針分別引自參考文獻(xiàn)[5，6]，見表1。

表1 引物及探針序列

1.2.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的建立： 根據(jù)參考文獻(xiàn)[5,6]，選取一份HBV DNA(HBV total DNA，HBV tDNA)滴度較高的血清標(biāo)本(HBV tDNA>106拷貝/ml)，提取HBV DNA，應(yīng)用引物BCF1和BCR1進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增367 bp目的條帶，純化后連接到載體pMD-20，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5ɑ、克隆、純化擴(kuò)增，提取質(zhì)粒DNA，取部分質(zhì)粒用PSAD酶切消化，用紫外分光光度計(jì)定量，并按公式：拷貝數(shù)/μl=6.02×1023×濃度(ng/μl)×10-9/(目的片段堿基數(shù)bp×660) 計(jì)算出質(zhì)粒的拷貝數(shù)。

1.2.3 血清HBV DNA及肝組織DNA提?。貉錒BV DNA提取采用德國Qiagen 公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit，取200 μl血清進(jìn)行DNA提取，具體操作參照試劑盒說明書，DNA樣品-20℃保存。肝癌組織中HBV DNA提取用Omega公司Tissue DNA kit，取30-60 mg肝組織提取DNA，具體操作參照試劑盒說明書，樣品最后溶于160 μl 洗脫液中，DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量，-20℃保存。

1.2.4 PSAD酶切消化：按PSAD酶說明書進(jìn)行，25 μl 反應(yīng)體系：1 μl 25 mmol/L ATP, 2.5 μl 10x反應(yīng)緩沖液，1 μl PSAD (10U)，取質(zhì)粒、血清HBV DNA、肝組織DNA 0.5-1 μl, 補(bǔ)水到25 μl：37℃ 消化1-2 h，70℃滅活10 min，-20℃保存。PSAD在適宜條件下，對線性雙鏈DNA、線性單鏈DNA及環(huán)狀單鏈DNA降解活性強(qiáng)，但不能降解共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈DNA或超螺旋DNA，可增加HBV cccDNA檢測的特異性。

1.2.5 Real-time PCR檢測: 方法1.參考文獻(xiàn)[5]，每反應(yīng)體系：10 μmm/L BCF1 或BCR1引物各0.4 μl, 10 μmm/L BCT1探針 0.8 μl，TaKaRa 2x Premix Ex TaqTM反應(yīng)緩沖液10 μl, 模板2 μl，加水定容至20 μl。在ABI7500 real time PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃ 預(yù)變性30 s；95℃ 10 s, 55℃31s，72℃ 31 s，共45個循環(huán)。方法2.參考文獻(xiàn)[6]：每反應(yīng)體系10 μmm/L TCF2 或TCR2 引物各1 μl, 10 μmm/L TCT2 探針 2 μl，TaKaRa 2x Premix Ex TaqTM反應(yīng)緩沖液10 μl,模板2 μl，加水定容至20 μl，反應(yīng)條件為95℃ 預(yù)變性30 s；95℃ 15 s, 60℃40 s，共45個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用ABI7500 software V2.3 軟件及SAS9.2 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入與分析。計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)算變異系數(shù)CV，Ct值配對t檢以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的建立 PCR擴(kuò)增目的片段，連接到質(zhì)粒載體制備克隆質(zhì)粒，提取純化后，用PSAD酶切消化，測得質(zhì)粒含量為147 ng/μl, 按公式計(jì)算為 1.78x1010拷貝/μl。用制備的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量 PCR檢測，結(jié)果表明兩種方法均具有良好的線性關(guān)系，方法1與方法2的相關(guān)系數(shù)R2分別為0.989 和0.976。

2.2 兩種檢測方法的靈敏度比較 將上述標(biāo)準(zhǔn)品從1.78×106拷貝/μl 10倍稀釋到1.78×101拷貝/μl，分別用兩種方法進(jìn)行Real-time PCR檢測，結(jié)果見表2，方法1的Ct值略低于方法2，靈敏度略高于方法2。二種檢測方法的Ct值經(jīng)過配對t檢驗(yàn)，t=-6.64，P=0.0012<0.05, 其Ct值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 兩種Real-time PCR方法檢測不同濃度質(zhì)粒樣品結(jié)果

注：兩種檢測方法Ct值比較P<0.05

Note:Ctvalue comparison of the two detection methods,P<0.05

2.3 兩種檢測方法的特異性比較 上述兩種方法分別用于檢測PSAD酶切前后的質(zhì)粒、肝組織及血清標(biāo)本中HBV cccDNA，其Ct均值見圖1，兩種方法均能區(qū)分PSAD酶切前后HBV cccDNA，具有良好特異性。

用PSAD酶切后去除了線狀及開環(huán)的HBV rcDNA等非特異反應(yīng)，檢測的只是共價(jià)閉合環(huán)狀HBVcccDNA，核酸含量較未用PSAD酶切前有所降低，Ct值相應(yīng)升高(Ct值越高表示核酸含量越少)。圖1中質(zhì)粒受PSAD酶切影響較小，Ct值增高不明顯；肝組織中HBV cccDNA及HBV rcDNA等都存在，Ct值有一定變化；血清中主要為HBV rcDNA，PSAD酶切后去除了rcDNA等非特異反應(yīng)，Ct值增高明顯 (其中方法1Ct值由PSAD酶切前27.31±0.22升高到酶切后35.66±0.48；方法2由28.25±0.34升高到37.0±0.45)，分別處于兩種檢測方法的臨界值或陰性值。

圖1 質(zhì)粒、肝組織及血清標(biāo)本PSAD酶切前后分別用兩種方法檢測的Ct均值. a，c,e:用PSAD酶切； b,d,f:未用PSAD酶切Fig.1 Ct mean value of the samples (plasmid, liver tissue and serum) with or without PSAD digestion detected by two kinds of real time PCR methods. a,c,e:With PSAD digestion; b,d,f: Without PSAD digestion

2.4 重復(fù)性檢測 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品從1.78 x 106-1.78x101分別用兩種方法重復(fù)檢測3次，結(jié)果見表2，兩種方法的變異系數(shù)均在4% 以內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)差均小于1，具有較好的重復(fù)性。

3 討論

我國為HBV感染大國，2006年全國血清流行病學(xué)調(diào)查顯示我國乙肝表面抗原陽性率為7.2%，HBV感染與肝硬化肝癌關(guān)系密切，對乙型肝炎的預(yù)防控制與治療仍然十分重要[1]。

目前對肝組織細(xì)胞中HBV cccDNA檢測并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方法，肝組織取樣較困難且核酸提取有一定難度。Real time PCR法通常根據(jù)HBV rcDNA 與cccDNA結(jié)構(gòu)差異，選擇跨缺口引物及探針擴(kuò)增HBV cccDNA，因高濃度rcDNA PCR產(chǎn)物可以跨過缺口產(chǎn)生假陽性，需用PSAD酶消化線性雙鏈或單鏈DNA以及環(huán)狀單鏈DNA，去除擴(kuò)增中的非特異反應(yīng)，常用的DNA酶包括PSAD酶，S1酶、綠豆核酸酶等，酶切時(shí)應(yīng)掌握好底物DNA濃度及相關(guān)酶用量，使酶切消化完全徹底[4-7]。

本研究用兩種探針對PSAD酶消化前后的質(zhì)粒、血清及肝組織HBV cccDNA檢測結(jié)果表明，質(zhì)粒主要為閉合環(huán)狀DNA，Ct值受PSAD酶切影響不大；肝組織中閉合環(huán)狀cccDNA及部分雙鏈環(huán)狀rcDNA等形式都存在，PSAD酶切后Ct值有一定變化；血清中主要為rcDNA，經(jīng)PSAD酶切去除非特異反應(yīng)后，其HBV cccDNA明顯降低，Ct值增高明顯，分別處于兩種檢測方法的臨界值或陰性值，其比肝組織中HBV cccDNA拷貝數(shù)降低要多。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[8]HBV cccDNA 主要存在于肝細(xì)胞核中，血清中的HBV cccDNA 一般認(rèn)為是肝細(xì)胞壞死后其核中的HBV cccDNA釋放到血清中所致，在血清中的濃度與肝細(xì)胞損害程度有關(guān)。今后應(yīng)進(jìn)一步檢測更多標(biāo)本以得到更多分析結(jié)果。

方法1[5]為常規(guī)Taq-Man探針，文獻(xiàn)中檢測下限為3.44×100拷貝/μl，需3步 Real time PCR反應(yīng)耗時(shí)略長；方法2[6]是Taq-Man MGB探針，文獻(xiàn)中檢測靈敏度為4×102拷貝/ml，需2步 Real time PCR反應(yīng)，MGB 標(biāo)記費(fèi)用略高；二者均能很好區(qū)分PSAD酶切前后HBV cccDNA，但研究所用引物及探針序列、標(biāo)記熒光物質(zhì)、選用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品及濃度換算、實(shí)驗(yàn)條件等均不同，未進(jìn)行過平行比較。本研究用上述兩種方法最佳條件對相同標(biāo)本進(jìn)行檢測，進(jìn)一步印證了相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[9]，表明兩種檢測方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，方法1敏感性略高，方法2本底更低。檢測結(jié)果可能與兩種方法所用引物及探針在HBV基因組中的位置、標(biāo)記熒光物質(zhì)等不同有關(guān)，更多影響因素有待更多實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)MGB探針在探針引物的3′ 端含有自身不發(fā)光的MGB(小型凹槽結(jié)合物)，結(jié)合DNA序列更穩(wěn)固，提高了反應(yīng)的Tm值，使得 Real time PCR 反應(yīng)特異性更高[6]；同時(shí)因?yàn)樘结樰^短(對于AT含量高的探針序列十分有利)，淬滅效果好，本底較低；但與常規(guī) TaqMan 探針相比，MGB探針對模版要求更嚴(yán)格，二者出現(xiàn)一個堿基錯配即不能雜交，靈敏度略低；常規(guī) TaqMan 探針?biāo)栊蛄休^ MGB探針長，可發(fā)光的熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)距離較遠(yuǎn)，本底較高；但對于簡并序列具有一定優(yōu)勢，敏感性也略高[9-11]。隨著HBV cccDNA 檢測技術(shù)的不斷完善和選擇更加敏感特異的引物及探針序列，希望會有更加敏感特異以及標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的HBV cccDNA 檢測方法問世，以利于疾病的進(jìn)一步診斷與治療。

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Comparison of two Taq-man Real-time PCR methods for detection of HBV cccDNA

CaoJinglin,DouJian,ZhouWenting,RenGuijun.

DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheThirdHospital,HeBeiMedicalUniversity,Shijiazhuang, 050051,China(CaoJL、DouJ、RenGJ);NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China(ZhouWT).Correspondingauthor:CaoJinglin,Email:cjlcpx@sina.com

Objective To compare two Taq-man Real-time PCR methods for detection of hepatitis B virus covalently closed circular DNA (HBV cccDNA) in serum or liver tissue. Methods Two sets of primers and probes (common Taq-Man probe and MGB Taq-Man probe) were synthesized according to the reference papers, and the sensitivity and specificity of the two methods were compared using prepared plasmid as standard curve, and HBV DNA samples were exlracted from serum and liver tissue samples of hepatitis B patients. The samples were tested with both methods separately before or after the digestion with a Plasmid-Safe ATP-dependent Dnase (PSAD). Results Both of these two kinds of detection methods had a good linear relationship with the prepared plasmid as standard curve (R20.989 or 0.976 respectively, CV were within 4% ), and obtained good specificity when the HBV DNA samples were tested before or after digestion with PSAD. The common Taq-Man probe had lowerCtvalue than MGB probe when the samples in the same concentration. Conclusions Both methods can be used for HBV cccDNA detection. The common Taq-Man probe has slightly higher sensitivity than MGB probe, while the MGB probe has lower background than the common Taq-Man probe in our test. One can select the appropriate probe according to the need.

Hepatitis B Virus; Covalently closed circular DNA; Real-time PCR

曹經(jīng)琳，Email：cjlcpx@sina.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.01.015

肝炎病毒,乙型； 共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)；Real-time PCR

2016-11-21)