不同滴度輪狀病毒對新生小鼠肝膽系統(tǒng)損傷的比較

林澤鋒 曾信豪 張紅 付銘 張銳忠 夏慧敏

510120 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心小兒外科

·論著·

不同滴度輪狀病毒對新生小鼠肝膽系統(tǒng)損傷的比較

林澤鋒 曾信豪 張紅 付銘 張銳忠 夏慧敏

510120 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心小兒外科

目的 比較不同滴度輪狀病毒(Rhesus rotavirus,RRV)對新生小鼠肝膽系統(tǒng)損傷的差異。方法 新生小鼠出生24 h內(nèi)，腹腔注射恒河猴輪狀病毒(MMU18006病毒株)建立肝膽損傷動(dòng)物模型；將80只BALB/c新生小鼠隨機(jī)分成4組，每組20只，實(shí)驗(yàn)組分別注射不同滴度輪狀病毒懸液，依次為高滴度(1×107PFU/ml)、中滴度(1×106PFU/ml)、低滴度實(shí)驗(yàn)組(2.5×105PFU/ml)，正常對照組僅注射病毒培養(yǎng)液；觀察小鼠體重、黃疸發(fā)生時(shí)間，于出生后第12天收取標(biāo)本時(shí)，經(jīng)小鼠膽囊行肝外膽道造影，鏡下觀察小鼠膽管情況，并收取血清和肝膽組織，分別進(jìn)行肝功能檢測和病理染色分析。結(jié)果 與正常小鼠相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠均有不同程度的皮膚黃疸、體重增加緩慢、生存率下降、肝功能損傷。低滴度組表現(xiàn)較輕且皮膚黃疸、體重及肝功能可恢復(fù)正常；與低滴度組相比，高滴度組皮膚黃疸更明顯，體重顯著性降低且不可逆，生存率低(50%)，肝功能指標(biāo)TBIL、DBIL、TBA、ALT、ALP顯著性升高。進(jìn)一步膽道造影顯示高滴度組閉鎖率高(80%)，低滴度組無閉鎖。病理學(xué)分析顯示高滴度組肝內(nèi)膽管閉鎖，匯管區(qū)大量炎癥細(xì)胞浸潤，而低滴度組肝內(nèi)膽管形態(tài)正常，匯管區(qū)僅有少量炎癥細(xì)胞浸潤。結(jié)論 不同滴度輪狀病毒對新生小鼠肝膽系統(tǒng)影響不同：高滴度易引起膽道閉鎖，低滴度引起肝炎。

Fund programs: State Clinical Key Specialty Construction Project(Pediatric Surgery)(GJLCZD1301)； Guangdong Provincial Science and Technology Plan Projects(2014A020212373)

膽道閉鎖(Biliary atresia，BA)是發(fā)生于嬰幼兒的進(jìn)行性炎癥性膽管病，是引起嬰幼兒阻塞性黃疸常見疾病，最終導(dǎo)致肝外、肝內(nèi)膽管的梗阻及肝硬化，預(yù)后差，病死率高[1]。在病程初期與新生兒肝炎臨床表現(xiàn)相似、難以鑒別，但二者預(yù)后相差甚遠(yuǎn)，新生兒肝炎可完全恢復(fù)。相關(guān)研究提示二者皆與圍生期病毒感染密切相關(guān)[2, 3]，但由于致病因素的強(qiáng)弱不同以及遺傳易感性等因素，其病程的轉(zhuǎn)歸與預(yù)后相差甚遠(yuǎn)。

Petersen等[4]使用恒河猴輪狀病毒(Rhesus rotavirus，RRV)對出生24 h內(nèi)的新生小鼠進(jìn)行腹腔注射，成功建立了臨床上膽道閉鎖疾病研究的重要?jiǎng)游锬Ｐ?。該方法中使用的病毒滴度較高(常規(guī)病毒滴度1×106PFU/ml，20 μl/只)，所以導(dǎo)致肝內(nèi)肝外膽道出現(xiàn)持續(xù)的損傷，從而不能重建新的膽道系統(tǒng)，最終形成膽道閉鎖，導(dǎo)致小鼠死亡。而低滴度的病毒液引起肝膽損傷的癥狀較輕，僅表現(xiàn)出一過性的肝炎癥狀，即模擬新生兒肝炎的病理變化。故采用不同滴度的輪狀病毒懸液來建立肝膽系統(tǒng)損傷動(dòng)物模型，為研究膽道閉鎖和新生兒肝炎提供理想的研究手段。而目前國內(nèi)的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。

為驗(yàn)證此假說，本研究通過不同滴度的輪狀病毒感染BALB/c新生小鼠建立肝膽損傷動(dòng)物模型，對小鼠的生長情況及肝內(nèi)外膽管進(jìn)行觀察，并進(jìn)行病理學(xué)分析，為膽道閉鎖與新生兒肝炎的病因?qū)W差異提供動(dòng)物學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和細(xì)胞:恒河猴輪狀病毒(MMU18006病毒株)，購置于美國菌種保藏中心(ATCC VR-1739TM)。猴腎MA-104細(xì)胞，由香港疾病防控中心饋贈(zèng)。細(xì)胞培養(yǎng)液，最低必須培養(yǎng)基(Mminimum essential medium，MEM)。10%胎牛血清Eagle-MEM培養(yǎng)基作為細(xì)胞培養(yǎng)液。無胎牛血清Eagle-MEM培養(yǎng)基作為細(xì)胞維持液。

1.1.2 動(dòng)物:BALB/c孕鼠、8周齡、無特定病原體級(SPF級)，購自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)在中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心超凈生物層流架內(nèi)。

1.1.3 主要設(shè)備:尼康光學(xué)解剖顯微鏡(Nikon SMZ-1000，日本)。

1.2 方法

1.2.1 病毒擴(kuò)增和滴定： MA-104細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的Eagle-MEM培養(yǎng)基中，細(xì)胞生長成單層后用Hanks液洗滌3次，感染經(jīng)10U/ml胰蛋白酶37℃預(yù)處理30 min的恒河猴輪狀病毒，37℃吸附60 min，棄掉上清液，加含1U/ml胰蛋白酶的無胎牛血清的Eagle-MEM維持液，37℃ 5%CO2靜止培養(yǎng)，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后收獲，將病毒懸液分裝保存于-80℃冰箱備用；采用改良空斑形成法[5]測定病毒滴度，待病毒滴度達(dá)到107PFU時(shí)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 建立新生小鼠肝膽損傷動(dòng)物模型：將定時(shí)配種后的BALB/c孕鼠按單只每籠飼養(yǎng)在中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心超凈生物層流架內(nèi)并進(jìn)行隔離，將出生24 h內(nèi)的80只BALB/c新生小鼠(1.6±0.15 g)按窩隨機(jī)分成4組(高滴度實(shí)驗(yàn)組、中滴度實(shí)驗(yàn)組、低滴度實(shí)驗(yàn)組和正常對照組)，每組20只，注射劑量為20 μl/每只。根據(jù)腹腔注射不同滴度輪狀病毒懸液，將實(shí)驗(yàn)組依次分為高滴度實(shí)驗(yàn)組(1×107PFU)、中滴度實(shí)驗(yàn)組(1×106PFU)、低滴度實(shí)驗(yàn)組(2.5×105PFU)；正常對照組僅注射病毒培養(yǎng)基(MEN液)，劑量同實(shí)驗(yàn)組。每日記錄小鼠體重，并觀察無毛區(qū)皮膚顏色、大小便顏色。

1.2.3 標(biāo)本取材：將存活至生后第12天的各組小鼠進(jìn)行取材。收獲時(shí)①拍照記錄肝臟外觀、膽囊外觀、肝外膽道外觀；②常規(guī)膽囊注射美蘭進(jìn)行肝外膽道造影：從膽囊底部注射美蘭溶液，觀察左右肝管和膽總管是否通暢，并拍照記錄；③心臟采血進(jìn)行肝功能分析；④部分肝臟及肝外膽道保存于10%福爾馬林；⑤部分新鮮肝臟組織液氮保存。

1.2.4 病理學(xué)分析：用10%福爾馬林固定新鮮小鼠肝組織，過夜后常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、H&E染色。采用SP染色法，進(jìn)行小鼠肝組織CK19免疫組織化學(xué)染色，CK19(Rabbit-anti mouse)購自于Abcam公司。DAB顯色試劑盒、anti-rabbit HRP二抗購自DAKO公司。通過顯微鏡下觀察肝膽組織的病理改變。

注：各組小鼠體型與皮膚黃疸程度(A)；各組體重變化曲線(B)和生存曲線(C)；各組肝功能數(shù)據(jù)(D、E、F)圖1 不同滴度輪狀病毒對新生小鼠肝膽系統(tǒng)損傷的生存狀況比較Note: Mice body size and degree of skin jaundice (Fig.1A); Weight change curve (Fig.1B) and survival curve (Fig.1C); Liver function level (Fig.1D、1E、1F)Fig.1 Comparison of living situation of hepatobiliary injury for newborn BALB/C mice which induced by different titers of rhesus rotavirus

2 結(jié)果

2.1 感染RRV后小鼠的生存狀況 與正常對照組小鼠比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠平均出生后第6天出現(xiàn)無毛區(qū)皮膚變黃，其中高滴度組黃疸嚴(yán)重，而低滴度組較輕(圖1A)。小鼠體重變化曲線(圖1B)顯示：實(shí)驗(yàn)組生后第12天平均體重較正常對照組降低，高、中、低滴度實(shí)驗(yàn)組和正常對照組平均體重依次為(3.87±0.34)g、(3.69±0.69)g、(6.64±0.83)g、(7.93±0.95)g，正常對照組與高、中滴度組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均為P<0.001)，與低滴度組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.061)。其中，高滴度組與低滴度組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。與正常對照組比較，各實(shí)驗(yàn)組生后第6天體重增加緩慢，出現(xiàn)顯著性差異；小鼠生后第9天時(shí)，與低滴度組平均體重(5.98±0.74)g比較，高滴度組平均體重(5.22±0.36)g顯著性降低(P=0.046)；小鼠生存曲線(圖1C)顯示：高滴度組生后第5天出現(xiàn)死亡，第12天存活率僅50%；低滴度組黃疸逐漸消退，體重緩慢增加，第12天存活率95%。從數(shù)據(jù)分析得出，病毒高滴度水平致小鼠皮膚黃疸更明顯，體重顯著性降低且不可逆，生存率低；病毒低滴度水平致小鼠皮膚黃疸輕、生存率高，體重和黃疸情況可恢復(fù)正常。

2.2 感染RRV后小鼠第12天的血清肝功能比較 肝功能數(shù)據(jù)顯示，高、中、低滴度組的總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、總膽汁酸(TBA)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)水平(圖1D、1F)與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001)。其中，高、低滴度組肝功數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。然而，實(shí)驗(yàn)組與正常組的肝臟蛋白質(zhì)合成功能的數(shù)據(jù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1E)。從數(shù)據(jù)分析得出，RRV病毒滴度的高低與小鼠肝功能的損傷程度存在相關(guān)聯(lián)系。

2.3 感染RRV后小鼠的肝臟表觀及肝外膽管形態(tài) 解剖小鼠時(shí)可見與低滴度組(圖2B)比較，高滴度組(圖2D)的肝臟表面出現(xiàn)嚴(yán)重的片狀壞死灶，而低滴度組的肝臟表面僅有少量的點(diǎn)狀壞死灶；中滴度組(圖2C)膽管呈纖維條索狀閉鎖，膽囊充盈，內(nèi)用典型的白膽汁，肝臟有散在的點(diǎn)狀壞死灶。經(jīng)膽囊底部注射美蘭，行肝外膽管造影顯示：正常對照組(圖2A)和低滴度實(shí)驗(yàn)組肝外膽管通暢、膽管形態(tài)正常，而高、中滴度實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝外膽管則呈條索狀，美蘭造影顯示不通暢，這說明肝外膽管發(fā)生了閉鎖。

2.4 感染RRV后小鼠的肝內(nèi)膽管發(fā)育情況 利用H&E和免疫組化染色觀察肝內(nèi)膽管發(fā)育情況。通過H&E染色觀察，與正常對照組(圖2E)比較，實(shí)驗(yàn)組的膽管上皮細(xì)胞周圍出現(xiàn)不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤(圖2F、2G、2H)。通過CK19染色觀察，與正常對照組(圖2I)比較，實(shí)驗(yàn)組的肝內(nèi)膽管正常結(jié)構(gòu)消失，并伴有肝內(nèi)小膽管代償性增生，且增生的小膽管結(jié)構(gòu)不完整，匯管區(qū)結(jié)構(gòu)紊亂，少量纖維化(圖2J、2K、2L)。與低滴度組相比，高滴度組肝組織的膽管畸形、炎癥浸潤更加明顯。這提示了RRV是一種嗜膽病毒，對小鼠的膽管上皮造成持續(xù)性的炎癥損傷。低滴度RRV對小鼠肝內(nèi)膽管破壞輕，而高滴度RRV對小鼠肝內(nèi)膽管破壞重，造成肝內(nèi)小膽管代償性增生，結(jié)構(gòu)不完整、缺損、甚至閉鎖。

表1 各組新生小鼠出生12天肝功能數(shù)據(jù)表±s)

注：與低滴度組相比，高滴度組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：△表示P<0.05，*表示P<0.01

Note: Statistically significant difference of the high titer group when compared with the low titer group:△:P<0.05，*:P<0.01

注：正常對照組(A、E、I)、低滴度組(B、F、J)、中滴度組(C、G、K)和高滴度組(D、H、L)；膽囊(長箭頭)，膽道閉鎖或狹窄部位(粗箭頭)，肝外膽管形態(tài)(虛線)，肝臟表面炎癥壞死灶(三角形)；H&E染色(×100)，肝內(nèi)膽管CK19染色(短箭頭，×400)圖2 各組新生小鼠12天肝膽表觀、炎癥程度、膽管發(fā)育情況Note: The normal control group (A、E、I),low titer group (B、F、J),medium titer group (C、G、K) and high titer group (D、H、L). Gallbladder (long arrow),biliary atresia or stenosis (thick arrow),extrahepatic bile duct shape (dashed line),liver surface inflammatory necrosis (triangle). H&E staining(×100),intrahepatic bile duct CK19 staining (arrowhead,×400)Fig.2 The appearance of liver and extrahepatic bile duct, degree of inflammation, and the morphology of intrahepatic bile duct

3 討論

膽道閉鎖與新生兒肝炎二者在病程初期臨床表現(xiàn)相似，但預(yù)后相差甚遠(yuǎn)，常需要作出明確的鑒別，二者可能經(jīng)歷同一疾病病理演變的過程，卻在最初發(fā)病的時(shí)間和部位不同，導(dǎo)致疾病嚴(yán)重程度不同[6]。多數(shù)學(xué)者通過病理學(xué)的觀察，認(rèn)為膽道閉鎖與新生兒肝炎的肝臟病理組織變化極為相似，只是一種炎癥病變不同階段的表現(xiàn)，且可同時(shí)存在[7]。新生兒肝炎是炎癥過程的早期表現(xiàn)，而膽道閉鎖是其終末階段，經(jīng)炎癥持續(xù)性破壞，繼而膽管出現(xiàn)瘢痕纖維化閉塞，膽管上皮細(xì)胞破壞，致使膽管發(fā)生閉鎖，形成梗阻性膽汁淤積。為明確二者的關(guān)系，本研究在參考Petersen膽道閉鎖模型的基礎(chǔ)上，通過高、低滴度RRV誘導(dǎo)BALB/c新生小鼠肝膽損傷動(dòng)物模型，能模擬出膽道閉鎖、新生兒肝炎急性期的發(fā)病過程及基本病理變化。近年研究發(fā)現(xiàn)膽道閉鎖有可能是在圍生期(孕28周至出生后4周)時(shí)由嗜膽病毒(最可能為巨細(xì)胞病毒、輪狀病毒或呼腸病毒)感染所激發(fā)，造成機(jī)體以膽管為中心的免疫功能紊亂，隨之發(fā)生一系列病理改變，包括膽管周圍炎癥浸潤、膽道上皮細(xì)胞凋亡、膽管堵塞閉鎖和肝臟進(jìn)行性纖維化等[8-10]。早期，有研究學(xué)者采用RT-PCR的分析方法比較膽道閉鎖、新生兒肝炎患兒的肝膽組織輪狀病毒RNA的基因表達(dá)量，二者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[11]。但由于致病因素的強(qiáng)弱不同以及遺傳易感性等因素，其病程的轉(zhuǎn)歸及預(yù)后相差甚遠(yuǎn)。高滴度RRV誘導(dǎo)的膽道閉鎖動(dòng)物模型，因其存活率低，只能模擬出該疾病早期階段的炎癥過程，并不能形成終末階段纖維化所致的肝硬化。因此，能否通過降低RRV的滴度來模擬新生兒肝炎的發(fā)生，并最終形成肝硬化。然而，新生小鼠的免疫系統(tǒng)能有效的清除RRV[12]。國內(nèi)學(xué)者指出RRV感染后的BA動(dòng)物模型有約25%小鼠在兩周以后黃疸逐漸消退并恢復(fù)正常[13]?？紤]到病毒引起的新生兒肝炎具有一定的自限性，預(yù)后較好[14-16]，這與本研究觀察到的現(xiàn)象符合。實(shí)際上，RRV感染新生小鼠后，膽管的纖維化和肝門部的炎癥并不隨病毒的清除而停止[13, 17]，故解釋了BA患兒可能早期存在病毒感染，但晚期被機(jī)體清除。新生兒的免疫系統(tǒng)雖能有效清除胎兒期或圍生期感染的病毒，但殘留的病毒蛋白能誘發(fā)膽道上皮細(xì)胞的自身免疫[18]，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)引起膽道上皮進(jìn)行性的損傷，并阻礙膽管正常發(fā)育而導(dǎo)致纖維化閉鎖。因此可通過高、低滴度RRV誘導(dǎo)的小鼠肝膽損傷模型，并結(jié)合膽道閉鎖、新生兒肝炎的發(fā)病特點(diǎn)，進(jìn)一步觀察其中可能的機(jī)制及致病原因。

通過高、低滴度RRV誘導(dǎo)疾病模型來模擬出膽道閉鎖與新生兒肝炎疾病發(fā)生、發(fā)展相似的過程，進(jìn)而探討二者的致病機(jī)制。本研究證實(shí)RRV病毒滴度的高低：①高滴度致小鼠皮膚黃疸更明顯，體重顯著性降低且不可逆，生存率低，而低滴度致小鼠皮膚黃疸輕、生存率高，體重和黃疸情況可恢復(fù)正常；②與小鼠肝功能損傷有直接的影響，高滴度易引起膽道閉鎖，低滴度引起肝炎；③與小鼠肝外膽管狹窄、閉鎖，肝內(nèi)膽管破缺損、不完整和匯管區(qū)炎癥程度有明顯的影響。但在RRV侵襲膽管發(fā)育這一過程中，是如何通過激發(fā)或介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致膽道炎癥乃至閉鎖，均未得到進(jìn)一步證實(shí)，并且低滴度RRV對新生小鼠肝膽系統(tǒng)的影響尚未見報(bào)道。通過本研究提示：RRV的病毒滴度高低直接影響了小鼠膽管發(fā)育及其炎癥損傷的程度；高、低滴度RRV誘導(dǎo)的肝膽損傷動(dòng)物模型與臨床上的膽道閉鎖、新生兒肝炎二者的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后具有相似的特征。

通過比較不同滴度RRV對新生小鼠肝膽系統(tǒng)損傷的差異，為膽道閉鎖與新生兒肝炎的病因?qū)W差異提供動(dòng)物學(xué)證據(jù)，為探索膽道閉鎖、新生兒肝炎二者發(fā)病機(jī)制與臨床治療提供研究依據(jù)。

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Comparison of hepatobiliary injury for newborn BALB/c mice which induced by different titers of rhesus rotavirus

LinZefeng，ZengXinhao，ZhangHong，F(xiàn)uMing，ZhangRuizhong，XiaHuimin

DepartmentofPediatricSurgery，MunicipalWomen&Children’sMedicalCenter，GuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou510120，ChinaCorrespondingauthor:ZhangRuizhong，Email:cowboy2006@163.com

Objective To compare the hepatobiliary injury difference of newborn BALB/c mice infected by different titers of rhesus rotavirus(RRV). Methods Neonatal mice(n=80) were randomly separated into 4 groups and were intraperitoneally inoculated with different titers of rotavirus: High titer group(1×107PFU/ml); Medium titer group(1×106PFU/ml); Low titer group(2.5×105PFU/ml); Control group (only culture medium) within the first 24 hours after birth. All mice were sacrificed at day 12 after RRV inoculation then the liver and blood samples were collected. Meanwhile, mice were observed daily for at least 12 days, including their weight, skin color and survival situation. Liver functions were examined by serum biochemical test and morphologic changes in the biliary tract were observed. Tissue sections underwent H&E staining and immunohistochemically analysis for the presence of CK19. ResultsCompared with the normal mice, the mice in the experimental group had different degrees of skin jaundice, weight lost, survival rate decreased, liver function damage. In the experimental group, the symptom of low titer group was light, and could be restored to normal, however, when compared with the low titer group, the mice in the high titer group were serious, their skin jaundice was more obvious, weight was significantly reduced and irreversible, survival rate was lower(50%),liver function of TBIL,DBIL,TBA,ALT,ALP were significantly increased.Further analysis showed that the high titer group had high bile duct obstruction rate (80%),with no case of obstruction in the low titer group. Histologic analysis also showed intrahepatic bile duct atresia in the high titer group, a large number of inflammatory cell infiltrated around the portal area, while the morphology of intrahepatic bile duct was almost normal and just a small amount of inflammatory cell infiltrated around the portal area in the low titer group.Conclusions Different titers of rotavirus had different effects on the newborn mice hepatobiliary system: high titer was easy to cause biliary atresia, and low titer caused hepatitis.

Rotavirus；Biliary atresia；Neonatal hepatitis

張銳忠，Email：cowboy2006@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.01.004

輪狀病毒屬；膽道閉鎖；肝炎

2013年國家臨床重點(diǎn)專科建設(shè)項(xiàng)目(小兒外科)(GJLCZD1301)；廣東省省級科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A020212373)

2016-06-02)