胡椒堿對HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型糖代謝AMPK信號通路上游靶點(diǎn)干預(yù)機(jī)制的研究

萬春平+魏雅改+李曉雪+張麗君+楊瑞+包照日格圖

[摘要]探討胡椒堿對胰島素抵抗（insulin resistance，IR）細(xì)胞模型糖代謝紊亂的作用及干預(yù)AMPK信號通路上游靶點(diǎn)的分子機(jī)制。通過脂肪乳誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞構(gòu)建胰島素抵抗模型。葡萄糖氧化酶（GOD-POD）法檢測各組葡萄糖消耗量；酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測上清液中脂聯(lián)素（adiponectin，APN）、瘦素（leptin，LEP）的水平；熒光定量 PCR法檢測APN，LEP mRNA的表達(dá)水平，Western blotting法檢測AMPKα，р-AMPKα，瘦素受體（LepR），脂聯(lián)素受體1（AdipoR1）和脂聯(lián)素受體2（AdipoR2）蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，胡椒堿與降糖藥羅格列酮、AMPK激動劑AICAR均能明顯提高胰島素抵抗細(xì)胞模型的葡萄糖消耗量，升高脂聯(lián)素水平、增加脂聯(lián)素mRNA、脂聯(lián)素受體1蛋白的表達(dá)，也增加AMPKα mRNA和р-AMPKα蛋白表達(dá)；同時(shí)降低瘦素mRNA和瘦素受體蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，胡椒堿能顯著改善胰島素抵抗細(xì)胞模型糖代謝紊亂，其作用機(jī)制可能通過調(diào)控上游脂聯(lián)素和瘦素的表達(dá)，從而激活A(yù)MPK信號通路。

[關(guān)鍵詞]胡椒堿； 磷酸腺苷激活的蛋白激酶； 胰島素抵抗； 瘦素； 脂聯(lián)素

[Abstract]To investigate the effect of piperine on the disorder of glucose metabolism in the cell model with insulin resistance （IR） and explore the molecules mechanism on intervening the upstream target of AMPK signaling pathway. The insulin resistance models in HepG2 cells were established by fat emulsion stimulation. Then glucose consumption in culture supernatant was detected by GOD-POD method. Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） was used to measure the levels of leptin（LEP） and adiponectin（APN） in culture supernatant； Real-time quantitative PCR was used to assess the mRNA expression of APN and LEP； and the protein expression levels of LepR， AdipoR1， AdipoR2 and the activation of AMPK signaling pathway were detected by Western blot analysis. The results showed that piperine， rosiglitazone and AMPK agonist AICAR could significantly elevate the glucose consumption in insulin resistance cell models， enhance the level of APN， promote APN mRNA transcripts and increase the protein expression of Adipo receptor. Meanwhile，AMPKα mRNA and р-AMPKα protein expressions were also increased in piperine treated cells， but both LEP mRNA expression and LepR protein expressions were decreased in piperine treated group. The results indicated that piperine could significantly ameliorate the glucose metabolism disorder in insulin resistance cell models through regulating upstream molecules （APN and LEP） of AMPK signaling pathway， and thus activate the AMPK signaling pathway.

[Key words]piperine； AMPK signaling pathway； insulin resistance； leptin； adiponectin

胰島素抵抗是2型糖尿病、高血壓和冠心病的生理病理基礎(chǔ)^[1]。主要表現(xiàn)為胰島素敏感性降低，不能促進(jìn)外周靶組織（脂肪組織、肝臟、骨骼?。┑钠咸烟菙z取和利用^[1]。因此，改善胰島素抵抗是治療糖尿病和相關(guān)并發(fā)癥的有效干預(yù)措施^[2]。AMPK在各組織中分布廣泛，是細(xì)胞內(nèi)主要的“能量感受器”，對代謝穩(wěn)態(tài)起著總開關(guān)的作用。AMPK調(diào)節(jié)異常與胰島素抵抗密切相關(guān)^[3]。

胡椒堿（piperine，PIP）是胡椒科植物如胡椒、蓽茇等植物中一種生物活性較強(qiáng)的生物堿。本課題前期實(shí)驗(yàn)研究已證明，不同濃度的蓽茇醇提物及有效成分胡椒堿可顯著降低IR模型大鼠的FBS水平、血清FFA、血壓升高和改善糖耐量異常現(xiàn)象、增強(qiáng)胰島素敏感指數(shù)等關(guān)鍵指標(biāo)的病理性變化、改善IR模型大鼠血清腫瘤壞死因子-α和瘦素水平異常升高^[4-7]。然而其干預(yù)作用靶點(diǎn)尚未明確，需進(jìn)一步研究。本研究進(jìn)一步在脂肪乳誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞構(gòu)建胰島素抵抗模型上，探討胡椒堿對AMPK信號通路上游靶點(diǎn)的分子機(jī)制，為其治療代謝性疾病藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥品和試劑 胡椒堿（piperine，PIP）購于中國食品藥品檢定研究院。胰島素、地塞米松（DEX）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、二甲基亞砜（DMSO）、油紅O（oil red O）購于美國Sigma公司；羅格列酮購于成都恒瑞生物制藥公司；AICAR購于碧云天生物技術(shù)研究所；DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS溶液、南美胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液購于美國Hyclone公司；胰蛋白酶消化液購于美國Gibco公司；葡萄糖測定試劑盒購于中生北控生物科技股份有限公司；Mouse Leptin（LEP） ELISA Kit，Mouse Adiponectin（ADP） ELISA Kit購于武漢華美生物工程有限公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購于北京康為公司；熒光定量引物由上海捷瑞公司合成；PVDF膜購于Millipore公司，ECL顯色試劑盒、Tris Base、30%丙烯酰胺、過硫酸銨（AP）、TEMED購于Bio-Rad公司；Tween-20、甘氨酸（glycine）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、PMSF、2-巰基乙醇、溴酚蘭購于北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；HCI購于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；AMPKα，р-AMPKα抗體購于cellsignaling公司；AdipoR1，AdipoR2抗體購于SANTA公司；LepR，β-actin抗體購于proteintech公司。

1.2 細(xì)胞 HepG2細(xì)胞由中國科學(xué)院昆明動物研究所饋贈，用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于5%CO₂，37 ℃的濕潤培養(yǎng)箱中。

1.3 儀器 SW-CJ-1F型CO₂培養(yǎng)箱（日本三洋科技有限公司）；allegraX-22臺式離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特有限公司）；ABI Prism 7300熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；垂直電泳槽、電泳儀凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 HepG2細(xì)胞IR模型的建立、分組和給藥 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以3×104個(gè)/mL接種至96孔板。待細(xì)胞長至80%左右，用無血清的培養(yǎng)液饑餓處理24 h，使細(xì)胞同步化。設(shè)為正常組（N）、模型組（M）、陽性藥組（ROG，AICAR）、PIP組（2.5，5，10，20，40 μmol·L^-1）、溶媒組（0.1%DMSO）、陰性對照組（Compound C）以及Compound C+PIP組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，除正常外，其他各組用含10%脂肪乳的培養(yǎng)液分別誘導(dǎo)48 h，構(gòu)建IR模型，成功制備IR模型后給藥24 h后，用葡萄糖氧化酶法（GOD-POD法）測定各實(shí)驗(yàn)組和原DMEM培養(yǎng)基的葡萄糖含量，計(jì)算葡萄糖消耗量，葡萄糖消耗量為DMEM 培養(yǎng)基葡萄糖量與實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基葡萄糖量之差。并收集細(xì)胞，-80 ℃存儲備用。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA） 試驗(yàn)按同樣的實(shí)驗(yàn)方法建立IR模型、分組、給藥，分別收集PIP作用12，24，36，48 h的上清液，用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測脂聯(lián)素（APN）、瘦素（LEP）的含量。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 用Trizol提取細(xì)胞樣品的RNA，取1 μL測定樣品的濃度，以20 μL體系將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以此為模板，分兩步進(jìn)行PCR擴(kuò)增，第一步：95 ℃ 10 min，第二步：95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增所用熒光定量引物： Adiponectin上游引物序列5′-AGAATCATTATGACGGCAGCA-3′，下游引物序列5′-CCAGATGGAGGAGCACAGAG-3′，產(chǎn)物長度198 bp；Leptin上游引物序列5′-CCAGATGGAGGAGCACAGAG-3′，下游引物序列5′-TGTCTTATGTTCAAGCAGTGCCTAT-3′，產(chǎn)物長度138 bp；β-actin上游引物序列5′-CGTGCGTGACATCAAAGAGAAG-3′，下游引物序列5′-CCAAGAAGGAAGGCTGGAAAA-3′，產(chǎn)物長度180 bp，由上海捷瑞公司合成。通過觀察溶解曲線和擴(kuò)增曲線衡量結(jié)果，并以β-actin為內(nèi)參，用2-ΔΔCt方法來對結(jié)果進(jìn)行分析。

2.4 蛋白免疫印跡 用含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液于冰上裂解細(xì)胞，離心后取上清，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。將樣品用10%SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，用以下一抗：AMPKα抗體（1∶1 000）、P-AMPKα抗體（1∶1 000）、AdipoR1抗體（1∶

1 000）、AdipoR2抗體（1∶500）、LepR抗體（1∶500）、β-actin抗體（1∶2 000），4 ℃孵育過夜，洗膜后加辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗室溫孵育2 h，充分洗膜后用ECL發(fā)光液覆蓋膜，成像，分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用±s表示。符合正態(tài)分布，方差齊性檢驗(yàn)，比較均值的差異采用t檢驗(yàn)，方差不齊，則用校正t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有顯著水平。

3 結(jié)果

3.1 PIP對IR細(xì)胞模型糖代謝紊亂的改善作用 與模型組比較，陽性藥羅格列酮和AICAR及PIP各個(gè)給藥組能增加葡萄糖消耗量，AICAR抑制劑Compound C作用30 min，再加PIP作用也能增加葡萄糖消耗量（P<0.05），但作用均弱于PIP組（表1）。提示PIP有改善胰島素抵抗細(xì)胞糖代謝紊亂的作用，此作用很可能是依賴于AMPK信號通路。

3.2 PIP對HepG2細(xì)胞IR模型APN，LEP mRNA的影響 PCR檢測結(jié)果顯示，與模型組相比較，ROG，AICAR和各濃度的PIP能升高APN mRNA表達(dá)； Compound C+PIP能夠升高其表達(dá)水平，表明PIP可以對抗Compound C對APN mRNA的抑制作用，通過上調(diào)APN的 mRNA表達(dá)，激活A(yù)MPK信號通路，改善HepG2細(xì)胞IR模型的糖代謝紊亂。LEP mRNA與APN mRNA的表達(dá)趨勢相反，模型組的mRNA表達(dá)高于正常組；ROG，AICAR和各濃度的PIP（2.5 μmol·L^-1除外）均能降低LEP mRNA表達(dá)；Compound C與模型組比較，也顯著降低LEP mRNA表達(dá)，但作用弱于10 μmol·L^-1 PIP組和Compound C+PIP組（圖1）。

3.3 PIP對HepG2細(xì)胞IR模型p-AMPKα，AMPKα，AdipoR1，AdipoR2，LepR蛋白表達(dá)的影響 與模型組比較，ROG，AICAR的蛋白表達(dá)量升高（P<0.001），各濃度PIP組也能顯著升高p-AMPKα/AMPKα，AdipoR2的蛋白表達(dá)，Compound C+PIP增加了p-AMPKα/AMPKα，AdipoR2的蛋白表達(dá)，但作用弱于10 μmol·L^-1PIP組。而AdipoR1蛋白在各組之間沒有明顯變化。說明PIP通過上調(diào)AdipoR2的蛋白表達(dá)，激活A(yù)MPK信號通路，改善HepG2細(xì)胞IR模型的糖代謝紊亂。LepR蛋白表達(dá)與p-AMPKα/AMPKα，AdipoR2的蛋白表達(dá)趨勢相反。模型組LepR蛋白表達(dá)明顯升高，ROG，AICAR以及各濃度的PIP均能降低其蛋白表達(dá)；Compound C也顯著降低LepR的蛋白表達(dá)；但若將Compound C與Compound C+PIP與10 μmol·L^-1PIP相比，則Compound C顯著升高LepR的蛋白表達(dá)，Compound C+PIP又能降低其表達(dá)（圖2）。

4 討論

胰島素抵抗（IR）是2型糖尿病及其并發(fā)的肥胖、冠心病、高脂血癥、高血壓、腦卒中等疾病共同的病理生理基礎(chǔ)。這些并發(fā)癥是2型糖尿病患者致死、致殘的最主要原因^[8]。胰島素抵抗是機(jī)體對生理濃度的胰島素的敏感反應(yīng)性低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種病理狀態(tài)，主要表現(xiàn)為胰島素抑制肝臟葡萄糖釋放以及外周組織（脂肪和肌肉）利用葡萄糖能力下降^[9]。因此，以改善胰島素抵抗為靶點(diǎn)，從天然產(chǎn)物中開發(fā)治療2型糖尿病新型候選藥物具有重要價(jià)值。

蓽茇為胡椒科植物蓽茇Piper longum L.的干燥近成熟或成熟果穗，為中醫(yī)、藏醫(yī)、蒙醫(yī)和傣醫(yī)的常用藥物。蓽茇辛、熱，入胃、大腸經(jīng)，功效為溫中散寒。故對脾氣虧虛胃寒引起的脘腹疼痛、嘔吐、腹瀉等癥有效。《中國藏藥》記載蓽茇味辛、苦，性溫。化味甘，具有“滋補(bǔ)體力，分離惡血和良血”功效。本研究前期實(shí)驗(yàn)研究已證明，不同濃度的蓽茇醇提物及有效成分胡椒堿可顯著降低IR模型大鼠的FBS水平、血清FFA、血壓升高和改善糖耐量異?，F(xiàn)象、增強(qiáng)胰島素敏感指數(shù)等關(guān)鍵指標(biāo)的病理性變化、改善IR模型大鼠血清腫瘤壞死因子-α和瘦素水平異常升高^[4-8]。然而其干預(yù)作用靶點(diǎn)尚未明確，需進(jìn)一步研究。磷酸腺苷（AMP）激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一種在細(xì)胞內(nèi)行使能量代謝調(diào)節(jié)的蛋白激酶，參與包括糖、脂肪、蛋白質(zhì)以及細(xì)胞生長和凋亡等多種代謝過程。最近的研究發(fā)現(xiàn)， AMPK信號通路參與調(diào)節(jié)包括胰島β細(xì)胞、肝臟、骨骼肌和脂肪在內(nèi)的多種外周組織的糖脂代謝過程。因此，AMPK已經(jīng)成為以胰島素抵抗為主要病理生理基礎(chǔ)的糖尿病及肥胖癥等人類代謝性疾病及心血管疾病重要的治療新靶點(diǎn) [10]。在以AMPK為核心的調(diào)節(jié)糖代謝信號通路中，上游主要有細(xì)胞因子脂聯(lián)素和抵抗素等。下游有葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT） 4和糖原合成酶等^[10]。

HepG2 細(xì)胞是一種與人的正常肝細(xì)胞表型極為相似的肝胚胎瘤細(xì)胞株，胰島素水平越高，細(xì)胞表面胰島素受體的數(shù)目下降越多^[11]，因此，HepG2細(xì)胞可作為在細(xì)胞水平篩選改善胰島素敏感性的活性化合物的理想IR細(xì)胞模型。

APN是一種由脂肪細(xì)胞分泌的，具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，通過特異性AdipoR介導(dǎo)，激活A(yù)MPK，PPARα，p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖和脂肪代謝、增加胰島素敏感性、抗炎、抗動脈粥樣硬化作用^[12-14]。AdipoR分為脂聯(lián)素受體1（AdipoR1）和脂聯(lián)素受體2（AdipoR2），AdipoR1在許多組織中都有表達(dá)，尤其在骨骼肌中；而AdipoR2主要在肝臟中表達(dá)^[15-17]。本結(jié)果表明，PIP能通過上調(diào)IR 模型APN水平蛋白表達(dá)，增加APN和AdipoR的結(jié)合率，從而激活A(yù)MPK信號通路，發(fā)揮改善IR狀態(tài)的糖代謝紊亂作用的。這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致^[18-19]：脂聯(lián)素與其受體結(jié)合后，激活A(yù)MPK信號通路，進(jìn)而能促進(jìn)葡萄糖攝取。

LEP主要是由脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，主要通過與其受體（LepR）結(jié)合，控制食物攝入、維持能量平衡，并在免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖發(fā)育、糖脂代謝和胰島素敏感性等方面發(fā)揮著重要的生理調(diào)節(jié)功能^[20-21]。LEP對IR具有雙向調(diào)節(jié)作用，在一定濃度范圍內(nèi)抑制食欲，促進(jìn)糖脂代謝；而當(dāng)出現(xiàn)LEP抵抗時(shí)，LEP水平升高將降低胰島素的生物學(xué)效應(yīng)，誘發(fā)IR，進(jìn)而導(dǎo)致T2DM [22-23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：IR模型上清液中LEP含量、細(xì)胞中LEP mRNA和LepR蛋白表達(dá)較正常組均升高；PIP干預(yù)后，上清液中LEP含量、細(xì)胞中LEP mRNA和LepR蛋白的表達(dá)明顯下降，說明LEP與IR是正相關(guān)，與胰島素敏感性呈負(fù)相關(guān)^[24]。Compound C+PIP組也明顯降低了LEP mRNA表達(dá)和LepR的蛋白表達(dá)，只是效果弱于10 μmol·L^-1 PIP，提示PIP是可能通過AMPK信號通路調(diào)控LEP的表達(dá)，從而改善胰島素抵抗。要明確其作用機(jī)制，還需進(jìn)一步深入研究。

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[責(zé)任編輯 張寧寧]