多元組學背景下地黃連作障礙形成的分子機制研究進展

李明杰+馮法節(jié)+張寶+古力+王豐青+楊艷會+田云鶴+陳新建+張重義

[摘要]連作障礙的研究雖然已經有多年的歷史，但目前仍沒有有效的治療方法，其根本原因是其形成體系的復雜性。該文從連作植物根際土壤多元因子的互作關系入手，詳細闡述了栽培植物連作障礙形成的生理生態(tài)機制，提出了栽培藥用植物、自毒化感物質和根際微生物間復雜的多元互作是驅動連作障礙形成的根本原因，指出了植物功能基因組學和代謝組學以及微生物宏組學相結合的多元組學技術在深入理解特定生境多因子互作關系研究中的優(yōu)勢。同時，該文以地黃為例，從根際化感自毒物質累積效應、根際微生態(tài)的災變及連作植株的分子響應等多元角度綜述了地黃連作障礙形成的分子機制，并詳細總結了多元組學技術在這些機制研究中的運用和進展。該文為從分子水平上系統(tǒng)地揭示栽培藥用植物連作障礙形成的分子機制提供了新的思路。

[關鍵詞]地黃； 多元組學； 連作障礙； 分子機制； 栽培藥用植物

[Abstract]Although consecutive monoculture problems have been studied for many years， no effective treatments are currently available. The complexity of systems triggered the formation of consecutive monoculture problems was one major cause. This paper elaborated the physiological and ecological mechanisms of consecutive monoculture problem formation based on the interaction relationship among multiple factors presented in the rhizosphere soil of consecutive monoculture plants. At same time， in this paper the multiple interactions among cultivated medicinal plants， autotoxic allelochemicals and rhizosphere microbial were proposed to be most important causes that derived the formation of consecutive monoculture problem. The paper also highlighted the advantage of 'omics' technologies integrating plant functional genomics and metabolomics as well as microbial macro-omics in understanding the multiple factor interaction under a particular ecological environment. Additionally， taking R. glutinosa as an example， the paper reviewed the molecular mechanism for the formation of R. glutinosa consecutive monoculture problem from the perspective of the accumulation of allelopathic autotoxins， the rhizosphere microecology catastrophe and theresponding of consecutive monoculture plants. Simultaneously， the roles of mutilple 'omics' technologies in comprehending these formation mechanism were described in detail. This paper provides finally a new insight to solve systematically the mechanism of consecutive monoculture problem formation on molecular level.

[Key words]Rehmannia glutinosa； mutil-omics； consecutive monoculture problem； molecular mechanisms； cultivated medicinal plants

隨著現(xiàn)代中藥農業(yè)的發(fā)展，藥用植物大面積單一化連續(xù)種植，導致中藥材產量降低、品質變劣、生長狀況變差、病蟲害加重等連作障礙現(xiàn)象日趨嚴重^[1-2]。連作障礙現(xiàn)象在我國農業(yè)生產中普遍存在，在藥用植物上表現(xiàn)尤為突出。據(jù)統(tǒng)計，約占70%以上的根（根莖）類藥材人工種植時均存在不同程度的連作障礙，如人參、三七、地黃、黃連和當歸等^[3-5]。由于許多藥農對連作障礙缺乏科學的認識，盲目加大農藥和肥料的使用，以期防治病蟲害和提高產量，致使生產成本大幅增加、農藥殘留超標、藥材品質下降，嚴重制約了藥用資源的可持續(xù)利用和區(qū)域經濟的發(fā)展。同時，連作導致中藥農業(yè)生境破壞、生物多樣性下降、生態(tài)位變窄，過度使用的農藥、化肥又加劇了農田生態(tài)系統(tǒng)的惡化，中藥資源可持續(xù)發(fā)展受到空前嚴重的威脅和巨大的挑戰(zhàn)。因此，連作障礙問題的研究已成為制約中藥資源可持續(xù)利用和影響中醫(yī)藥行業(yè)健康發(fā)展的戰(zhàn)略性課題，也是當前中藥資源生態(tài)學迫切需要解決的重要內容，成為國內外同行研究的熱點。

1 栽培植物連作障礙形成的生理生態(tài)機制

1.1 連作障礙的形成與化感自毒作用 目前關于栽培藥用植物連作障礙的研究雖有大量的報道，但對其形成機制仍處于探索之中。越來越多的研究表明，栽培植物根際自毒物質的持續(xù)性積累及其所引發(fā)的根際災變可能是造成連作障礙的主導因素^[6-9]。植物在正常的生命活動過程中，會通過自身分泌、莖葉淋溶及殘體分解等方式向環(huán)境不斷釋放一些影響其他植物生長的次生代謝物質，這些次生代謝物質在土壤中持續(xù)累積，對植物本身也產生毒害作用，即化感自毒作用（allelopathic autotoxicity），這些分泌物則被稱為自毒化感物質（autotoxic allelochemicals）^[6]。植物中所發(fā)現(xiàn)的自毒化感物質主要來源于有機酸、醛類芳香酸、香豆素、醌類、生物堿和類萜等植物次生代謝產物，其中酚類和類萜類化合物是高等植物的主要化感物質。任何植物都不可能只產生一種或幾種化感物質，植物化感作用往往是眾多化感物質相互作用的結果。植物所生成化感物質不論種類多少，其化感作用強弱通常與其對應濃度呈正相關，表現(xiàn)出“低促、高抑”現(xiàn)象^[6，10]。比如：在地黃栽培實踐中，只有完整種植地黃一年的地塊才會對再植地黃產生強烈的傷害現(xiàn)象。此外，連作傷害的發(fā)生與植物所處的生長發(fā)育狀態(tài)也存在著較為密切的關系。比如連作地黃傷害的關鍵期往往發(fā)生在拉線期前期（幼苗后期）^[11]，生產中常會采用育苗移栽的方法跳過此敏感期，來減緩連作傷害。

1.2 化感自毒作用與根際生態(tài)災變機制 栽培植物根際土壤是一個有生命的、動態(tài)的多元世界，聚居著細菌、放線菌、真菌、藻、原生動物和病毒，它們對土壤肥力的形成、植物營養(yǎng)的轉化起著極其重要的作用。在藥用植物連作后，根際化感物質卻介導了土壤微生物的趨化過程，選擇性的吸引了病原微生物在根面、根際定殖和擴繁，營養(yǎng)分配不均導致根際微生物趨化失衡，降低了原本根際微生物多樣性，導致有益微生物減少，惡臭假單胞菌、河生腸桿菌、多形屈撓桿菌等有害微生物大量滋生，引起了根際微生物群體從“細菌型”向“真菌型”的不利轉變。由于大量真菌病原物侵染植物根部，導致其碳水化合物、氨基酸、蛋白質、脂類和核酸等物質代謝的改變，使根的分泌作用加強^[12-13]。根際化感物質除了可以誘導根際微生物的群體失衡外，有研究也認為萜類化感物質能夠抑制細胞ATP 形成和植物生長、干擾線粒體發(fā)揮正常功能、阻礙植物對礦物質的吸收、引發(fā)膜過氧化毀壞細胞膜結構^[6]。由于化感物質對細胞膜的具有較強損傷性作用，往往會導致細胞內含物不斷外泄，加速了土壤內化感物積累，反作用于根際微生物群落加重根際災難，造成惡性循環(huán)^[14]。由于遭受自毒化感物質傷害作用和根際土中大量微生物病菌不斷增值的“雙重攻擊”，連作植物最終不堪重負、逐漸衰弱。

生態(tài)系統(tǒng)的調控過程是相互促進（相生）或相互抑制（相克）的協(xié)調過程。連作障礙形成及加重發(fā)生的原因不是單一或孤立的，而是“栽培植物-土壤-微生物”系統(tǒng)內多種因素綜合作用的結果，其主要根源在自毒物質誘導下的根際微生態(tài)失衡^[5]。因此，連作障礙形成涉及到復雜的多元系統(tǒng)，包含大量未知化感物質、微生物群體和植物的復雜響應。雖然連作障礙的研究已經經歷多年的歷史，但對于連作障礙的形成機制仍然缺乏統(tǒng)一的定論，其根本的原因就在于系統(tǒng)的復雜性和缺乏相應的解讀工具。近年來，隨著宏基因組學和功能基因組學高通量測序技術的快速發(fā)展，高效、批量鑒定特定環(huán)境中微生物整體構成和監(jiān)視特定生理狀態(tài)下植物基因、蛋白和代謝物的變化已經成為現(xiàn)實。因此，有效的組合功能基因組學和宏組學能夠顯著彌補目前連作障礙研究中的不足，有效實現(xiàn)連作障礙復雜體系中多元因子的動態(tài)解析。

2 功能基因組學和微生物宏組學

2.1 植物功能基因組學 功能基因組學是指利用基因組學提供的信息作為基礎，進一步深入研究基因轉錄為信使RNA的方式、編輯并指導蛋白質合成的機制（轉錄組學，transcriptomics）、蛋白質表達及其活動規(guī)律（蛋白質組學，proteomics）、DNA序列不發(fā)生改變的表觀遺傳調控（表觀組學，epigenetics）以及它們如何影響那些控制細胞生物化學和代謝的化學物質（代謝組學，metabolomics）。功能基因組學更多的應用高通量、大規(guī)模的實驗方法，結合統(tǒng)計科學和計算機分析來探索基因、表觀修飾、蛋白質和代謝產物的規(guī)律，并最終闡釋基因組信息和表型性狀之間關聯(lián)性的學科^[15]。

轉錄組學是一門在整體水平上研究細胞中所有基因轉錄及轉錄調控規(guī)律的科學。它能提供基因組轉錄出來的全部RNA信息的總和，是研究細胞表型和功能的一個重要手段。隨著科學研究的不斷深入，多種新技術和方法已成功應用于轉錄組學的研究，比如：表達序列標簽（expressed sequence tag， EST）、cDNA-AFLP（amplified fragment length polymorphism）、抑制性消減雜交（suppression subtractive hybridization，SSH）、基因芯片（gene chip）、新一代轉錄組測序技術（RNA-sequencing，RNA-Seq）等。值得一提的是，RNA-Seq測序技術省去了傳統(tǒng)測序方法中從構建文庫到獲取序列信息的繁瑣過程，可以在較短的時間內獲取大量數(shù)據(jù)信息，其測序量達到傳統(tǒng)Sanger測序法的幾百到幾千倍，而測序的成本僅為傳統(tǒng)技術的幾十分之一。

蛋白組學則是以該細胞或組織內全部的蛋白或肽段作為研究對象，以更接近基因表達的實際生理功能的角度去闡述多個基因的作用方式。過去對蛋白的分析基本上集中在單一蛋白研究，在蛋白組學的概念提出以后，相關技術的快速進步使大規(guī)模、同時間分析多個肽段序列已經成為現(xiàn)實，突破了轉錄組學的研究限制，是對基因組學的廣泛延伸。目前蛋白組學中的常見鑒定和分析技術有：雙向電泳技術（two-dimensional electrophoresis，2D-PAGE）、熒光染色技術（two-dimensional fluorescence difference in gel electrophoresis，2D-DIGE）、iTRAQ技術（isobaric tags for relative and absolute quantitation）。iTRAQ技術與傳統(tǒng)蛋白鑒定和定量技術相比，已經實現(xiàn)了批量蛋白鑒定功能，最多可同時對8組樣品的蛋白進行標記，并進行絕對和相對定量分析，效率和精準度都得到了空前提高。

代謝組學旨在研究生物體或組織甚至單個細胞的全部小分子代謝物成分及其動態(tài)變化。它反映的是生物體在受到外界刺激或經遺傳修飾的細胞或組織所產生的代謝響應變化。最早提出的“代謝物組”（metabolome）是指某一生物或細胞所產生的所有代謝物，之后發(fā)展成為代謝組學。代謝組的分離和鑒定技術有：氣相色譜-質譜聯(lián)用（gas chromatography with mass spectrometer，GC-MS）、液相色譜-質譜聯(lián)用（liquid chromatography with mass spectrometer，LC-MS）及毛細管電泳-質譜聯(lián)用（capillary electrophoresis coupled mass spectrometer，CE-MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、傅里葉變換-紅外光譜（fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）、飛行時間質譜（time of flight，TOF）等。通過不同代謝組學技術之間的合理搭配和使用能夠精準地對植物體或環(huán)境中的代謝物進行分析。植物的藥用活性成分和化感自毒物質均來自于植物的代謝物，因此代謝組學對于連作植物化感物質的鑒定和解讀具有重要的意義。

攜帶遺傳信息的DNA轉錄為mRNA，再到翻譯成有功能的蛋白，進而決定生物的表型性狀，構成了遺傳學“中心法則”的經典內容。然而在生命活動過程中，生物的遺傳性狀并不是完全由DNA序列變化所決定。在不改變DNA序列的前提下，基因的表達卻發(fā)生了可遺傳的改變，造成可遺傳的表型變化，被稱為表觀遺傳。表觀遺傳學是通過 DNA 甲基化、組蛋白共價修飾、染色體重塑和非編碼 RNA 調控等方式使特定基因的表達發(fā)生改變，而不改變其本身的遺傳信息，并且這種改變能在有絲分裂和減數(shù)分裂過程中穩(wěn)定遺傳，從而調控特定的生物學過程。目前有大量的方法可用來研究植物的表觀遺傳學規(guī)律，比如DNA甲基化的研究方法有：甲基化敏感擴增多態(tài)性（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）法和以免疫學為基礎的甲基化DNA 免疫共沉淀（methylated DNA immuno precipitation，MeDIP or mDIP），而非編碼RNAs的表觀調控主要通過高通量測序和生物信息學等技術。

2.2 微生物宏功能組學 植物功能基因組學解釋的是植物某一個或一類性狀背后的遺傳決定機制，而宏基因組學則針對是一類生物，特別是環(huán)境中的微生物群落整體的功能特性。宏基因組學研究主要分成2個層面，一是對特定環(huán)境中全部微生物的總DNA進行深度測序，分析該生境中微生物的組成與相關功能；二是根據(jù)rDNA或目標基因上特定片段進行大規(guī)模測序，通過系統(tǒng)分析獲得該環(huán)境中微生物的遺傳多樣性和分子生態(tài)學信息。直接對土壤宏基因組測序的報道較少，主要是由于物種序列復雜程度較高造成拼接困難，目前主要通過高通量技術測定群體微生物16S rDNA 信息來判定群體中微生物多樣性。因此，宏基因組測序主要包括宏基因組文庫的構建和宏基因組文庫進行分析和篩選。除了高通量測序技術測定微生物文庫外，16S rRNA宏基因組文庫的分析還包括：變性梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis， DGGE）、限制片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、末端標記限制片段多態(tài)性（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）、單鏈構像多態(tài)性分析（single-strand conformation polymorphism，SSCP）技術等。盡管宏基因組學研究提供了很多有價值的數(shù)據(jù)，但如果不對特定條件的蛋白表達進行研究，人們就不能徹底對環(huán)境微生物生態(tài)進行分析。因此，宏蛋白組學和宏轉錄組學應運而生。根際宏組學更多是包含微生物在內的多個物種群體在某一特定環(huán)境、特定時期全部基因組轉錄情況。因此，宏基因組學和宏蛋白組學進一步拓展和延伸了宏基因組學的內涵，探索了微生物群落的基因表達與調控，為揭示微生物群落功能的直接表征奠定基礎^[16]。

3 多組學在地黃連作障礙形成機制中的運用

地黃Rehmannia glutinosa L.是玄參科多年生草本植物，以塊根入藥，是我國傳統(tǒng)的大宗道地藥材，現(xiàn)已廣泛栽培。然而，地黃連作障礙問題表現(xiàn)尤為突出，連作地黃生長不良，塊根不能正常膨大，病蟲害加劇，產量和品質明顯下降，甚至絕收，而且頭茬地黃收獲后須隔8～10年后方可再種。地黃連作障礙僅只傷害其自身，而對其他植物（禾本科、豆科等）卻影響不大，如地黃的茬口對下茬的作物如小麥、玉米、牛膝等。由此可見地黃連作障礙具有明顯的針對性，并不具備“普遍性”。正是由于地黃的連作障礙表現(xiàn)出嚴重性、特異性和持續(xù)性的典型特點，使其成為研究作物連作障礙形成機制的優(yōu)異實驗材料。目前，地黃連作障礙形成的機理輪廓已經基本清晰，如何讓這個輪廓更加精細，需要結合不同組學對連作障礙中的每個環(huán)節(jié)進行一一鑒定。在地黃連作障礙的形成機制研究中，本課題組中已經通過各種組學技術的有效結合對連作形成關鍵的環(huán)節(jié)進行了詳細的解讀。

3.1 地黃根際自毒化感物質鑒定與代謝組學 目前，課題組已經利用GC-MS，HPLC等代謝組學技術詳細探究了連作地黃土壤中化感物質的作用部分、種類及分泌和釋放的規(guī)律。比如：李振方等用水浸提和“石油醚-氯仿-乙酸乙酯-甲醇”聯(lián)合分步、分部位提取地黃根區(qū)潛在的化感物質，通過生物測試發(fā)現(xiàn)水、甲醇提取物有顯著的化感效應^[17]。陳楓等以

70%甲醇提取地黃茬后根際土壤，并用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分步萃取獲取不同極性的部位，種子發(fā)芽和田間盆栽試驗表明正丁醇和水部提取物具有明顯的化感效應，并且正丁醇部對盆栽地黃塊根的生長抑制作用顯著超過水部^[18]。為了更精確的鑒定連作地黃土壤中的化感自毒物質種類及分布，朱廣軍等采用GC-MS 對通過吸附樹脂所獲取的地黃根區(qū)土壤浸提液進行物質種類鑒定，發(fā)現(xiàn)在地黃根區(qū)土壤中存在有機酸、醇、酚、醛、酚酸等有機化合物，且地黃根區(qū)土壤種類遠多于對照土壤^[19]。郝群輝等采用GC-MS鑒定地黃根際土壤水提物，發(fā)現(xiàn)12種地黃根際特異化感物質，其中，有超過一半屬于酚類物質^[20]。李振方等用GS-MS方法從地黃的須根中鑒定得到32個代謝物，選擇9個復合物進行化感活性測定，發(fā)現(xiàn)其中7個酚酸物質有顯著化感活性^[21]。郜峰等以砂粒為基質培養(yǎng)地黃苗，用XAD-4柱的循環(huán)收集系統(tǒng)即時吸附根系分泌物，通過GC-MS鑒定收集液成分，結果在分泌物中獲取3，5 -二叔丁基-4-羥基苯甲酸和阿魏酸2種豐度較高的化感物質^[22]。

自毒化感物質存在于根際土壤中，那么根際土壤中的自毒物質輻射范圍到底有多大，如何界定等目前并沒有明確的定論。為了精確界定地黃土壤中自毒化感物質的分布范圍，課題組通過生物測試比較了地黃不同根區(qū)土壤浸提液對自身種子生長的影響。結果發(fā)現(xiàn)距離地黃塊根越近，地黃種子胚根生長受抑制的作用越大，當距離超過20 cm時地黃種子胚根的生長不被抑制。同時，通過GC-MS技術對不同根區(qū)甲醇和正戊烷土壤浸提液進行鑒定，發(fā)現(xiàn)地黃種植后距離塊根20 cm范圍內的土壤中新增了20種物質，且這些物質不存在于圈外及未種植過地黃的土壤中，其中，茉莉酮酸甲酯、1，2-亞甲二氧基-4，7二甲氧基-5-苯甲醛、7，10，13-十六碳三烯醛、9-十六碳烯酸和棕櫚油酸等已被報道具有較強的化感活性。因此，通過上述的研究可以初步的判定地黃根際化感物質分泌范圍大約為20 cm^[24]。連作地黃根際土壤中積累了大量的化感自毒物質會對地黃造成嚴重的傷害效應，但這種效應能夠維持多久，換句話說，含有一定含量自毒化感物質的土壤，需要多長時間的自然消減才能種植地黃。為確證酚酸類化感物質在土壤中的存在和變化狀態(tài)，杜家方等采用HPLC檢測2，4，6，8年前種植過地黃的土壤中與化感現(xiàn)象密切相關的5種酚酸（阿魏酸、對羥基苯甲酸、香草酸、香豆酸和丁香酸）的含量。結果發(fā)現(xiàn)土壤中5種酚酸的含量依次降低，說明隨著連作土間隔年限的延長，土壤中的化感物質可以消減到一個較低的濃度^[25]。

3.2 地黃根際微生物群落鑒定與宏基因組學 目前，課題組已經利用T-RFLP，DGGE及宏蛋白組學等方法對連作地黃根際微生態(tài)環(huán)境進行詳細的研究。張重義等利用T-RFLP技術研究了連作地黃根際土壤中細菌群落的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)連作地黃土壤中細菌優(yōu)勢種群的比例顯著下降，致病菌群的比例顯著上升^[26]。吳林坤等通過T-RFLP和PLFA（phospholipid-derived fatty acids）技術分析了野生地黃頭茬、連作和原茬土壤及未種植任何作物土壤根際微生物的群落結構，發(fā)現(xiàn)連作地黃土壤微生物總量顯著降低，細菌/真菌比例下降，大量病原菌迅速滋生^[27]。張寶等利用DGGE對地黃不同根際區(qū)間土壤的微生物群體進行分析，發(fā)現(xiàn)地黃連作會引起土壤根際、根外土壤細菌數(shù)量減少；進一步利用DGGE分析頭茬和連作地黃生長過程中根際微生物變化，發(fā)現(xiàn)隨著地黃發(fā)育進程推進，根區(qū)土壤細菌數(shù)量大幅降低，而木霉黃、曲霉等真菌數(shù)量顯著增加^[24]。土壤是一個極其復雜的“黑匣子”，若僅從土壤微生物、植株體自身等某一個側面進行探討，很難真正反映連作障礙的成因，但應用土壤蛋白質組學研究根際生物體間的互作，則直接可以從土壤系統(tǒng)功能的水平上，揭示土壤中各生物體間以及生物體與環(huán)境間的相互作用，從分子水平揭示地黃根際微生態(tài)系統(tǒng)中根系分泌物、土壤微生物、植物間的互作關系。為此，課題組通過2-DE和MALDI TOF-TOF MS質譜相結合的方法，在根際土壤鑒定了103個蛋白，其中33個在連作一年或兩年根際土壤出現(xiàn)顯著表達變化，這些蛋白來源植物或微生物，廣泛的參與蛋白、核酸的次級代謝、信號轉導、脅迫響應及根際土壤生態(tài)系統(tǒng)C，N的循環(huán)。此外，參與酚酸代謝的苯丙氨酸解氨酶在連作中上調表達，這與隨著連作年限增加土壤總酚酸含量增加的結果相一致^[28]。

通過上述分析可以發(fā)現(xiàn)連作地黃所分泌的自毒物質顯著誘導了土壤微生物群體改變，打破了土壤原有微生物群落平衡，導致大量病原真菌迅速增殖，破壞地黃的生理代謝進程，使植株生長受到嚴重抑制，甚至死亡，這也更加證實了地黃所分泌的化感自毒物質與連作根際微生物互作關系是加重連作障礙發(fā)生的重要原因。為進一步理解根際土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物和植物間的互作關系，本課題組基于宏蛋白質組學、宏基因組學的分析結果，將研究重點集中于鎖定的有益菌和病原菌，通過微生物可培養(yǎng)法與qRT-PCR技術對鎖定的特異關鍵微生物類群數(shù)量變化進行分析，同時借助構建的組培苗體系，通過室內模擬連作環(huán)境來進一步研究根系分泌物介導下微生物-微生物、植物-微生物之間的互作關系。結果發(fā)現(xiàn)模擬根際土壤中各酚酸配比的混合酚酸能夠顯著促進病原菌尖孢鐮刀菌的菌絲生長、孢子產生以及DON毒素的產生，尤其是香草酸和阿魏酸的促進效果最強，相反，該混合酚酸能夠顯著抑制有益拮抗菌假單胞菌W12的生長，其中香草酸和阿魏酸的抑制效果剛好最強，而它們也是地黃根際土壤中含量較高的2類酚酸?？梢姷攸S根系分泌物中的主要化感物質對土壤微生物類群具有選擇塑造作用，能夠選擇性促進或抑制某些特異微生物的生長^[29]。

3.3 植物功能基因組學與連作地黃分子響應機制 隨著土壤化感物質的逐漸增多和微生物群落失衡，連作地黃所處生長環(huán)境愈加惡化，面對惡化的環(huán)境，連作地黃的生長發(fā)育受到嚴重抑制。然而，面對連作土壤惡劣的環(huán)境時，植物是如何感知、響應進而呈現(xiàn)出傷害癥狀的呢？為了深入解讀連作對地黃的分子傷害機制，課題組利用SSH技術構建了頭茬與連作地黃消減cDNA文庫，鑒定了部分連作響應的特異表達基因；利用高通量測序技術構建了地黃轉錄組文庫及頭茬與連作地黃根部、葉片差異基因表達譜，初步篩選了響應連作地黃的差異表達基因。通過對上述不同文庫差異表達基因的分析，課題組提出連作障礙感知、響應和發(fā)生過程中的幾個關鍵性決定事件，即：鈣信號轉導，乙烯產生和組蛋白修飾^[30-32]。目前，課題組通過不同實驗方法已初步驗證了鈣信號和乙烯在連作中的重要性^[33-36]。就地黃本身而言，連作傷害可能來自2個層次：一是自毒物質的直接傷害；二是微生物失衡所致的間接傷害。因此，連作傷害發(fā)生過程中一些關鍵分子事件很可能是連作根際土壤中多元生物或非生物脅迫復合作用的結果。近年來，化感物質對植物傷害的分子機制在不同作物中也取得了一定進展，如Chi等通過RNA-Seq和基因芯片方法研究了自毒物質胡桃醌和阿魏酸脅迫下水稻的響應機制，發(fā)現(xiàn)2種自毒物質均能激活水稻體內鈣信號和乙烯信號途徑^[37-38]。此外，課題組也發(fā)現(xiàn)連作傷害進程與異生素（xenobiotics）對植物傷害機制模式基本類似^[39]，側面表明了生物應對不同生物脅迫或非生物脅迫可能存在著相似的響應機制。與轉錄組學相比，蛋白變化更能真實反映出植物面對脅迫時細胞內真實響應狀態(tài)，為了從蛋白層面上研究地黃在面對連作脅迫時的響應機制，課題組利用2-DE技術對頭茬和連作地黃葉片進行差異蛋白分析鑒定到290個顯著差異表達蛋白，其中，與光合作用、能量合成、細胞分裂及代謝相關的蛋白在連作地黃中顯著下調，而與抗病相關的蛋白在連作中顯著上調。表明連作地黃的光合作用受到顯著抑制，細胞分裂和細胞代謝受到顯著干擾，抗病性顯著減弱^[8]。同時，課題組進一步利用2-DE技術分析頭、重茬地黃塊根蛋白表達譜，發(fā)現(xiàn)與塊根重要生理代謝過程和主要成分合成相關的蛋白在連作地黃中下調；與脅迫響應、抵御相關的蛋白在連作均上調，表明連作脅迫可導致地黃蛋白表達紊亂，植株生理代謝過程異常，碳水化合物和能量代謝緩慢，產生連作障礙效應^[40]。

在植物面對逆境脅迫時，基因的表達與否受到組蛋白甲基化、乙?；却罅勘碛^修飾的調控。連作作為一種特殊的環(huán)境脅迫，必然會引起連作地黃體內復雜的表觀修飾變化。Yang等利用MSAP技術分析了連作地黃根細胞基因組的胞嘧啶甲基化狀態(tài)的變化，通過比較頭茬與連作地黃中的592個DNA甲基化多態(tài)性片段，發(fā)現(xiàn)連作引起了根細胞DNA甲基化位點增加，其中，甲基化修飾的基因主要有MYB轉錄因子、反轉座子、植物色素B等與基因表達和植物正常生長發(fā)育相關的基因，這些基因被甲基化后DNA的空間結構發(fā)生改變而無法正常轉錄，致使地黃體內正?；虻谋磉_程序出現(xiàn)紊亂^[41]?；蚰芊褶D錄為蛋白發(fā)揮正常功能，需要經歷轉錄后剪切、修飾等復雜調控過程，而 miRNAs在這個過程中起著重要作用。Yang等通過頭、重茬地黃sRNA差異表達譜分析獲取了大量顯著差異表達miRNAs信息，利用降解組測序對差異miRNAs靶基因進行鑒定發(fā)現(xiàn)地黃miRNAs參與了連作地黃轉錄調節(jié)、激素代謝、信號傳導、逆境響應等核心的生物學過程^[42-43]。從以上現(xiàn)有的轉錄組，蛋白組和miRNAs組等結果說明地黃在不同水平上均受到了連作脅迫的影響。其影響的最終結果造成地黃生長發(fā)育的錯亂，表現(xiàn)出連作障礙效應。

4 展望

地黃連作障礙形成機制研究帶來了許多新的啟示，連作障礙的形成絕非某一個或某幾類因素所決定的。連作障礙的形成涉及從栽培植物—土壤微生物—再到植物復雜互作和響應體系，而這種多元互作體系卻在土壤“暗箱”內上演。正是由于連作障礙形成因素的復雜性和隱蔽性給研究帶來重重困難。隨著多學科的相互交叉和大量研究工作投入，目前研究組基本上把住了地黃連作障礙形成的脈絡，即自毒化感物質及其所誘發(fā)的次生災變機制是連作障礙形成基本原因。然而，由于化感物質類種類繁多、根際微生態(tài)復雜性和植物響應多邊性，很難用常規(guī)的方法去解釋連作障礙形成機制。這種系統(tǒng)的復雜程度，很難用一個或若干個因素去闡明。就如同很難用質量性狀的遺傳分離規(guī)律去解釋數(shù)量性狀一樣，連作猶如一個遺傳復雜的數(shù)量性狀，所呈現(xiàn)出的癥狀是外界復雜的環(huán)境因子和內部眾多的響應基因綜合作用結果。過去用單一生理生化方法對連作現(xiàn)象的解釋很容易墜入“管中窺豹”的結果。所謂“解鈴還須系鈴人”，由于連作障礙是多系統(tǒng)之間的互作使然，應該整合多元組學并用系統(tǒng)的思維或方式去尋找連作復雜因素背后真實規(guī)律。近年來隨著多元組學和系統(tǒng)生物學算法的進步，為以后從多角度、多層次、整體性的去解讀連作障礙的形成機制提供了重要的工具。相信隨著不同組學通量和鑒定精度的不斷提高，發(fā)現(xiàn)和最終確證連作障礙形成分子機制也近在咫尺。

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[責任編輯 呂冬梅]