紫雀花清除自由基活性研究

舒越昊+張妮++鄒榮燦+吳玉巧+余正文

摘要：探究紫雀花（Parochetus communis）不同溶劑提取物及主要異黃酮的體外抗氧化活性。采用清除DPPH·法測定紫雀花石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水提物以及芒柄花苷、刺芒柄花素、維生素C的體外抗氧化活性。紫雀花的乙酸乙酯（IC50=0.016 2 mg/mL）和正丁醇提取物（IC50=0.045 9 mg/mL）顯示顯著的抗氧化活性，水提物其次，石油醚提取物最差；乙酸乙酯提取物的主要異黃酮刺芒柄花素和正丁醇提取物的主要異黃酮芒柄花苷的抗氧化活性微弱。紫雀花乙酸乙酯和正丁醇提取物具有顯著的抗氧化活性，而主要異黃酮刺芒柄花素和芒柄花苷不是兩個提取物清除DPPH·的有效活性成分。

關(guān)鍵詞：紫雀花（Parochetus communis）；抗氧化活性；DPPH·；異黃酮

中圖分類號：S58；Q505 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）24-6550-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.056

自由基（ROS）是細(xì)胞進(jìn)行有氧代謝時的產(chǎn)物。需氧生物利用O2進(jìn)行正常有氧代謝時會產(chǎn)生O22-，再由O22-衍生出H2O2等活性氧。最終H2O2在Fe2+等過渡金屬離子的介導(dǎo)下產(chǎn)生羥自由基（·OH）?；钚匝踉跈C(jī)體中的主要功能是對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，以及信號的傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)控制細(xì)胞的分裂、分化等[1]。同時又被人體內(nèi)的抗氧化酶如超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等以及其他非酶的內(nèi)源性抗氧化劑所清除。但人體正常細(xì)胞內(nèi)每天會形成大量的自由基；因而當(dāng)未被清除的自由基存在時仍可改變細(xì)胞的生物膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA等重要的生物大分子的性質(zhì)，顯示出“氧毒性”，從而引發(fā)人體細(xì)胞衰老、損害甚至癌變[2，3]。人體得到較好的營養(yǎng)補充時，機(jī)體對自由基的產(chǎn)生與清除能達(dá)到一種穩(wěn)定、正常的平衡狀態(tài)，使活性氧自由基能正常發(fā)揮作用。除人體自身的內(nèi)源性抗氧化劑對自由基的清除和損傷后修復(fù)的能力以外，外源性抗氧化劑也起著十分重要的作用。如維生素C（抗壞血酸）、BHA（丁基羥基茴香醚）、BHT（二丁基羥基甲苯）等是在食品加工上常用的抗氧化劑[4]。然而如BHA、BHT等人工合成抗氧化劑雖有一定的抗氧化能力，但因其功效低和有刺激性，并經(jīng)動物試驗證明，服用這類合成抗氧化劑后，對機(jī)體產(chǎn)生了毒性和致癌性。與之相比，維生素C等植物源天然抗氧化劑不僅具有有效性和廣譜性，而且對生物的毒性低甚至無毒。從藥食同源植物中發(fā)掘天然抗氧化劑已成為必然趨勢。

紫雀花（Parochetus communis）又名金雀花、藍(lán)雀花、生血草、一顆血，為蝶形花科紫雀花屬草本植物。生于2 000 m左右海拔的山地和荒坡的陰涼、濕潤處。紫雀花主要分布于貴州畢節(jié)、普安、興仁、遵義等地及四川、云南；國外如印度、不丹、緬甸、斯里蘭卡和泰國等也有少量分布。紫雀花為貴州苗族同胞常用草藥，性味甘，微溫，有補腎壯陽之效，用于治療外感發(fā)熱、腎虛陽痿、水腫和瘰疬[5，6]。紫雀花的食用價值和醫(yī)用價值得到了苗族同胞的肯定。本實驗室曾從紫雀花中分離鑒定得到刺芒柄花素、芒柄花苷、美迪紫檀素、車軸草醇、3′，6-二甲氧基-5′-羥基異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、阿佛洛莫生-7-O-β-D-葡萄糖苷、β-谷甾醇、1-三十烷醇、鄰苯二酸二辛酯、鄰苯二酸二丁酯、新植二烯，其中刺芒柄花素、芒柄花苷兩個異黃酮含量較高[7，8]。研究表明，異黃酮為蝶形花科植物的代表性成分，大多具有良好的抗氧化活性，如大豆異黃酮[9]、葛根異黃酮[10]、黃芪異黃酮[11]等。本試驗采用DPPH法對紫雀花的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水提物以及刺芒柄花素、芒柄花苷進(jìn)行抗氧化活性的研究。通過深入研究該藥食同源性植物的抗氧化活性，為苗藥紫雀花的資源開發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

紫雀花于2015年8月采自貴州省興仁縣，經(jīng)貴州師范大學(xué)張潮博士鑒定為蝶形花科植物紫雀花。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（Tokoy Chemical Industry/Japan公司）；刺芒柄花素標(biāo)準(zhǔn)品（西安玉泉生物科技有限公司）；芒柄花苷標(biāo)準(zhǔn)品（南京世洲生物科技有限公司）；抗壞血酸（中國藥品生物制品檢定所）；聚酰胺薄膜（20 cm×20 cm）（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）；乙醇、甲醇、氯仿、甲酸、三氯化鋁均為分析純。

CXP-100型多功能粉碎機(jī)（上海市晟喜制藥機(jī)械有限公司）；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海洪旋實驗儀器有限公司）；MS105DU型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-500DE型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UV759CRT型紫外分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）；XMTD-6000型電熱恒溫水浴鍋（上海宜昌儀器沙篩廠）；3650A型紫外分析儀（上?？扑嚬鈱W(xué)儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 提取方法 將紫雀花干樣品用粉碎機(jī)粉碎后，精準(zhǔn)稱取其粉末20.000 g，加入400 mL 75%乙醇浸泡60 min后，超聲波輔助提取3次，每次15 min，過濾后合并提取液。減壓回收溶劑，得到紫雀花浸膏（3.893 g）。將上述浸膏加入20倍量的去離子水制成懸浮液，依次等體積用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分別萃取3次，合并萃取液。減壓回收溶劑得石油醚提取物（0.155 g）、乙酸乙酯提取物（0.280 g）、正丁醇提取物（0.338 g）、水提取物（0.920 g）。

1.2.2 聚酰胺薄層層析 將紫雀花乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、刺芒柄花素、芒柄花苷用甲醇溶解得供試液。乙酸乙酯、正丁醇及刺芒柄花素供試液點樣于聚酰胺薄膜上，用甲醇∶水∶甲酸（16∶2∶0.3）展開；乙酸乙酯、正丁醇及刺芒柄花苷供試液點樣于聚酰胺薄膜上，用氯仿∶甲醇∶甲酸（8∶2∶0.1）展開。噴1%AlCl3乙醇溶液顯色，在254 nm波長的紫外光燈下檢視。

1.2.3 DPPH·清除活性測定[12] 對照組：在離心管中加入0.04 mg/mL DPPH 2 mL和無水甲醇2 mL充分混合，暗室反應(yīng)40 min。無水甲醇為空白對照，517 nm處紫外分光光度法快速測定吸光度（A0）。樣品對照組：在離心管中加入不同濃度的樣品溶液2 mL和無水甲醇2 mL充分混合后，暗室反應(yīng)40 min后快速測定517 nm處的吸光度，記為（A1）。樣品組：在離心管中加DPPH無水甲醇溶液2 mL和不同濃度的樣品溶液2 mL充分混合，暗室反應(yīng)40 min后，快速于517 nm處測定吸光度（A2）。以刺芒柄花素?zé)o水甲醇溶液、芒柄花苷無水甲醇溶液和維生素C水溶液代替樣品溶液，其中維生素C作為陽性對照。每組平行測定吸光度3次，求3次的平均值，代入公式計算其清除率Y（%）。以樣品濃度和清除率Y進(jìn)行線性回歸，求半抑制濃度（IC50）和自由基清除能力（AE），AE=1/IC50。試驗數(shù)據(jù)采用Excel處理、進(jìn)行線性回歸。

Y=[1-（A2-A1）/A0]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層層析

乙酸乙酯提取物和刺芒柄花素在Rf值為0.55的位置顯示相同顏色的斑點，表明刺芒柄花素主要存在于乙酸乙酯提取物中；正丁醇提取物和芒柄花苷在Rf值為0.57的的位置顯示相同顏色的斑點，芒柄花苷主要存在于正丁醇提取物中[13]。

2.2 DPPH·的清除活性

從表1可以看出，紫雀花不同提取物清除自由基能力順序：乙酸乙酯>正丁醇>水>石油醚。石油醚提取物的濃度增加，清除率緩慢上升，顯示較低的清除效果。由圖1可知，紫雀花的不同提取物對清除DPPH·的能力有所不同。其乙酸乙酯提取物濃度為0.04 mg/mL時，清除率達(dá)到95.44%，大于0.100 mg/mL的濃度與維生素C清除率幾乎相等。正丁醇提取物0.200 mg/mL對DPPH·的清除效果與乙酸乙酯和維生素C的清除率相當(dāng)。刺芒柄花素和芒柄花苷的折線圖平緩，其中刺芒柄花素有微弱的清除能力。

3 結(jié)論

紫雀花的乙酸乙酯和正丁醇提取物對清除DPPH·體系有明顯的效果。雖然這兩個提取物分別含有刺芒柄花素和芒柄花苷，但它們不是乙酸乙酯和正丁醇提取物清除DPPH·的有效活性成分。紫雀花乙酸乙酯部位和正丁醇部位的抗氧化活性成分還有待進(jìn)一步研究。

紫雀花不同溶劑提取物清除DPPH·自由基活性隨著濃度的增加而升高，高濃度的乙酸乙酯和正丁醇提取物，其抗氧化活性與維生素C相當(dāng)，表明紫雀花具有較好的藥食兼用價值，值得深入研究開發(fā)。

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