大腸桿菌工程菌利用甘蔗糖蜜發(fā)酵產(chǎn)L—乳酸研究

趙錦芳++薛葳蕤++張曉敏++王永澤+王金華

摘要：大腸桿菌HBUT-L來源于HBUT-D，因此具有快速利用蔗糖的特性。對HBUT-L利用蔗糖及甘蔗糖蜜發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，該菌株在96 h的發(fā)酵過程中，可將100 g/L的蔗糖轉(zhuǎn)化生成60.0 g/L乳酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)到74.0%，雜酸產(chǎn)量少，具有工業(yè)化開發(fā)潛力。在玉米漿培養(yǎng)基中可以直接添加未經(jīng)處理的甘蔗糖蜜，發(fā)酵周期持續(xù)224 h，發(fā)酵液所得乳酸產(chǎn)量為87.0 g/L，發(fā)酵液殘?zhí)菫?8.6 g/L，但乳酸產(chǎn)率極低，僅為0.389 g/（L·h），后續(xù)將對甘蔗糖蜜預(yù)處理工藝進(jìn)行研究，進(jìn)一步提高乳酸發(fā)酵速度和產(chǎn)量。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌工程菌；甘蔗糖蜜；發(fā)酵；L-乳酸

中圖分類號：TQ92 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號：0439-8114（2016）24-6541-04

L-乳酸是一種重要的有機(jī)酸，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化工領(lǐng)域，L-乳酸最具前景的應(yīng)用在于聚乳酸（PLA），PLA是一種可降解的、具有良好使用性能的生物相容性高分子材料，用于制造可生物降解塑料，近些年一直成為關(guān)注和研究的熱點(diǎn)[1]。但是，由于乳酸生產(chǎn)成本偏高，使得聚乳酸制造成本居高不下，難以在價(jià)格上與傳統(tǒng)塑料競爭。因此，如何高效低成本地生產(chǎn)L-乳酸顯得尤為重要[2]。

微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸因其原料來源廣泛、產(chǎn)品光學(xué)純度高、安全性高等優(yōu)點(diǎn)已成為生產(chǎn)乳酸的主要方法。目前發(fā)酵工業(yè)上生產(chǎn)乳酸的原料主要是淀粉質(zhì)原料，常用的有大米、小麥、玉米、馬鈴薯、紅薯、木薯等，這也是造成乳酸生產(chǎn)成本較高的原因之一。由于乳酸及其衍生物應(yīng)用研究的不斷深入，利用農(nóng)業(yè)廢棄物、制漿造紙污泥、紡織廢料和食品工業(yè)含糖廢料和下腳料等作為廉價(jià)碳源進(jìn)行乳酸發(fā)酵，已經(jīng)成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，一方面可以解決廢棄物的資源化問題，同時(shí)還能夠降低乳酸的生產(chǎn)成本[3，4]。

甘蔗糖蜜是糖廠生產(chǎn)過程中的主要副產(chǎn)品，其干固物中含有約40%的蔗糖和15%的還原糖，可作為微生物發(fā)酵的碳源，甘蔗糖蜜可用于發(fā)酵生產(chǎn)多種產(chǎn)品，如乙醇、味精、檸檬酸、賴氨酸、焦糖色素等。目前國內(nèi)尚未有利用甘蔗糖蜜發(fā)酵制L-乳酸的工業(yè)化生產(chǎn)，甘蔗糖蜜用于乳酸發(fā)酵相關(guān)報(bào)道還僅限于實(shí)驗(yàn)室研究階段。黃靖華等[5]經(jīng)過誘變篩選得到一株鼠李糖乳桿菌SCT-10-10-60，可利用甘蔗糖蜜為原料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，發(fā)酵40 h后，L-乳酸的產(chǎn)量最高可以達(dá)到106 g/L。汪群慧等[6]分離純化并獲得一株乳酸桿菌FM37，采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對其進(jìn)行糖蜜發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的研究，并得出初始糖濃度對乳酸產(chǎn)量的影響最顯著。廣西大學(xué)秦菊蔽等[7]通過誘變篩選獲得一株米根霉，并對其以蔗糖及甘蔗糖蜜為碳源生產(chǎn)L-乳酸的發(fā)酵條件進(jìn)行了研究。

近年來，國內(nèi)外開始研究使用大腸桿菌（Escherichia coli）基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。大腸桿菌具有遺傳背景清楚、易操作、易調(diào)控、培養(yǎng)基要求簡單和生長迅速等優(yōu)點(diǎn)，易于進(jìn)行工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。野生大腸桿菌在糖酵解過程中產(chǎn)生一系列有機(jī)酸（甲酸、乙酸、琥珀酸、乳酸）和乙醇等[8]，乳酸占總代謝產(chǎn)物不到50%。因此，需要通過代謝工程手段阻斷乳酸的競爭性支路，將代謝流引向乳酸的產(chǎn)生，構(gòu)建高產(chǎn)量、高光學(xué)純度大腸桿菌基因工程菌。本實(shí)驗(yàn)室在D-乳酸工程菌HBUT-D（來源于原始菌株E. coli W（ATCC 9637））[9]的基礎(chǔ)上，利用染色體插入技術(shù)，引入乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）的ldhL基因[10]，構(gòu)建可生產(chǎn)L-型乳酸的大腸桿菌工程菌株HBUT-L（ΔfrdBC，ΔadhE，Δpta，ΔpflB，ΔcscR，ΔaldA，ΔldhA∶∶ldhL）。該菌株能在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中高效利用葡萄糖進(jìn)行L-型乳酸發(fā)酵，并能利用蔗糖發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸，發(fā)酵60 h后，L-乳酸產(chǎn)量達(dá)到81.92 g/L，光學(xué)純度可達(dá)到99.9%，糖酸轉(zhuǎn)化率為82%[11，12]，具有極大的工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。

本研究主要利用甘蔗糖蜜為碳源，研究大腸桿菌工程菌生產(chǎn)L-乳酸的發(fā)酵特性，以此為低成本L-乳酸工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考，同時(shí)也為開發(fā)糖廠廢蜜高附加值產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 Escherichia coli HBUT-L（ΔfrdBC，ΔadhE，Δpta，ΔpflB，ΔcscR，ΔaldA，ΔldhA∶∶ldhL）由本試驗(yàn)構(gòu)建和保藏，該菌株是以可利用蔗糖發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的工程菌HBUT-D為出發(fā)菌株，利用同源重組技術(shù)敲除其D-乳酸脫氫酶基因，同時(shí)插入乳酸片球菌的L-乳酸脫氫酶基因（1dhL），并帶有自身啟動(dòng)子序列，該工程菌具有良好的L-乳酸發(fā)酵特性。

1.1.2 原料和培養(yǎng)基 甘蔗糖蜜購自廣西柳州蔗糖廠，總糖含量為48%，其中蔗糖為主，占51.7%，其次為果糖，含量為30.6%，葡萄糖最低，為17.7%，保存于4 ℃冰箱備用，使用時(shí)按重量比1∶3加去離子水稀釋后，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，在121 ℃條件下滅菌15 min。玉米漿由山東濰坊盛泰藥業(yè)有限公司提供，使用時(shí)無需預(yù)處理，115 ℃滅菌30 min后直接使用。

種子培養(yǎng)基：NBS培養(yǎng)基[13]，添加2%蔗糖。

無機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基：NBS培養(yǎng)基，添加10%蔗糖，再加入1 mmol/L甜菜堿。

玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿直接添加甘蔗糖蜜，使培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量在20 g/L左右，總糖含量達(dá)到10%。添加2 mmol/L甜菜堿。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 BIOSTAT？誖Bplus發(fā)酵罐（德國賽多利斯公司），722型可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），Agilent 1200 series反相高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司），恒溫?fù)u床（上海智誠分析儀器制造有限公司），恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海智誠分析儀器制造有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng) 將HBUT-L接種于NBS蔗糖固體平板，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，接入種子培養(yǎng)基中（1 000 mL三角瓶，裝液量500 mL），200 r/min，37 ℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)至菌體濃度（OD600）達(dá)到1.2～1.5。

1.2.2 發(fā)酵方式 NBS培養(yǎng)基發(fā)酵：按5%的接種量接入帶有自動(dòng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的7 L發(fā)酵罐中，裝有體積為4 L NBS培養(yǎng)基。發(fā)酵罐條件為初始糖含量10%，轉(zhuǎn)速200 r/min，37 ℃，以6 mol/L KOH作為中和劑，采用流加方式控制pH穩(wěn)定在7.0左右。定時(shí)取樣，檢測OD值、糖濃度、L-乳酸產(chǎn)量及其他雜酸濃度。

玉米漿培養(yǎng)基發(fā)酵：接種量為10%，其他操作同上。

1.2.3 發(fā)酵產(chǎn)物分析 OD值采用紫外分光光度計(jì)測量，波長選定600 nm；所取發(fā)酵液樣品在10 000 r/min條件下離心10 min，去除細(xì)胞殘留，收集上清液用于測定殘?zhí)羌捌渌x產(chǎn)物的含量。殘?zhí)呛亢陀袡C(jī)酸檢測采用高效液相色譜法（HPLC）檢測。Agilent 1200 series反相高效液相色譜儀檢測條件為[14]色譜柱：Bio-Rad HPX 87H；流動(dòng)相：4 mmol/L H2SO4；檢測器：示差檢測器；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量： 20 μL；流速：0.5 mL/min。乳酸光學(xué)純度采用HPLC測定檢測條件為：色譜柱：NUCLEOSIL 120-5 Chiral-L；流動(dòng)相：0.2 mmol/L H2SO4；紫外檢測器240 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.5 mL/min。

1.2.4 計(jì)算方法 乳酸和蔗糖濃度以發(fā)酵初始體積（4 L）計(jì)算，其濃度由測量值乘以發(fā)酵體積（初始體積與加堿體積之和，取樣體積忽略不計(jì)）再除以發(fā)酵初始體積計(jì)算得到。

2 結(jié)果與分析

2.1 HBUT-L在NBS培養(yǎng)基的發(fā)酵特性

大腸桿菌工程菌HBUT-L厭氧條件下，在含有10%蔗糖的4 L無機(jī)鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵過程中定期取樣，檢測細(xì)胞生物量、殘?zhí)呛腿樗岙a(chǎn)量，結(jié)果如圖1所示。工程菌HBUT-L來源于HBUT-D，因此具有快速利用蔗糖的特性，發(fā)酵到48 h時(shí)OD600達(dá)到4.16，之后進(jìn)入穩(wěn)定期。96 h發(fā)酵結(jié)束。經(jīng)檢測，發(fā)酵液中乳酸產(chǎn)量為60.0 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到74.0%，乳酸產(chǎn)率最大值達(dá)到0.98 g/（L·h）。

發(fā)酵液中主要代謝產(chǎn)物為乳酸，僅有少量乙酸和甲酸產(chǎn)生，其產(chǎn)量分別為0.39、0.06 g/L，發(fā)酵液中未檢測到琥珀酸及乙醇產(chǎn)生，結(jié)果如圖2所示。發(fā)酵液中雜酸產(chǎn)量少，乳酸濃度占總酸產(chǎn)量的99.3%，有利于后續(xù)的分離純化。

對HBUT-L發(fā)酵產(chǎn)生的L-乳酸進(jìn)行光學(xué)純度分析（圖3），經(jīng)檢測光學(xué)純度達(dá)到99.3%以上。該結(jié)果說明通過乳酸脫氫酶基因的替換（ldhL→ldhA），可發(fā)酵產(chǎn)生高光學(xué)純度L-乳酸。

2.2 HBUT-L在玉米漿培養(yǎng)基中的發(fā)酵特性

大腸桿菌工程菌HBUT-L可利用玉米漿和蔗糖糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，其發(fā)酵結(jié)果如圖4所示，整個(gè)發(fā)酵周期持續(xù)至224 h，經(jīng)檢測，發(fā)酵液中乳酸產(chǎn)量為87.0 g/L。本研究中所用甘蔗糖蜜中蔗糖占主要成分，還含有果糖和葡萄糖，其液相色譜圖見圖5。發(fā)酵結(jié)束后，總殘?zhí)菫?8.6 g/L，其中果糖濃度最高，為23.2 g/L，其次為蔗糖和葡萄糖，由此可見，HBUT-L可有效利用蔗糖和葡萄糖，同時(shí)也能部分利用果糖。HBUT-L來源于HBUT-D菌株，為了促進(jìn)蔗糖代謝操縱子基因cscA、cscB、cscK的表達(dá)，其蔗糖啟動(dòng)子抑制基因cscR已經(jīng)被敲除掉，因此，蔗糖可以被有效的轉(zhuǎn)運(yùn)并進(jìn)一步水解生成果糖，但是果糖地累積說明HBUT-L對果糖的代謝和利用是不完全的，推測原因可能是由于果糖激酶活力不高。Sabri等[15]也報(bào)道指出，蔗糖的充分利用需要3種酶的協(xié)同作用，蔗糖透過酶CscB、蔗糖水解酶CscA和果糖激酶CscK，因此，后續(xù)可以對HBUT-L進(jìn)一步進(jìn)行分子改良和遺傳馴化，提高其蔗糖和果糖的利用效率。

本研究所得甘蔗糖蜜乳酸發(fā)酵產(chǎn)率很低，僅有0.389 g/（L·h），推測甘蔗糖蜜中的某些物質(zhì)可能阻礙了微生物生長和發(fā)酵，使發(fā)酵周期延長。有文獻(xiàn)也報(bào)道指出，甘蔗糖蜜含有膠體物質(zhì)、灰分和其他懸浮物質(zhì)，這些雜質(zhì)可能會(huì)妨礙微生物的生長和發(fā)酵。因此，糖蜜在使用前，一般要根據(jù)發(fā)酵菌株的要求進(jìn)行合適的前處理，發(fā)酵過程中可能還需添加一些其他營養(yǎng)成分[16]。本試驗(yàn)所用糖蜜只經(jīng)過稀釋和高壓滅菌，沒有進(jìn)行過預(yù)處理?？蛇M(jìn)一步研究甘蔗糖蜜的預(yù)處理，以除去其中的抑制發(fā)酵的物質(zhì)，縮短發(fā)酵周期。

3 小結(jié)與討論

研究利用來源豐富、廉價(jià)的發(fā)酵底物甘蔗糖蜜也成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。中國是世界上第三大產(chǎn)糖國，甘蔗制糖是制糖行業(yè)的主體，但是在甘蔗制糖過程中會(huì)產(chǎn)生大量的廢糖蜜和蔗渣，目前大部分制糖企業(yè)利用廢糖蜜生產(chǎn)乙醇，但所得的乙醇廢液中COD高達(dá)104～105 mg/L以上。因此，如何合理有效地將制糖工業(yè)加工副產(chǎn)物進(jìn)行資源化利用，已經(jīng)成為一項(xiàng)重要的研究課題，一方面能變廢為寶，創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)價(jià)值，同時(shí)又能解決環(huán)境污染問題。

本研究中所采用的工程菌HBUT-L，同其出發(fā)工程菌HBUT-D一樣，也來源于野生型菌株E. coli W（ATCC 9637，Scr+），該野生菌作為為數(shù)不多的Scr+型菌，具有可直接利用蔗糖的能力[17]。同時(shí)，該工程菌保留了ppc基因（磷酸烯醇丙酮酸羧化酶），仍具有合成氨基酸的能力，因此發(fā)酵過程中可直接利用無機(jī)鹽培養(yǎng)基，降低了對營養(yǎng)成分的需求，可進(jìn)一步減少生產(chǎn)成本。蔗糖發(fā)酵結(jié)果顯示HBUT-L的乳酸產(chǎn)量為60.0 g/L，光學(xué)純度可達(dá)到99%以上，雜酸產(chǎn)量少，具有很大的工業(yè)化應(yīng)用潛力。

玉米漿含有可溶性蛋白質(zhì)、生物素、無機(jī)鹽等，營養(yǎng)豐富，常常被用作細(xì)菌發(fā)酵的有機(jī)氮源，以取代昂貴的酵母粉、牛肉膏。但是，利用玉米漿發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸仍存在產(chǎn)量低的問題，很難達(dá)到工業(yè)化的要求，并且常常需要向玉米漿中添加其他物質(zhì)或需對其進(jìn)行特殊處理。本研究在前期已經(jīng)通過試驗(yàn)證實(shí)，HBUT-L在玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基中能生長，并且可高效快速地將葡萄糖轉(zhuǎn)化成L-乳酸，經(jīng)過50 h厭氧發(fā)酵，乳酸產(chǎn)量可達(dá)到108.3 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率在97%以上，產(chǎn)率為2.16 g/（L·h）[18]。

目前，國內(nèi)一般不宜直接利用甘蔗糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，本研究所采用的工程菌HBUT-L在玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基中可以發(fā)酵甘蔗糖蜜產(chǎn)L-乳酸，甘蔗糖蜜在沒有經(jīng)過預(yù)處理?xiàng)l件下，發(fā)酵周期需要224 h，乳酸產(chǎn)量為87.0 g/L，發(fā)酵液殘?zhí)菫?8.6 g/L，乳酸產(chǎn)率僅為0.389 g/（L·h），后續(xù)將進(jìn)一步對甘蔗糖蜜預(yù)處理工藝進(jìn)行研究，提高乳酸發(fā)酵速度和產(chǎn)量，為制糖工業(yè)加工副產(chǎn)物的資源化利用和L-乳酸工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

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