不同培養(yǎng)條件對分蘗洋蔥莖尖脫毒效果的影響

王健鸝 張 悅 王秀峰 聶楚楚 馬藝蕎 王學(xué)國

（吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究院， 長春 130033）

分蘗洋蔥作為吉林省非常重要的優(yōu)勢蔬菜品種之一，對農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展起到了積極的促進(jìn)作用[1]。分蘗洋蔥極少抽薹開花，有性繁殖困難，主要以鱗莖作為繁殖器官[2]。長期無性繁殖導(dǎo)致一種或幾種病毒復(fù)合侵染，致使植株矮小，生長勢弱，產(chǎn)量和品質(zhì)大幅降低，品種退化嚴(yán)重，極大地制約了分蘗洋蔥產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。采用莖尖脫毒的方法能夠有效的去除分蘗洋蔥所攜帶的病毒，但是由于莖尖剝離體積較小，成活率較低，操作較為煩瑣，限制了分蘗洋蔥脫毒種苗的繁育與推廣。因此，急需一種行之有效的方法為分蘗洋蔥脫毒[3]及良種繁育工作鋪平道路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料來源吉林省農(nóng)安縣（NA）、公主嶺市（HD）及延邊州（HC）地方分蘗洋蔥品種，部分經(jīng)檢測含有洋蔥黃矮病毒。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 分蘗洋蔥莖尖脫毒培養(yǎng)體系的建立

（1）無菌外植體的制備 分蘗洋蔥種球于4℃低溫處理7～10 d，打破休眠后將分蘗洋蔥種球外層鱗莖逐層剝下，外植體剝至2 cm大小左右，流水沖洗2 h，將小鱗莖用75%乙醇消毒1 min，放入1%次氯酸鈉溶液殺菌消毒10～15 min，再用大量無菌水沖洗3～5次后備用。

（2）莖尖啟動(dòng)培養(yǎng)基的篩選 在無菌條件下，利用體式顯微鏡剝離莖尖分生組織，尺寸大致為0.3 mm左右。將剝離的莖尖分別置于3種不同莖尖分生組織啟動(dòng)培養(yǎng)基中（表1），于20℃、2000 lux、16 h/d光照時(shí)長的條件下培養(yǎng)，比較成活率、分化芽數(shù)、植株?duì)顟B(tài)等指標(biāo)因素。每個(gè)處理接種個(gè)數(shù)30個(gè)，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

表1 分蘗洋蔥莖尖啟動(dòng)培養(yǎng)基配方

（3）生根培養(yǎng)基的篩選 35 d后，將莖尖外植體啟動(dòng)培養(yǎng)基生長的幼芽接種到不同的生根培養(yǎng)基中（表2），21 d后統(tǒng)計(jì)觀察比較不同生根培養(yǎng)基的生根效率及根部生長情況。每個(gè)處理接種30個(gè)成活莖尖，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

表2 分蘗洋蔥生根培養(yǎng)基配方

1.2.2 分蘗洋蔥莖尖大小與熱處理對脫毒效果的影響

（1）分蘗洋蔥種球熱處理 將感染洋蔥黃矮病毒的分蘗洋蔥蔥頭剝除鱗莖外皮，切除頂部2/3后放入干燥箱中，分別用60℃、70℃、80℃和90℃四個(gè)溫度進(jìn)行處理，熱處理時(shí)間為10 min。

（2）無菌外植體的制備 外植體剝至1 cm大小左右，流水沖洗4 h，將小鱗莖用75%乙醇消毒30 s，置入1%次氯酸鈉溶液殺菌消毒10～15 min，再用大量無菌水沖洗3～5次后備用。

（3）不同莖尖處理的莖尖培養(yǎng) 于超凈臺(tái)中剝離分蘗洋蔥莖尖，莖尖大小分為2個(gè)級別：小于0.5 mm和0.5～1.0 mm（表3）。利用之前篩選出的分蘗洋蔥莖尖培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，比較莖尖的成活率，每個(gè)處理剝離30個(gè)莖尖，3次重復(fù)。

表3 分蘗洋蔥鱗莖熱處理及脫毒莖尖大小

2 結(jié)果與分析

2.1 分蘗洋蔥莖尖脫毒培養(yǎng)體系的建立

2.1.1 不同品種莖尖啟動(dòng)培養(yǎng)基的篩選 將剝離的品種NA、HD、HC的莖尖置于3種不同莖尖分生組織啟動(dòng)培養(yǎng)基中（圖1），35 d后統(tǒng)計(jì)成活率、分化芽數(shù)、植株?duì)顟B(tài)等（表4）。試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)基的成分對莖尖的生長起決定作用，相同培養(yǎng)基對不同品種之間的影響無明顯差異。

本試驗(yàn)的3個(gè)地方品種在MS + NAA 0.1mg/L + zip 0.4 mg/L中的成活率在80%左右；在MS +IAA 0.1 mg/L + 6-BA 0.4 mg/L中成活率在60%左右；在MS + NAA 0.025 mg/L + 6-BA 0.1 mg/L +GA3 0.05 mg/L的成活率均最低，在40%左右。在分化芽數(shù)上，莖尖在MS + NAA 0.1mg/L + zip 0.4 mg/L的培養(yǎng)基中的平均分化芽數(shù)均較其他2個(gè)培養(yǎng)基中的高。在植株?duì)顟B(tài)上，從測定的株高和莖粗可見，MS + NAA 0.1 mg/L + zip 0.4 mg/L培養(yǎng)基中的植株，在株高和莖粗方面均最高，株高可達(dá)3 cm以上，莖粗達(dá)1 cm以上。無論從成活率、分化芽數(shù)還是植株?duì)顟B(tài)上，都可以看出MS + NAA 0.1 mg/L + zip 0.4 mg/L培養(yǎng)基均優(yōu)于其他2個(gè)培養(yǎng)基，因此確定該培養(yǎng)基為最適莖尖啟動(dòng)培養(yǎng)基。

2.1.2 不同品種生根培養(yǎng)基的篩選 將成活的莖尖幼芽接種到不同的生根培養(yǎng)基中，3周后統(tǒng)計(jì)觀察比較不同生根培養(yǎng)基的生根效率及根部生長情況（圖2）。

圖1 不同啟動(dòng)培養(yǎng)基對分蘗洋蔥莖尖培養(yǎng)情況

表4 不同品種在不同啟動(dòng)培養(yǎng)基上的莖尖成活及莖尖生長情況

圖2 分蘗洋蔥莖尖脫毒苗在不同生根培養(yǎng)基上的生長情況

試驗(yàn)結(jié)果表明（表5），1/2 MS + NAA 0.1 mg/L的生根培養(yǎng)基生根率最高，均達(dá)100%，且根的形態(tài)均為根數(shù)極多且長，根毛多，植株生長勢強(qiáng)，整齊強(qiáng)壯，植株濃綠；3個(gè)品種對不同生根培養(yǎng)基的響應(yīng)無差異，3個(gè)品種在1/2 MS + NAA 0.1 mg/L生根培養(yǎng)基中均表現(xiàn)生根率高、根的形態(tài)好、植株形態(tài)好等。由此可見，1/2 MS + NAA 0.1 mg/L為最適生根培養(yǎng)基。

通過對比吉林省農(nóng)安縣(NA)、公主嶺市(HD)及延邊州(HC)市售的優(yōu)質(zhì)商品種球莖尖在不同啟動(dòng)培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基的響應(yīng)情況（圖3），最終建立一套高效的分蘗洋蔥莖尖脫毒培養(yǎng)體系，即莖尖啟動(dòng)培養(yǎng)基為MS+NAA 0.1 mg/L + zip 0.4 mg/L，生根培養(yǎng)基為1/2 MS + NAA 0.1 mg/L。且不同品種這套莖尖脫毒培養(yǎng)體系中的響應(yīng)無差異，證明此莖尖脫毒培養(yǎng)體系的應(yīng)用性較強(qiáng)，范圍較廣。

表5 不同品種在不同生根培養(yǎng)基上的生根生長情況

2.2 分蘗洋蔥莖尖大小與熱處理對脫毒效果的影響

將鱗莖先進(jìn)行熱處理，然后在切取小于0.5 mm和0.5～1.0 mm兩種規(guī)格的莖尖，進(jìn)行培養(yǎng)。待成苗后，剪取葉片利用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測法 （DAS-ELISA）檢測脫毒效果。

試驗(yàn)結(jié)果表明（表6），在不同溫度處理下，莖尖小于0.5 mm的成活率明顯低于莖尖大于0.5 mm的成活率，說明莖尖大小與成活率正相關(guān)；莖尖在小于0.5 mm的脫毒率明顯高于莖尖大于0.5 mm的脫毒率，說明莖尖大小與脫毒率負(fù)相關(guān)。隨著處理溫度的升高，成活率呈下降趨勢；但隨著處理溫度的升高，脫毒率呈上升趨勢。在80℃熱處理10 min后，莖尖大小在0.5～1.0 mm時(shí)，脫毒率效果最佳可達(dá)96.7%。

圖3 不同時(shí)期分蘗洋蔥脫毒莖尖生長情況

2.3 不同品種對熱處理結(jié)合莖尖大小脫毒效果的比較

對農(nóng)安縣（NA）、公主嶺市（HD）及延邊州（HC）市售的優(yōu)質(zhì)商品種球進(jìn)行80℃處理10 min后，剝?nèi)?.5～1.0 mm的莖尖進(jìn)行誘導(dǎo)，比較成活率及脫毒率。

試驗(yàn)結(jié)果可見（表7），不同品種處理后成活率均在90%以上，脫毒率也均在93.3%以上。

表6 不同熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒效果比較

表7 不同品種對莖尖熱處理脫毒效果比較

2.4 莖尖脫毒種球?qū)Ξa(chǎn)量的影響

利用脫毒苗生產(chǎn)分蘗洋蔥種球，翌年種植后田間植株長勢較強(qiáng)，未發(fā)現(xiàn)病毒病發(fā)病情況，其生長期相對延長，種性恢復(fù)較好（圖4），每667 m2平均產(chǎn)量提高12.36%（表8）。

表8 不同分蘗洋蔥品種脫毒前后產(chǎn)量比較

3 討論

3.1 不同分蘗洋蔥品種對啟動(dòng)培養(yǎng)基的適應(yīng)性

通常情況下，同一作物的不同品種因其基因型不同對激素的敏感度不同，所以在組織培養(yǎng)過程中，對同一作物的不同品種通常會(huì)采用不同的激素配比?？紤]到吉林省內(nèi)分蘗洋蔥品種的多樣性，本試驗(yàn)在不同生產(chǎn)區(qū)域分別采集了3種不同的分蘗洋蔥地方品種，其目的在于考察不同分蘗洋蔥品種對不同培養(yǎng)基的適應(yīng)性。但試驗(yàn)結(jié)果證明，吉林省內(nèi)不同品種的分蘗洋蔥對不同培養(yǎng)基有相同的適應(yīng)性，導(dǎo)致這一結(jié)果的可能性應(yīng)該是樣本采集的區(qū)域跨度不夠大，都是在吉林省內(nèi)采集的樣本，其存在一定的親緣關(guān)系。

圖4 分蘗洋蔥莖尖脫毒培養(yǎng)對種性恢復(fù)的田間表現(xiàn)注：a.為未脫毒分蘗洋蔥；b.為脫毒分蘗洋蔥。

3.2 熱處理莖尖剝離大小結(jié)合方法的優(yōu)越性

一般情況下，利用莖尖脫毒培養(yǎng)可有效地將植物體內(nèi)的病毒脫離，但由于蔥屬植物的生長點(diǎn)被一層層的鱗莖鞘包裹加之莖尖多汁，致使蔥屬植物的莖尖脫毒面臨剝離困難、工作量大的缺點(diǎn)，這些都在一定程度上限制了蔥屬莖尖脫毒培養(yǎng)的應(yīng)用。本研究應(yīng)用熱處理結(jié)合控制莖尖大小的手段，將莖尖剝離大小由通用的0.1～0.3 mm提高到了0.5～1.0 mm，經(jīng)DAS-ELISA檢測脫毒率可達(dá)96.9%，極大地降低剝離莖尖的難度，提高工作效率，為分蘗洋蔥脫毒種苗的工廠化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

3.3 分蘗洋蔥脫毒種苗的市場前景

分蘗洋蔥脫毒種球通過田間種植，相比未脫毒處理，其產(chǎn)量提高12%以上，證明脫毒對種性具有較強(qiáng)的恢復(fù)作用。分蘗洋蔥脫毒新品種的推廣應(yīng)用，將顯著提高產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量，創(chuàng)造出較大經(jīng)濟(jì)效益，可促進(jìn)分蘗洋蔥優(yōu)勢蔬菜產(chǎn)業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展。

[1] 趙靖. 分蘗洋蔥產(chǎn)量形成機(jī)理及調(diào)控技術(shù)的研究[D].長春: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014

[2] 王巨媛. 洋蔥營養(yǎng)生長時(shí)期生育規(guī)律的研究[D]. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2001

[3] 徐啟江, 陳典,張?jiān)菩? 分蘗洋蔥莖尖培養(yǎng)脫毒苗技術(shù)研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2002(2): 101–106