純化分離甲殼低聚糖制備氨基葡萄糖、殼二糖?

武大引，李 露

(青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東 青島266042)

氨基葡萄糖和殼二糖具有很多獨(dú)特的生理活性，如抗菌抑菌性、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等，因而在醫(yī)藥和保健食品領(lǐng)域被大量應(yīng)用[1]，尤其是氨基葡萄糖在治療骨關(guān)節(jié)炎方面效果良好[2]。目前，甲殼低聚糖純化分離[3]方法主要有膜分離、薄層層析(TLC)[4]、離子交換層析、凝膠層析等[5-6]。膜分離可用于分離、純化、濃縮，用于純化時(shí)可以有效地除去溶液中的離子，但用于分離時(shí)很難得到單一組分的分離產(chǎn)物，只適用于分離一定分子量范圍的產(chǎn)物。薄層層析是分離甲殼低聚糖常用的方法，但糖的極性大，在薄層上點(diǎn)樣時(shí)承載的量太少，不適合大量制備。離子交換層析分為陰、陽(yáng)兩種離子交換柱層析，是根據(jù)不同組分吸附力不同從而達(dá)到分離的目的。凝膠層析是利用分子篩原理，使待分離物質(zhì)按照分子量從大到小的先后順序流出，克服了硅膠層析因殼甲殼低聚糖吸附力強(qiáng)不易洗脫的缺陷[7]。又因凝膠層析操作簡(jiǎn)便，洗脫液一般為純水，不需再生，因此成為近幾年來(lái)應(yīng)用較多的分離甲殼低聚糖的方法[8]，但是聚丙烯酰胺凝膠層析并不能有效地除去溶液中的離子。常用的凝膠填料主要有葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠和聚丙烯酞胺凝膠，其中聚丙烯酞胺凝膠(Bio-Gel)是甲殼低聚糖分離的主要技術(shù)之一。

考慮到納濾與聚丙烯酰胺凝膠柱層析的優(yōu)缺點(diǎn)，作者采用NF200-300卷式納濾膜純化與聚丙烯酰胺凝膠柱層析分離相結(jié)合的方法，不僅通過(guò)納濾純化有效地除去了甲殼低聚糖中的鹽離子，又利用聚丙烯酰胺凝膠層析成功地分離出了氨基葡萄糖和殼二糖，為后續(xù)制備高純度的氨基葡萄糖與殼二糖提供了更完整、更可靠的依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

氨基葡萄糖鹽酸鹽、殼二糖標(biāo)準(zhǔn)品:質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%，大連中科格萊克有限公司;殼聚糖:黏均相對(duì)分子質(zhì)量16萬(wàn)，脫乙酰度≥86%，山東奧康生物科技有限公司;雙氧水:質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%，天津博迪化工股份有限公司;無(wú)水乙醇:分析純，上海翔圣化工有限公司;聚丙烯酰胺凝膠:Bio-Gel P-2，美國(guó)Bio-Rad公司;大腸桿菌、金黃色葡萄球菌:BR，青島科技大學(xué)生物工程試驗(yàn)室;牛肉粉、蛋白胨:BR，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

冷凍干燥機(jī):FD-1E，鄭州長(zhǎng)城工貿(mào)有限公司;電導(dǎo)率儀:DDS-307，上海虹益儀表有限公司;實(shí)驗(yàn)用膜分離裝置;上海膜速科學(xué)器材有限公司;卷式納濾膜組件:NF200-300，0.4 m2，上海膜速科學(xué)器材有限公司;硅膠板:GF254TLC，100 mm×50 mm，青島海洋化工有限公司;玻璃層析柱:65 cm×0.8 cm，上海精科股份有限公司;高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀:Micro Tof Q II，布魯克(北京)科技有限公司(BRUKER);手提式電熱壓力蒸汽消毒器:YXQG02，山東新華安得醫(yī)療用品有限公司;超凈工作臺(tái):BAKER，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料液的制備

準(zhǔn)確稱取1 g殼聚糖加到20 m L醋酸溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%)中攪拌至完全溶解，升至75℃，使用恒壓滴液漏斗向三口燒瓶中緩慢滴加1.88 g H2O2(質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%)，滴加完畢后攪拌反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻、抽濾，然后向?yàn)V液中加入2 mol/L的NaOH溶液，調(diào)至中性，再加入5倍體積的無(wú)水乙醇沉淀，離心，把離心所得到的含有甲殼低聚糖的上層清液作為制備氨基葡萄糖和殼二糖的原料液。經(jīng)DNS法測(cè)定原料液中甲殼低聚糖的平均相對(duì)分子質(zhì)量為1 600。

1.2.2 納濾純化原料液

開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，原料液用0.45μm微孔膜過(guò)濾，除去其中的硬顆粒，以防造成納濾過(guò)程中膜的阻塞、損傷。

用去離子水清洗設(shè)備之后，向料液槽中加入制得的原料液，充分?jǐn)嚢枋蛊浠旌暇鶆?，采用全循環(huán)(透過(guò)液和濃縮液都回流到料液槽)的操作方式進(jìn)行納濾。分別考察溫度、壓力對(duì)純化效果的影響。待系統(tǒng)穩(wěn)定后，收集透過(guò)液，測(cè)定電導(dǎo)率，并記錄1 min內(nèi)透過(guò)液的體積。

在一定溫度和壓力下，采用透過(guò)液?jiǎn)为?dú)取出的操作方式進(jìn)行納濾，考察濃縮倍數(shù)對(duì)純化效果的影響。待系統(tǒng)穩(wěn)定后，收集透過(guò)液，測(cè)定電導(dǎo)率。

膜分離設(shè)備流程簡(jiǎn)圖見(jiàn)圖1。

圖1 膜分離設(shè)備流程圖

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠分離甲殼低聚糖

取預(yù)處理好的聚丙烯酰胺凝膠裝柱，用2～3倍柱體積的超純水平衡凝膠柱。經(jīng)納濾處理后的原料液在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，得到淡黃色粉末。取一定量淡黃色粉溶于超純水中，配制成一定濃度的溶液，然后上樣。使用脫氣后的超純水作為淋洗液在室溫下以0.29 m L/min的流速進(jìn)行洗脫，自動(dòng)收集器每隔一定時(shí)間收集一管分離組分，用于下一步的TLC及MALDI-TOF-MS分析。

1.3 分析及檢測(cè)方法

(1)膜通量。J＝V/St，其中，V為透過(guò)液體積，L;S為膜的有效過(guò)濾面積，m2;t為納濾時(shí)間，min。

(2)離子透過(guò)率。Y＝C1/C0×100%，其中，C0為原料液的電導(dǎo)率，μs/cm;C1為透過(guò)液的電導(dǎo)率，μs/cm。

(3)分離產(chǎn)物的TLC分析。展開(kāi)劑按照V(正丙醇)∶V(水)∶V(氨水)＝7∶3∶1配制，顯色劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的茚三酮溶液，用毛細(xì)管在硅膠板上點(diǎn)樣，在密閉展開(kāi)缸中展開(kāi)。待展開(kāi)完成后，120℃條件下顯色。

1.4 氨基葡萄糖與殼二糖抗菌抑菌性能測(cè)定

參照文獻(xiàn)[9-10]的實(shí)驗(yàn)方法，采用瓊脂擴(kuò)散紙片法測(cè)定氨基葡萄糖與殼二糖的抗菌抑菌性能。

2 結(jié)果與討論

2.1 納濾純化工藝條件考察

2.1.1 壓力對(duì)納濾純化的影響

在25℃，濃縮1倍的條件下，采用全循環(huán)的操作方式，考察壓力對(duì)納濾純化效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。

由圖2可知，J隨著壓力的增大而增大，但是當(dāng)壓力增加到0.4 MPa時(shí)，J的增幅減小?？赡苁且?yàn)闈獠顦O化作用使膜界面的溶質(zhì)濃度達(dá)到一個(gè)定值，滲透壓對(duì)跨膜壓差的削弱作用突顯出來(lái)[11-12]。

圖2 壓力對(duì)納濾膜通量的影響

圖3 壓力對(duì)離子透過(guò)率的影響

由圖3可以看出，隨著壓力的增加，Y逐漸降低，原因是隨著納濾的進(jìn)行，濃差極化加劇，增加了透過(guò)膜的阻力，使得Y降低。納濾要求較高的離子透過(guò)率，由圖3可知壓力越小越好，但是壓力過(guò)低時(shí)膜通量較小，納濾耗時(shí)太長(zhǎng)。綜合考慮，操作壓力選為0.4 MPa，此時(shí)，J＝15.3 L/(m2·h)，Y＝82.9%。

2.1.2 溫度對(duì)納濾純化的影響

在0.4 MPa，濃縮1倍的條件下，采用全循環(huán)的操作方式，考察溫度對(duì)納濾純化效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 溫度對(duì)納濾膜通量的影響

圖5 溫度對(duì)離子透過(guò)率的影響

由圖4可知，J隨著溫度的增大而增大，由圖5可以看出，隨著溫度的增加，Y逐漸升高?？赡茉蚴且环矫鏈囟壬咭鹪弦悍肿訜徇\(yùn)動(dòng)加劇，從而使原料液黏度下降，擴(kuò)散系數(shù)增大[13]，易于離子透過(guò)納濾膜;另一方面溫度升高使膜表面濃差極化減弱，降低了離子的傳質(zhì)阻力。由分析可知，溫度越高越有利于純化除鹽，但是考慮到膜組件的正常耐受溫度(5～45℃)，選定納濾溫度為40℃，此時(shí)，J＝28.7 L/(m2·h)，Y＝91.7%。

2.1.3 濃縮倍數(shù)對(duì)納濾純化的影響

在0.4 MPa、40℃條件下，采用透過(guò)液?jiǎn)为?dú)取出的操作方式，考察濃縮倍數(shù)對(duì)納濾的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 濃縮倍數(shù)對(duì)離子透過(guò)率的影響

由圖6可知，Y基本不隨濃縮倍數(shù)的增大而改變，說(shuō)明濃縮倍數(shù)對(duì)納濾影響很小?？紤]到后期原料液冷凍干燥時(shí)的時(shí)間問(wèn)題，選定濃縮倍數(shù)為2倍，此時(shí)，Y＝91.8%。

2.1.4 單糖與殼二糖納濾前后TLC分析

為了探究納濾前后氨基葡萄糖和殼二糖的損失情況，作者采用TLC方法對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行測(cè)定，納濾前后TLC結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 納濾前后TLC結(jié)果

由圖7可知，與納濾前對(duì)比，納濾后氨基葡萄糖的色譜斑點(diǎn)稍微有一些變淡，說(shuō)明僅有很少一部分的氨基葡萄糖損失。納濾后殼二糖的色譜斑點(diǎn)與納濾前對(duì)比基本沒(méi)有變化，說(shuō)明殼二糖并沒(méi)有損失[10]。

2.1.5 納濾純化工藝小結(jié)

采用NF200-300卷式納濾膜對(duì)甲殼低聚糖進(jìn)行純化除鹽，分別考察了溫度、壓力與濃縮倍數(shù)對(duì)納濾純化的影響。根據(jù)以上分析可知，在0.4 MPa、40℃、濃縮2倍的條件下，純化效果最好，甲殼低聚糖中離子透過(guò)率為91.8%。并通過(guò)TLC方法對(duì)納濾前后氨基葡萄糖與殼二糖的損失情況進(jìn)行分析，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，僅氨基葡萄糖有極少量的損失，殼二糖基本沒(méi)有損失。

2.2 聚丙烯酰胺凝膠層析工藝條件考察

2.2.1 接管時(shí)間對(duì)氨基葡萄糖、殼二糖分離結(jié)果的影響

在上樣質(zhì)量濃度為0.15 g/m L，洗脫速度0.29 m L/min，超純水室溫洗脫的條件下，考察了接管時(shí)間對(duì)氨基葡萄糖、殼二糖分離結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖8～圖10。

圖8 接管時(shí)間3 min

圖9 接管時(shí)間2 min

圖10 接管時(shí)間1 min

通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，由圖8可知，氨基葡萄糖、殼二糖均沒(méi)有分離出;由圖9可知，55～58管有氨基葡萄糖與殼二糖色譜點(diǎn)出現(xiàn)，但二者并沒(méi)有分開(kāi)，其它管均出現(xiàn)嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象;由圖10可知，沒(méi)有殼二糖色譜點(diǎn)出現(xiàn)，68～71管有氨基葡萄糖色譜點(diǎn)出現(xiàn)，且點(diǎn)清晰無(wú)拖尾。綜合以上分析，選定接管時(shí)間為1 min，但此時(shí)僅能分離出氨基葡萄糖。

2.2.2 上樣質(zhì)量濃度對(duì)氨基葡萄糖、殼二糖分離結(jié)果的影響

在接管時(shí)間1 min，洗脫速度0.29 m L/min，超純水室溫洗脫的條件下，考察了上樣質(zhì)量濃度對(duì)氨基葡萄糖、殼二糖分離結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖11～圖14。

圖11 上樣質(zhì)量濃度0.10 g/mL

圖12 上樣質(zhì)量濃度0.15 g/mL

圖13 上樣質(zhì)量濃度0.20 g/mL

經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，由圖11可知，49～56管有氨基葡萄糖色譜點(diǎn)出現(xiàn)，但是氨基葡萄糖色譜點(diǎn)下方出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，殼二糖也沒(méi)分離出;由圖12可知，68～71管為氨基葡萄糖，殼二糖未分出;由圖13可知，78～86管出現(xiàn)氨基葡萄糖色譜點(diǎn)，63～70管為殼二糖色譜點(diǎn)，且二者的色譜點(diǎn)均清晰無(wú)拖尾;由圖14可知，只有64～72管中的單糖色譜點(diǎn)清晰無(wú)拖尾，但殼二糖未分出。綜上可知，上樣質(zhì)量濃度為0.20 g/m L時(shí)，分離效果最好，此時(shí)，氨基葡萄糖與殼二糖均只出現(xiàn)一個(gè)顯色點(diǎn)，且點(diǎn)沒(méi)有拖尾，說(shuō)明二者純度都很高[14]。

圖14 上樣質(zhì)量濃度0.25 g/mL

2.2.3 聚丙烯酰胺凝膠層析工藝小結(jié)

采用聚丙烯酰胺凝膠柱層析的方法對(duì)純化后的甲殼低聚糖進(jìn)行分離，分別考察了接管時(shí)間與上樣質(zhì)量濃度對(duì)分離結(jié)果的影響。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在接管時(shí)間1 min、上樣質(zhì)量濃度0.2 g/m L的條件下，可得到高純度的自制氨基葡萄糖與殼二糖。

2.3 凝膠層析分離產(chǎn)物的MALDl-TOF-MS表征結(jié)果

凝膠層析分離所得氨基葡萄糖和殼二糖的MALDI-TOF-MS表征結(jié)果分別見(jiàn)圖15、圖16。

圖15 自制氨基葡萄糖的MALDl-TOF-MS譜圖

在圖15中，只有一個(gè)較強(qiáng)的質(zhì)荷比(m/z)為180的分子[Glc N＋H]＋離子峰，減去H＋的質(zhì)量1，自制氨基葡萄糖確與氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(Glc N)的分子量179相符。在圖16中，也僅有一個(gè)較強(qiáng)的m/z為341的分子[(Glc N)2＋H]＋離子峰，減去H＋的質(zhì)量1，自制殼二糖與殼二糖標(biāo)準(zhǔn)品((Glc N)2)的分子量340相符[15]。二圖中雜質(zhì)峰均較少，可知所得氨基葡萄糖、殼二糖純度均較高，說(shuō)明納濾純化與聚丙烯酰胺凝膠柱層析分離的結(jié)果還是令人比較滿意的。

圖16 自制殼二糖的MALDl-TOF-MS譜圖

2.4 氨基葡萄糖與殼二糖抗菌抑菌性測(cè)定

分離所得到的氨基葡萄糖和殼二糖對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌結(jié)果見(jiàn)圖17、圖18。

圖17 氨基葡萄糖、殼二糖對(duì)大腸桿菌的抑菌結(jié)果

圖18 氨基葡萄糖、殼二糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌結(jié)果

由圖17、圖18可知，氨基葡萄糖和殼二糖對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑比分別為4.0∶1、3.6∶1，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑比分別為3.8∶1、3.7∶1，二者抑菌效果明顯，但是目前對(duì)二者的抑菌機(jī)理還沒(méi)有統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，估計(jì)是二者通過(guò)滲透作用穿過(guò)多孔細(xì)胞壁[16]，進(jìn)入到細(xì)菌內(nèi)部，干擾DNA和RNA的復(fù)制，抑制細(xì)菌的繁殖;也可能是二者破壞細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)含物的膠體狀態(tài)，使其絮凝變性不能進(jìn)行正常的生理活動(dòng)，最終使菌體死亡。

3 結(jié) 論

在0.4 MPa、40℃、濃縮2倍的條件下，采用NF200-300卷式納濾膜對(duì)甲殼低聚糖進(jìn)行除鹽純化，離子除去率為91.8%。在接管時(shí)間為1 min、上樣質(zhì)量濃度為0.2 g/m L的條件下，采用聚丙烯酰胺凝膠柱層析的方法對(duì)純化后的甲殼低聚糖進(jìn)行分離，得到了高純度的氨基葡萄糖和殼二糖，用MS對(duì)得到的產(chǎn)物進(jìn)行了表征，證明所得產(chǎn)物確為氨基葡萄糖與殼二糖，且二者的抗菌抑菌性能良好。

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