兩種胡椒堿的酸性衍生物的合成?

秦 蓓，辛元晶，余麗麗，李 立，楊 欣，王 榮

(1.西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 藥物研究所，陜西 西安710021;2.西安交通大學(xué) 理學(xué)院，陜西 西安710049)

胡椒堿(Piperine)是胡椒科植物中提取的一種重要的活性生物堿，屬于桂皮酞胺類生物堿，具有抗胃潰瘍、抗氧化、降血脂、抗炎癥、抗腫瘤、抗抑郁和免疫調(diào)節(jié)等作用[1-5]。如1999年研究者們就在對(duì)中藥有效成分篩選中發(fā)現(xiàn)胡椒的主要生物堿——胡椒堿能夠有效地抑制黑色素細(xì)胞的增值[6]。20世紀(jì)70年代烏恩[7]通過對(duì)傳統(tǒng)藥材蓽茇的研究發(fā)現(xiàn)其出色的調(diào)節(jié)血脂的作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了可能的12種活性物質(zhì)，其中就包含GBO及其多種衍生物。周毅等[8]則發(fā)現(xiàn)胡椒堿對(duì)多藥耐藥乳腺癌細(xì)胞具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用。廖紅波等[9]的研究表明胡椒堿具有較好的抗抑郁作用。近年來(lái)學(xué)者們通過研究不斷證實(shí)胡椒堿及其衍生物具有多種生物活性[10-11]，包蘭蘭等[12]研究胡椒堿對(duì)大鼠血脂水平的影響，發(fā)現(xiàn)胡椒堿有抑制外源性血脂升高的作用。但是胡椒堿本身存在毒性較大的問題，極大地限制了其臨床上的應(yīng)用開發(fā)。有研究表明胡椒堿的某些衍生物即具有良好調(diào)血脂等效果且毒性較低[10，13-15]，據(jù)此作者擬將通過水解、酰胺化反應(yīng)，固相水解等過程在胡椒堿結(jié)構(gòu)中引入氨基酸結(jié)構(gòu)，獲得一些氨基酸修飾的胡椒堿類似物，為后續(xù)的藥理研究提供基礎(chǔ)原料。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

胡椒堿:質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，西安瑞盈生物科技有限公司;L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽:質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%、L-纈氨酸甲酯鹽酸鹽:質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司;甲磺酰氯(MeSO2Cl):質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%、中性氧化鋁(Al2O3):75～150μm，阿拉丁試劑，上海晶純生化科技股份有限公司;二氯甲烷(DCM)、三乙胺(TEA):分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司;石油醚(PE)、甲醇、無(wú)水乙醇、氟化鉀(KF):分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司;乙酸乙酯(EA):分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水硫酸鈉:分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;鹽酸:分析純，西隴化工股份有限公司;碳酸氫鈉:分析純，成都市科龍化工試劑廠;氫氧化鉀(KOH):分析純，天津歐博凱化工有限公司。

全自動(dòng)熔點(diǎn)儀:MP300，濟(jì)南海能儀器有限公司;三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀:Agilent LC1260-MS6460，安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

兩種胡椒堿的酸性衍生物的合成路線見圖1。

1.2.1 胡椒酸(1)的制備

胡椒堿(17.5 mmol，5 g)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%KOH甲醇(150 m L)，80℃回流72 h后水解完成后，減壓蒸餾除去甲醇，得到黃色油狀液。加100 m L蒸餾水溶解后，加6 mol/L HCl調(diào)節(jié)至p H＜1，有黃色固體物質(zhì)析出，抽濾得固體(見圖1)。50℃下，將黃色固體溶解于足夠少的甲醇中，自然冷卻至室溫后冰水浴使其結(jié)晶。抽濾得到黃色固體(2.973 g，產(chǎn)率為77.7%)。

1.2.2 酰胺(A)和酰胺(B)的合成

酰胺(A)(胡椒酸丙氨酸甲酯偶聯(lián)物)的合成(見圖1):胡椒酸(5 mmol，1.09 g)和新蒸的DCM(20 m L)混合后，在低溫?cái)嚢杵髦?－15℃)攪拌10 min，加入TEA(10 mmol，1 300μL)，隨后加入新蒸的甲磺酰氯(4.5 mmol，750μL)，－15℃攪拌1 h。將L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(5 mmol，0.70 g)溶于新蒸的DCM中，加入5 m L TEA攪拌30～40 min，將該溶液緩慢滴加至上述低溫反應(yīng)混合物中。在0℃下攪拌30 min后，在室溫下攪拌2～3 h。反應(yīng)過程中通過薄層色譜板監(jiān)測(cè)，展開體系:[V(CH2Cl2)∶V(EA)∶V(PE)＝20∶1∶1]，將30 m L DCM加入反應(yīng)混合物中，然后分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%HCl(3×30 m L)，飽和Na HCO3(3×30 m L)洗滌，用無(wú)水硫酸鈉干燥24 h，過濾，濃縮，得到固體粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物溶于盡可能少的EA中，緩慢滴加PE重結(jié)晶得到黃色固體(0.58 g，產(chǎn)率為38%)。

酰胺(B)(胡椒酸纈氨酸甲酯偶聯(lián)物)的合成(見圖1):具體過程同酰胺(A)的合成，將氨基酸鹽酸鹽換為L(zhǎng)-纈氨酸甲酯鹽酸鹽(5 mmol，0.84 g)。產(chǎn)物為淺黃色蠟狀固體(1.54 g，產(chǎn)率為92%)。

圖1 兩種胡椒堿的酸性衍生物

1.2.3 A酸和B酸的合成

質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%KF-Al2O3的制備:將15 g中性氧化鋁和10 g KF分散于200 m L水中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上50～60℃下除去水，放入真空烘箱中50℃干燥12 h，置于干燥器中備用。

A酸(胡椒酸丙氨酸偶聯(lián)物)的制備(見圖1):取酰胺A(0.5 mol，0.152 g)與0.5 g KF-Al2O3混合，在小表面皿中研磨分散。將分散均勻的粉末轉(zhuǎn)移至50 m L的茄型瓶中，在50℃加熱攪拌2 h。冷卻后將5 m L水加至固相體系中，攪拌5 min。過濾，將濾液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% 鹽酸酸化，過濾，干燥后得黃色固體粉末(0.13 g，產(chǎn)率為90%)。

B酸(胡椒酸纈氨酸偶聯(lián)物)的制備(見圖1):具體過程同A酸，最終得到淺黃色固體(0.15 g，產(chǎn)率94%)。

2 結(jié)果與討論

2.1 胡椒酸

胡椒酸(1)的相對(duì)分子質(zhì)量為218.06，質(zhì)譜(ESI-MS，Agilent LC1260-MS6460)檢測(cè)中可見m/z＝217.0(M-1)可見相對(duì)分子質(zhì)量基本符合。測(cè)定胡椒堿和胡椒酸的熔點(diǎn)分別為206℃和198.3℃。

2.2 酰胺(A)和酰胺(B)的結(jié)構(gòu)表征

酰胺(A)的相對(duì)分子質(zhì)量為303.11，質(zhì)譜(ESI＋)得m/z＝304(M＋1)，可見相對(duì)分子質(zhì)量基本符合。酰胺(A)的1H-NMR圖譜(CCl3D)見圖2。

圖2 酰胺(A)的1 H-NMR圖

酰胺(B)的相對(duì)分子質(zhì)量為331.14，質(zhì)譜(ESI＋)得m/z＝332(M＋1)，可見相對(duì)分子質(zhì)量基本符合。酰胺(B)的1H-NMR圖譜(CCl3D)見圖3。

圖3 酰胺(B)的1 H-NMR圖

2.3 胡椒堿的衍生物——A酸和B酸的結(jié)構(gòu)表征

胡椒堿的衍生物——A酸的相對(duì)分子質(zhì)量為289.10，質(zhì)譜(ESI＋)得m/z＝290.0(M＋1)，可見相對(duì)分子質(zhì)量基本符合。A酸的1H-NMR(DMSO-D6)圖譜見圖4。

圖4 A酸的1 H-NMR圖

由圖4可知，12.52為羧基氫，8.37～8.35為酰胺上的氫(N H)，7.28～6.89為雙鍵上與羰基相鄰的的信號(hào)以及苯環(huán)和靠近苯環(huán)的雙鍵上的氫(C2)，6.16～6.12為羰基相鄰的C3氫，6.04為C4氫(O CH2O)，4.30～4.27為 C5(NH—CH—CO)上的氫，1.30～1.28為C6氫(CH3)。

胡椒堿的衍生物——B酸的相對(duì)分子質(zhì)量為317.13，質(zhì)譜(ESI＋)得m/z＝318.1(M＋1)，相對(duì)分子質(zhì)量符合。B酸的1H-NMR圖譜(DMSOD6)見圖5。

圖5 B酸的1 H-NMR圖

由圖5可知，12.56為羧基氫，8.21～8.19為酰胺上的氫(NH)，7.29～6.90為雙鍵上與羰基相鄰的一個(gè)H的信號(hào)以及苯環(huán)和靠近苯環(huán)的雙鍵上的氫(C2)，6.32～6.28為羰基相鄰的，6.05為C4(O CH2O)，4.26～4.23為 C5(NH—CH—CO)上的氫，2.11～2.04為C6上的氫[CH(CH3)2]，0.92～0.89為 C7上的氫 [CH(CH3)2]。

3 結(jié) 論

作者以胡椒堿為原料通過水解、氨基的酰胺化反應(yīng)、水解三步反應(yīng)，合成了A酸和B酸兩種衍生物。

整個(gè)合成過程采用了重結(jié)晶的純化方式，減少了繁瑣的柱層析分離，最后一步水解采用了固相水解的方式，很好的保護(hù)了結(jié)構(gòu)中的酰胺鍵，避免了實(shí)驗(yàn)過程和后處理過程的溶劑的使用，實(shí)現(xiàn)了綠色合成。

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