類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎與IL-1RAP基因多態(tài)性關(guān)聯(lián)的研究

劉曦 胡成棟 李盼 張?jiān)闯?楊清銳

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎與IL-1RAP基因多態(tài)性關(guān)聯(lián)的研究

劉曦 胡成棟 李盼 張?jiān)闯?楊清銳

目的 探索IL-1RAP基因多態(tài)性與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的關(guān)聯(lián)性。方法 選取178例RA患者(RA組)及207例正常對照的全血標(biāo)本，提取DNA、基因分型，對病例組與對照組IL-1RAP rs766442的等位基因頻率、基因型進(jìn)行分析。結(jié)果 IL-1RAP rs766442 基因型包括GG、GT、TT，RA組與正常對照組間三種基因型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.038)、等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018)。結(jié)論 攜帶T等位基因的RA患者出現(xiàn)RF-IgG陽性的幾率可能較高，IL-1RAPrs766442的TT基因型可能為RA的易感基因。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；IL-1RAP基因

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以破壞性關(guān)節(jié)病變及關(guān)節(jié)滑膜炎為主要特征的慢性、侵襲性、進(jìn)行性自身免疫性疾病，可導(dǎo)致非常高的致殘、致畸率，其本質(zhì)為由未知抗原刺激所引起的免疫反應(yīng)[1-3]，導(dǎo)致局部關(guān)節(jié)滑膜組織及血循環(huán)中的免疫細(xì)胞活化，其產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子是導(dǎo)致類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病程進(jìn)展的關(guān)鍵因素?；そM織和滑膜細(xì)胞中浸潤的淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞等通過旁分泌或自分泌的方式產(chǎn)生大量的炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，參與RA的致病過程[4-6]。白細(xì)胞介素1(interleukin-1，IL-1)作為體內(nèi)最強(qiáng)的炎性介質(zhì)之一，其能夠介導(dǎo)多種炎性反應(yīng)，生物學(xué)作用非常廣泛。許多研究己經(jīng)證明IL-1在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病的過程中具有非常重要的作用，它不僅參與滑膜炎癥與血管翳的形成，而且在軟骨與骨的破壞和修復(fù)中起重要作用，有研究表明IL-1基因多態(tài)性在決定RA的預(yù)后上起重要作用[7-9]。IL-1需要與受體結(jié)合后才能啟動(dòng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)揮生物學(xué)功能，IL-1RAP不能單獨(dú)與IL-1相結(jié)合，但可使IL-1RⅠ與IL-1的親和能力增加，在IL-1與IL-1R的結(jié)合中扮演著重要角色。引起RA的病因非常多，一般認(rèn)為由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用所誘發(fā)。因個(gè)體對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎易感性程度不同，使得個(gè)體在微生物及其抗原等的誘導(dǎo)下產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨、滑膜等組織損傷，所以遺傳因素在疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著非常重要的作用，幾乎決定了人體對于疾病發(fā)生的嚴(yán)重程度和疾病的易感程度。有相關(guān)研究通過對家系的調(diào)查發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的遺傳因素高達(dá)60%[10]，異卵雙生子共同患類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的幾率約為13%，單卵雙生子同患類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的幾率約為27%，均比普通人群高。雖然類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎非遺傳性疾病，但是等位基因之間的差異有可能導(dǎo)致個(gè)體對疾病的免疫應(yīng)答能力或易感性高低有別，在病原體及其他誘發(fā)因素的作用下患RA的幾率可能會有所不同[11]。本文探討IL-1RAP基因多態(tài)性與RA的關(guān)聯(lián)性，進(jìn)一步印證RA發(fā)病機(jī)制與遺傳學(xué)的密切關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病例組178例RA患者均來自中國北方漢族人群，來自河北省邯鄲市中心醫(yī)院，其中男42例，女136例;年齡18～64歲，平均年齡(41.2±2.7)歲。所有患者符合1987年ACR類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除DM/PM、SLE、甲狀腺疾病、糖尿病等自身免疫性疾病。檢測患者RF-IgA、RF-IgG、RF-IgM、抗CCP抗體、RA33、GPI抗體。正常對照組207例均為邯鄲市中心醫(yī)院體檢中心健康中國北方漢族人，男54例，女153例；年齡23～65歲，平均年齡(41.2±2.9)歲。無自身免疫病、腫瘤、傳染病等疾病，性別、年齡均與RA組匹配。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本收集:收集類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者空腹靜脈血2 ml置于抗凝采血管中，儲存于-80℃冰箱待檢。

1.2.2 提取DNA及DNA純度測定:將提取的DNA采用比色法測定其純度，OD260/OD280均在1.6～2.0，表明所提取的DNA中含蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)較少，純度較高。

1.2.3 SYBR Green I染料法Real-time PCR熔解曲線法基因分型:建立反應(yīng)體系，按所需反應(yīng)的樣本例數(shù)在EP管中加入相應(yīng)體積的SYBR GreenⅠ、Taq酶、10×PCR Buffer、dNTP Mix、dH2O、MgCl2、DMSO，短暫混勻、離心，再用移液器按反應(yīng)體系分別加入PCR反應(yīng)板各孔底部，依次加入三條引物、模板DNA后迅速密閉封口膜，上述操作均在冰上進(jìn)行。將PCR反應(yīng)板放入離心機(jī)短暫離心，3 000 rPm，離心1 min使混合液集中于底部。應(yīng)用羅氏LightCycler480分析儀進(jìn)行基因分型。見表1。

表1 引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算基因型、等位基因?qū)膊〉南鄬ξｋU(xiǎn)度(odds ratio,OR)及95%可信區(qū)間(95% confidence intervals,CI) (SPSS Inc,Chicago,USA)。Hardy-Weinberg平衡(HWE)檢驗(yàn)采用χ2分析，分析等位基因及基因型頻率用卡方分析或 Fisher 精確概率分析(樣本數(shù)據(jù)少于5時(shí))及多重檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因型頻率及等位基因頻率在RA及正常人的分布 查閱NCBI網(wǎng)站，中國北京漢族人群IL-1RAP的SNP位點(diǎn)rs766442包括GG、GT、TT三種基因型，G/T等位基因頻率比例為0.098/0.902，本實(shí)驗(yàn)178例RA患者中，GG基因型為0例，GT基因型為33例，TT基因型為145例，等位基因頻率比例G/T為 0.093/0.907。207例正常對照組人群中，GG基因型為4例，GT基因型為56例，TT基因型為147例，等位基因頻率比例G/T為0.152/0.848。2組間三種基因型頻率(P=0.038)、等位基因頻率(P=0.018)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 IL-1RAP rs766442基因型和等位基因頻率分布 例(%)

2.2G/T多態(tài)性與RF-IgA的關(guān)聯(lián) 178例RA患者中RF-IgA陽性的為113例，RF-IgA陰性者為65例。其中RF-IgA陽性RA患者GT基因型為21例，TT基因型為92例，等位基因頻率比例G/T為0.092/0.908。65例RF-IgA陰性RA患者GT基因型為12例，TT基因型為53例，等位基因頻率比例G/T為0.093/0.907。2組間三種基因型頻率(P=0.975)、等位基因頻率(P=0.976)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 IL-1RAP rs766442G/T多態(tài)性與RF-IgA的關(guān)聯(lián) 例(%)

2.3 G/T多態(tài)性與RF-IgG的關(guān)聯(lián) 162例RA患者中RF-IgG陽性的為138例，RF-IgG陰性者為40例。其中RF-IgG陽性RA患者GT基因型為21例，TT基因型為117例，等位基因頻率比例G/T為0.076/0.924。37例RF-IgG陰性RA患者GT基因型為12例，TT基因型為28例，等位基因頻率比例G/T為0.149/0.851。2組間三種基因型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.046)，等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0588)。見表4。

表4 IL-1RAP rs766442G/T多態(tài)性與RF-IgG的關(guān)聯(lián) 例(%)

2.4G/T多態(tài)性與RF-IgM的關(guān)聯(lián) 162例RA患者中RF-IgM陽性的為158例，RF-IgM陰性者為20例。其中RF-IgM陽性RA患者GT基因型為30例，TT基因型為128例，等位基因頻率比例G/T為0.094/0.906。20例RF-IgM陰性RA患者GT基因型為3例，TT基因型為17例，等位基因頻率比例G/T為0.083/0.917。2組間三種基因型頻率(P=0.830)、等位基因頻率(P=0.839)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表5。

表5 IL-1RAP rs766442G/T多態(tài)性與RF-IgM的關(guān)聯(lián) 例(%)

3 討論

3.1IL-1RAP在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中的作用IL-1在參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答過程中，其作為炎性反應(yīng)中一種重要的炎性細(xì)胞因子,需要與受體結(jié)合后才能啟動(dòng)信號傳導(dǎo)，發(fā)揮其生物學(xué)功能[12-16]。IL-1受體家族包括3型:IL-1RⅠ、IL-1RⅡ和IL-1RAP，均屬于免疫球蛋白超家族。IL-1RAP分子量為66kD，是一種擁有570個(gè)氨基酸的糖蛋白，含有20個(gè)氨基酸的信號肽，29個(gè)氨基酸的跨膜區(qū)，340個(gè)氨基酸的胞外區(qū)和181個(gè)氨基酸的胞漿區(qū)，基因位置為3q28[17-20]。在IL-1受體家族中，IL-1RⅠ是IL-1的功能性受體，IL-1與之結(jié)合后可產(chǎn)生生物學(xué)作用,而IL-1RⅡ?yàn)镮L-1的偽受體,與IL-1 結(jié)合后不能轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，從而不能產(chǎn)生物學(xué)效應(yīng)。IL-1RAP不能夠單獨(dú)與IL-1相結(jié)合，但它在IL-1與IL-1R的結(jié)合中扮演著重要角色：一方面，同時(shí)表達(dá)IL-1RⅠ和IL-1RAP的細(xì)胞株與IL-1的親和能力高于單表達(dá)IL-1RI的細(xì)胞株與IL-1的親和能力，另一方面，有了IL-1RAP參與，IL-1RⅡ和IL-1的親和力增加超過20倍[21-23]。除此以外，IL-1RAP在IL-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用：實(shí)際上IL-1RI相關(guān)激酶(IRAK)是通過與IL-1RI復(fù)合物中的IL-1RAP相互結(jié)合后發(fā)生磷酸化，磷酸化后的IRAK與TRAF6 結(jié)合, 形成一種復(fù)合物，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活和核易位，然后產(chǎn)生一系列炎性級聯(lián)反應(yīng)。因此，IL-1RAP在TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中及炎性因子IL-1的生物學(xué)功能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，可能直接或間接參與了RA的進(jìn)展與轉(zhuǎn)歸過程。

3.2IL-1RAP基因多態(tài)性與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)聯(lián) 隨著對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)遺傳學(xué)研究的深入，已證實(shí)其 與人類白細(xì)胞抗原(humanleukocyteantigen，HLA)有相關(guān)性，HLA-Ⅱ基因具有高度的多態(tài)性，它是參與機(jī)體免疫應(yīng)答和特異性識別的關(guān)鍵成分，DR、DP和DQ三類基因均與RA的發(fā)病相關(guān)。隨著人們對基因研究技術(shù)的不斷進(jìn)展，已有更多學(xué)者將研究方向轉(zhuǎn)向了非MHC基因。SNPs是在基因組水平上由單個(gè)核苷酸變異所導(dǎo)致的DNA序列的多態(tài)性，其中包括了單個(gè)堿基的插入、顛換、轉(zhuǎn)換或缺失。外顯子區(qū)域中的基因突變可影響蛋白質(zhì)的表達(dá)，啟動(dòng)子區(qū)域中的基因突變可直接影響核基因的表達(dá)水平，內(nèi)含子區(qū)域中基因的突變則可影響剪接的結(jié)果。

IL-1RAPrs766442位點(diǎn)包括GG、GT、TT三種基因型，本實(shí)驗(yàn)中RA患者未檢測出GG基因型，RA組和正常對照組之間等位基因頻率(P=0.018)、基因型頻率(P=0.038)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RF-IgG陽性的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者TT基因型比例(84.8%)高于RF-IgG陰性的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者(70.3%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此 ，IL-1RAPrs766442TT基因型可能為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的易感基因，攜帶T等位基因的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者RF-IgG陽性概率可能較高，這有待于擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制相關(guān)的候選基因的遺傳變異進(jìn)行研究，可能對患者的疾病進(jìn)展及預(yù)后作出評估和指導(dǎo)臨床治療，還可能發(fā)現(xiàn)治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的有效靶點(diǎn)，因此對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的遺傳學(xué)進(jìn)行研究，使得類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎臨床診療有重要的指導(dǎo)意義。

1Littlewood-EvansA,SarretS,ApfelV,etal.GPR91sensesextracellularsuccinatereleasedfrominflammatorymacrophagesandexacerbatesrheumatoidarthritis.ArthritisResTher,2016,213:1655-1662.

2GasteigerG,D’OsualdoA,SchubertDA,etal.Cellularinnateimmunity:anoldgamewithnewplayers.JInnateImmun,2016,23:478-479.

3BurmesterGR,ChoyE,KivitzA,etal.Lowimmunogenicityoftocilizumabinpatientswithrheumatoidarthritis.AnnRheumDis,2016,22:512-514.

4GangosoL,Gutiérrez-LópezR,Martínez-delaPuenteJ,etal.Geneticcolourpolymorphismisassociatedwithavianmalarialinfections.BiolLett,2016,12:342-345.

5RahimiH,DieudonneG,KheyfitsV,etal.Relationshipbetweenlymphnodevolumeandpainfollowingcertolizumabtherapyfortheumatoidarthritisflare:apilotstudy.ClinMedInsightsArthritisMusculoskeletDisord,2016,9:203-208.

6IzmailovaOV,ShlykovaOA,BobrovaNO,etal.RelationshipbetweentheTLR2andTLR4genepolymorphismswithapredispositiontocertainurogenitalinfections.CytologyandGenetics,2011,45:225-230.

7CohenS,DadiH,ShaoulE,etal.CloningandcharacterizationofaLymphoid-specific,induciblehumanproteintyrosinephosphatase.LypBlood,1999,93:2013-2024.

8ShakhbazauAV,KosmachevaSM,KartelNA,etal.Genetherapybasedonhumanmesenchymalstemcells:strategiesandmethods.CytologyandGenetics,2010,44:61-65.

9SheremetYA,YemetsAI,AzmiA,etal.EffectsoftyrosinekinaseandphosphataseinhibitorsonmitosisprogressioninsynchronizedtobaccoBY-2cells.CytologyandGenetics,2012,46:263-271.

10SuzukiA,YamadaR,ChangX,etal.FunctionalhaplotypesofPADI4,encodingcitrullinatingenzymepeptidylargininedeiminase4,areassociatedwithrheumatoidarthritis.NatGenet,2003,34:395-420.

11MańczakM,Rutkowska-SakL,RaciborskiF.Health-relatedqualityoflifeinchildrenwithjuvenileidiopathicarthritis-child'sandparent'spointofview.Reumatologia,2016,54:243-250.

12HahnM,FreyS,HueberAJ.Thenovelinterleukin-1cytokinefamilymembersininflammatorydiseases.CurrOpinRheumatol,2016,6:278-281.

13PasiS,KantR,SuroliaA.Toll/Interleukin-1ReceptorDomainDerivedfromTcpC(TIR-TcpC)AmelioratesExperimentalAutoimmuneArthritisbyDown-modulatingTh17CellResponse.JBiolChem,2016,291:12358-12369.

14LeeYH,BaeSC.Associationsbetweeninterleukin-1andIL-1receptorantagonistpolymorphismsandsusceptibilitytorheumatoidarthritis:ameta-analysis.CellMolBiol(Noisy-le-grand),2015,61:105-110.

15BalaSV,SamuelsonK,HagellP,etal.Livingwithpersistentrheumatoidarthritis.JClinNurs,2016,21:472-475.

16ArnettFC,EdworthySM,BlochDA.Theamericanrheumatismassociation1987revisedcriteriafortheclassificationofrheumatoidarthritis.ArthritisRheum,1988,31:315-324.

17AudreyCP,JuliaKP,GlenC.Singlenucleotidepolymorphismgenotypingusingalele-specificPCRandfluorescencemeltingcurves.BioTechniques,2003,34:1068-1072.

18WangJ,ChuangK,AhluwaliaW,etal.High-throughputSNPgenotypingbysingle-tubePCRwithTm-shiftprimers.BioTechniques,2005,39:885-893.

19GabrielSB,SchaffnerSF,NguyenH,etal.Thestructureofhaplotypeblocksinthehumangenome.Science,2002,296:2225-2229.

20BarrettJC,FryB,MallerJ,etal.Haploview:analysisandvisualizationofLDandhaplotypemaps.Bioinformatics,2005,21:263-265.

21KutsokonNK.MaintrendsinthegenetictransformationofPopulusspecies.CytologyandGenetics,2011,45:352-361.

22OkanoT,InuiK,TadaM,etal.Levelsofinterleukin-1betacanpredictresponsetotocilizumabtherapyinrheumatoidarthritis:thePETITE(predictorsofeffectivenessoftocilizumabtherapy)study.RheumatolInt,2016,36:349-357.

23AlshevskayaAA,LopatnikovaJA,ShkarubaNS,etal.DifferencesofIL-1βreceptorsexpressionbyimmunocompetentcellssubsetsinrheumatoidarthritis.MediatorsInflamm,2015:948393.

Correlation between rheumatoid arthritis and IL-1 RAP gene polymorphism

LIUXi*,HUChengdong,LIPan,etal.

*DepartmentofImmunity,CentralHospitalofHandanCiity,Hebei,Handan056001,China

Objective To investigate the correlation between rheumatoid arthritis (RA) and IL-1 RAP gene polymorphism.Methods One hundred and seventy-eight patients with RA (case group) and 207 healthy subjects (control group) were enrolled in the study.The whole blood specimens of all the subjects were taken,then DNA was extracted for genotyping.The allele frequency of IL-1RAP rs766442 and genotypes were detected and statistically analyzed.Results There were significant differences in the IL-1 RAP rs766442 genotype frequency including GG, GT, TT between two groups (P<0.05),moreover,therewasasignificantdifferenceinallelefrequencybetweentwogroups(P<0.05).Conclusion The RA patients with T allelic gene have higher probability to present positive RF-IgG, and the TT genotype of IL-1RAP rs766442 may be the predisposing gene of RA.

rheumatoid arthritis; IL-1RAP gene

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.05.014 ·論著·

056001 河北省邯鄲市中心醫(yī)院免疫科(劉曦)，骨二科(胡成棟、李盼)；山東省立醫(yī)院風(fēng)濕免疫科(張?jiān)闯?、楊清銳)

R

A

1002-7386(2017)05-0694-04

2016-09-11)